劉寶龍,姜燕燕,2,曹 東,常硯梓,李 云

(1.中國科學(xué)院西北高原生物研究所/青海省作物分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青海西寧 810000; 2.青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院,青海西寧 810000)

啟動子是決定基因時(shí)空特異性表達(dá)的重要因素之一,分為組成型、組織特異性和誘導(dǎo)型三種類型[1]。目前報(bào)道的一些組成型啟動子,例如煙草花葉病毒35S(CaMV35S)和玉米Ubiquitin啟動子,被廣泛應(yīng)用于植物基因工程領(lǐng)域[2-3],但不能滿足特定基因在特定組織表達(dá)的需求。胚乳特異性啟動子具有明顯的組織和發(fā)育階段特異性,可使外源基因在轉(zhuǎn)基因植物種子胚乳中高效、特異表達(dá),避免了非特異表達(dá)對植物造成的不利影響[4]。目前在水稻(OryzasativaL.)[5-6]、小麥(TriticumaestivumL.)[7-8]、玉米(ZeamaysL.)[9]和大麥(HordeumvulgareL.)[10]中已發(fā)現(xiàn)多種胚乳特異性表達(dá)啟動子,但其中的大多數(shù)啟動子由于表達(dá)特性不穩(wěn)定等導(dǎo)致其應(yīng)用受到限制[11-12]。在同一個(gè)植物中頻繁使用同一種啟動子驅(qū)動多個(gè)不同基因表達(dá)容易造成基因沉默現(xiàn)象[13-14]。為探明胚乳特異性基因的調(diào)控機(jī)理,需克隆更多的胚乳特異性表達(dá)啟動子[15-16]。大麥醇溶蛋白是一種大麥胚乳特有的貯藏蛋白,占胚乳總蛋白的50%～60%[17],其基因啟動子HorD具有胚乳特異性表達(dá)特性。

轉(zhuǎn)基因植物作為生物反應(yīng)器,具有完整的真核表達(dá)系統(tǒng),可為多種外源蛋白提供正確的翻譯后修飾,表達(dá)具有生物活性的外源蛋白,可應(yīng)用于人或動物的疾病治療及預(yù)防。相較于葉片、莖等表達(dá)系統(tǒng),種子生物反應(yīng)器具有產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本低、儲藏能力強(qiáng)、安全性高、遠(yuǎn)離動物攜帶的病菌等優(yōu)點(diǎn)[18-19]。新型冠狀病毒(SARA-CoV-2)刺突蛋白是開發(fā)重組疫苗的最佳候選蛋白,利用大麥種子生物反應(yīng)器生產(chǎn)SARA-CoV-2抗原蛋白,實(shí)現(xiàn)抗原蛋白在種子中的大量積累,是抗擊新型冠狀病毒肺炎疫情的一種新策略。

本研究以大麥品種Golden promise為材料,克隆大麥醇溶蛋白啟動子HorD,將該啟動子和新型冠狀病毒刺突蛋白基因LPS利用雙酶切進(jìn)行連接,構(gòu)建植物表達(dá)載體phorD-LPS,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法獲得大麥轉(zhuǎn)基因株系,并分析HorD啟動子的表達(dá)特性,以期為大麥胚乳特異型啟動子HorD的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試植物材料為春大麥Golden promise(Hordeumvulgaressp.distichum),屬于二棱皮大麥,二倍體,含有53×108個(gè)堿基。培養(yǎng)條件為18 ℃光照16 h,15 ℃黑暗8 h。大腸桿菌DH5α和農(nóng)桿菌EHA105分別購自上海生工生物工程股份有限公司和北京華越洋生物科技有限公司。質(zhì)粒pU1300由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 啟動子的克隆及序列分析

利用CTAB法[20]提取大麥葉片基因組DNA,根據(jù)Golden promise參考基因組(GPv1, INSDC Assembly GCA_902500625.1)中D-hordein基因(EF417989)的5’端序列,用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)HorD啟動子的特異性引物,在正向引物Hord-F中加上PstI酶切位點(diǎn),在反向引物Hord-R中加上BamHI酶切位點(diǎn)(表1),采用常規(guī)PCR方法擴(kuò)增大麥HorD的啟動子序列,PCR反應(yīng)體系為50 μL,包括2 × San Taq PCR Mix 25 μL,引物Hord-F/R (10 μmol · L-1)各1 μL,基因組DNA 1 μL,ddH2O 補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,32個(gè)循環(huán);72 ℃再延伸10 min,4 ℃保溫。利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根,北京)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收。利用PlantCare在線網(wǎng)站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預(yù)測啟動子含有的順式作用元件。

1.3 phorD-LPS植物表達(dá)載體的構(gòu)建

以pU1300載體為骨架,用HorD替換Ubi啟動子,構(gòu)建pU1300-phorD載體,具體步驟:將pU1300載體和HorD啟動子片段分別用限制性內(nèi)切酶PstI和BamHI進(jìn)行雙酶切,酶切總反應(yīng)體系為50 μL,包括10×Fast Digest Green buffer 5 μL,DNA 20 μL,PstI和BamHI各2.5 μL,ddH2O補(bǔ)足至50 μL。混勻后在PCR儀中37 ℃酶切30 min。凝膠電泳后的pU1300骨架和HorD啟動子片段分別進(jìn)行膠回收,利用T4連接酶將二者連接,連接體系為10 μL,包括Liner vector DNA 1 μL,Insert DNA 3 μL,10×T4DNA Ligase Buffer 1 μL,T4DNA Ligase 0.5 μL,ddH2O補(bǔ)足至10 μL。通過熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中,挑取陽性克隆并測序,獲得pU1300-phorD載體。最后用限制性內(nèi)切酶BamHI和SacI將新型冠狀病毒刺突蛋白基因LPS(3 918 bp)片段(由金斯瑞生物科技股份有限公司合成)連接至載體pU1300-phorD,獲得PhorD-LPS表達(dá)載體(方法同上),然后再進(jìn)行雙酶切鑒定,將正確的質(zhì)粒送交測序。

1.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大麥遺傳轉(zhuǎn)化

將大麥幼胚用70%的酒精表面消毒30 s,用滅菌水洗滌數(shù)次后,再用10%的次氯酸鈉浸泡4 min,用滅菌水洗滌數(shù)次,然后用無菌濾紙擦干表面水分。將消毒過的大麥幼胚放入OD600=0.6的農(nóng)桿菌菌液中,振蕩培養(yǎng)20 min,倒掉菌液,將愈傷組織轉(zhuǎn)移到無菌濾紙上,吸干表面殘留的菌液,轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基中,置于24 ℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)3 d,再轉(zhuǎn)至含50 mg·L-1HYG(潮霉素)的抑菌篩選培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),每隔14 d繼代一次,將生長狀態(tài)良好且致密的愈傷組織轉(zhuǎn)移到含30 mg·L-1HYG的分化培養(yǎng)基上,24 ℃光照培養(yǎng)。待分化出綠芽后,轉(zhuǎn)移至含30 mg·L-1HYG的再生篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。每隔14 d繼代一次,待綠苗長至2～3 cm,轉(zhuǎn)移至含30 mg·L-1HYG的生根培養(yǎng)基中,待再生苗根系足夠發(fā)達(dá)以及葉片健壯時(shí),進(jìn)行煉苗,一般為6～7 d,待煉苗完成后移栽至土壤中。移栽前需用自來水將殘留的培養(yǎng)基沖洗干凈。

1.5 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測及LPS基因的表達(dá)模式分析

以植物表達(dá)載體phorD-LPS上的LPS為目標(biāo)基因,用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物L(fēng)PS-F/R,以T0代抗性植株的葉片DNA為模板,以phorD-LPS載體為陽性對照,以野生型大麥葉片DNA為陰性對照,進(jìn)行PCR檢測。PCR反應(yīng)體系為50 μL,包括2×San Taq PCR Mix 25 μL,引物L(fēng)PS-F/R(10 μmol·L-1)各1 μL,基因組DNA 1μL,dd H2O 補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)程序:94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s;55 ℃ 15 s;72 ℃ 1 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min, 4 ℃保溫。

用FastPure Plant Total RNA Isolation Kit(諾唯贊,南京)分別提取轉(zhuǎn)基因大麥的根、莖、葉、內(nèi)麩、外麩及種子總RNA。用PrimeSricptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara, 北京)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以LPS-F/R為引物(表1),以大麥ARF1為內(nèi)參基因。使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(諾唯贊,南京)進(jìn)行qRT-PCR。PCR反應(yīng)體系參照試劑盒說明書,PCR反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 s,52 ℃退火34 s,72 ℃延伸20 s,40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。采用2-ΔΔCT法計(jì)算基因的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 大麥啟動子HorD的克隆及植物表達(dá)載體phorD-LPS的構(gòu)建結(jié)果

以大麥基因組DNA為模板,利用特異性引物Hord-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到大麥HorD啟動子片段(圖1A),回收目的片段后進(jìn)行測序,得知啟動子HorD的全長為450 bp。用限制性內(nèi)切酶BamHI和SacI將新型冠狀病毒刺突蛋白基因LPS片段連接至載體pU1300-phorD,獲得PhorD-LPS表達(dá)載體,經(jīng)PCR驗(yàn)證和測序,發(fā)現(xiàn)所得片段(4 368 bp)與預(yù)期結(jié)果一致(圖1B和1C),表明構(gòu)建的載體phorD-LPS正確,可用于后續(xù)分析。

A:大麥HorD啟動子的克隆結(jié)果;B:phorD-LPS載體的構(gòu)建結(jié)果;C: phorD-LPS載體示意圖。A圖和B圖中,M:DL5000;1和2為兩個(gè)重復(fù)。A: Cloning result of HorD promoter in barley; B: Construction results of phorD-LPS vector; C: Schematic diagram of phorD-LPS vector. In figures A and B, M: DL5000; 1 and 2 were two repelicates.圖1 大麥HorD啟動子的克隆及phorD-LPS表達(dá)載體的構(gòu)建結(jié)果Fig.1 Cloning result of HorD promoter in barley and construction result of phorD-LPS expression vector

2.2 HorD啟動子區(qū)域含有的順式作用元件

PlantCare在線網(wǎng)站分析結(jié)果(表2)表明,HorD啟動子除含有必需的基本順式作用元件(A-box、TATA-box和CAAT-box)外,還包含一個(gè)胚乳特異性表達(dá)元件Prolamin-box。

表2 HorD啟動子含有的順式作用元件Table 2 Cis-acting elements of HorD promoter

2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大麥遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株檢測

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法將LPS啟動子轉(zhuǎn)入大麥基因組中(圖2A)。以大麥轉(zhuǎn)基因植株葉片基因組DNA為模板,以LPS-F/R為引物對轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行PCR檢測,結(jié)果(圖2B)表明,在所檢測樣品中,有6株能夠擴(kuò)增出與目的片段大小相同的條帶,表明這6株再生苗為陽性植株。

A:大麥的遺傳轉(zhuǎn)化; a:共培養(yǎng);b:篩選培養(yǎng);c:繼代培養(yǎng);d:分化培養(yǎng);e:生根培養(yǎng);f:移栽。B:轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測結(jié)果;M:DL5000;1～6:陽性植株;H2O:陰性對照;P:陽性對照。A: Genetic transformation of barley, a: Co-culture; b: Screening culture; c: Subculture; d: Differentiation culture; e: Rooting culture; f: Transplanting. B: PCR result of transgenic plants, M: DL5000; 1-6: Negative control; P: Positive control.圖2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大麥遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測結(jié)果Fig.2 Agrobacterium-mediated genetic transformation of barley and PCR results of the transgenic plants

2.4 LPS基因在轉(zhuǎn)基因大麥不同組織中的表達(dá)量

從圖3可以看出,LPS基因在大麥不同組織中均有表達(dá),但表達(dá)量存在差異。以根中LPS基因的表達(dá)量為參照(相對表達(dá)量為1),種子中LPS基因的表達(dá)量最高,為9.29,與根中LPS基因的表達(dá)量在0.0001水平上達(dá)到顯著水平;葉片和內(nèi)麩中LPS基因的表達(dá)量次之,與根中LPS基因的表達(dá)量分別在0.001和0.01水平上達(dá)到顯著水平;而葉和外麩中LPS基因的表達(dá)量與根中LPS基因的表達(dá)量無顯著差異。

**、***和****分別表示與根中LPS的表達(dá)量在0.01、0.001和0.0001水平差異顯著。**、*** and **** indicate significant difference compared with the expression level of LPS gene in root at 0.01、0.001 and 0.0001 levels, respectively.圖3 大麥不同組織中LPS基因的相對表達(dá)量Fig.3 Relative expression level of LPS gene in different tissues of barley

3 討論

外源基因在植物體內(nèi)的表達(dá)受拷貝數(shù)、插入位置、啟動子類型等諸多因素的影響,但很大程度上依賴于驅(qū)動外源基因表達(dá)的啟動子[21]。關(guān)于啟動子的研究有很多,比如liu等[22]利用水稻GluB-1啟動子驅(qū)動大豆鐵蛋白基因在水稻種子中表達(dá);Murase等[23]利用水稻oleosin啟動子驅(qū)動外源亞油酸異構(gòu)酶基因在水稻種子中特異表達(dá);Kuwano等[24]利用水稻Ole18啟動子驅(qū)動RIN01基因在種子中特異表達(dá)。本研究則是利用大麥HorD啟動子驅(qū)動新型冠狀病毒刺突蛋白基因LPS在大麥中表達(dá),分析HorD啟動子的表達(dá)特性。

利用分子生物學(xué)技術(shù),HorD啟動子已在大麥中實(shí)現(xiàn)了瞬時(shí)表達(dá)[25-27],在煙草中也獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)化[28]。本研究通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化,分析大麥HorD啟動子的功能。相較于瞬時(shí)轉(zhuǎn)化,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化法來分析HorD啟動子的功能,更能準(zhǔn)確反映HorD啟動子的表達(dá)模式[26,29]。研究表明,HorD啟動子不僅可以在大麥籽粒胚乳中特異表達(dá)[30-31],還可調(diào)控GFP在根中表達(dá)[32]。在大麥胚乳細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)分析結(jié)果顯示,HorD啟動子的活性是HorB啟動子的3～5倍[27]。也有研究表明,HorD啟動子驅(qū)動的GUS僅在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植株的胚乳組織中表達(dá),而在其他組織中不表達(dá)[27,33]。

本研究克隆的HorD啟動子序列全長為450 bp,而S?rensen等[27]克隆的HorD啟動子序列全長僅433 bp,且包含胚乳特異表達(dá)所需的所有順式作用元件,除含有核心順式作用元件CAAT-box和TATA-box外,還含有胚乳特異性表達(dá)的特有元件Prolamin-box。為驗(yàn)證HorD啟動子的功能,本研究構(gòu)建了植物表達(dá)載體phorD-LPS,并轉(zhuǎn)化至大麥幼胚,通過潮霉素抗性篩選及LPS基因的PCR鑒定,獲得陽性植株。qRT-PCR分析表明,HorD啟動子驅(qū)動LPS基因在轉(zhuǎn)基因大麥的根、莖、葉、穎殼和種子中均有表達(dá),其中在種子中表達(dá)量最高,而在其他組織中表達(dá)量相對較低。這表明,HorD啟動子可驅(qū)動外源基因在種子中高效表達(dá),為種子特異性啟動子。

4 結(jié)論

從大麥品種Golden promise中克隆了大麥醇溶蛋白啟動子HorD,長度為450 bp,該啟動子內(nèi)部含有胚乳特異性表達(dá)元件Prolamin-box,可驅(qū)動新型冠狀病毒刺突蛋白基因LPS在大麥種子中高效表達(dá)。本研究結(jié)果為組織特異性表達(dá)啟動子的開發(fā)和應(yīng)用提供了依據(jù)。