陳晨晨,宋丹,宋純東,,郭婷,段風(fēng)陽,王寧麗,張博,楊濛,王耀獻(xiàn)

1.河南中醫(yī)藥大學(xué),河南 鄭州 450046; 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)兒科醫(yī)學(xué)院,河南 鄭州 450000;3.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,河南 鄭州 450000

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病患者中最常見的微血管并發(fā)癥,也是導(dǎo)致終末期腎病(end-stage renal disease,ESRD)的主要原因[1]。DN病理變化復(fù)雜,主要包括腎小球肥大伴進(jìn)行性系膜擴(kuò)張和腎小管間質(zhì)纖維化[2]。DN的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確,目前認(rèn)為是糖代謝異常、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、氧化應(yīng)激、自噬、遺傳易感等多種因素共同作用的結(jié)果[3-5]。研究發(fā)現(xiàn),炎癥信號通路核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋白2(nucleotide-binding oligomerization domain 2,NOD2)/核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factor-κB,NF-κB)通路異?？蓪?dǎo)致腎組織受損,在DN的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[6-7]。臨床上對DN的治療主要是控制飲食,降低血壓、血糖、血脂及抗感染,抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)等[8]。雷公藤多苷(tripterygium wilfordii polyglycoside,TWP)是衛(wèi)矛科植物雷公藤的主要活性成分,具有抗炎、免疫抑制等作用,臨床上雷公藤多苷被廣泛應(yīng)用于DN的治療[9]。本研究基于NOD2/NF-κB通路研究雷公藤多苷對糖尿病腎病大鼠的影響,以期進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動物42只SPF級雄性SD大鼠,體質(zhì)量(190±10 g),購自鄭州市惠濟(jì)區(qū)華興實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖場,許可證號:SCXK(豫)2019-0002,飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室動物房,動物實(shí)驗(yàn)環(huán)境:SPF級屏障(IVC)環(huán)境,相對濕度(50±10)%,25 ℃恒溫,12 h/12 h晝夜明暗交替。本實(shí)驗(yàn)由河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理審查委員會批準(zhǔn),動物實(shí)驗(yàn)倫理審查批準(zhǔn)編號:YFYDW2021013。

1.2 藥物與試劑雷公藤多苷片(江蘇美通制藥有限公司,國藥準(zhǔn)字:Z32021007,規(guī)格:10 mg);纈沙坦(代文)膠囊(北京諾華制藥公司,國藥準(zhǔn)字:H20040217,規(guī)格:80 mg);鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ,美國Sigma公司,貨號:S1030)。檸檬酸鈉緩沖液(北京索萊寶科技有限公司,貨號:C1013);NOD2抗體、NF-κB抗體、HRP-山羊抗小鼠二抗、HRP-山羊抗兔二抗、β-actin抗體、RIPA裂解液、RNA提取液(武漢賽維爾生物科技有限公司,貨號:GB31488、GB11997、GB25301、GB23303、GB15001、G2002、G3013);大鼠NOD2、NF-κB ELISA試劑盒(江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司,貨號:MM-0799R2、MM-0699R2);三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,貨號:10006818、80109218、10009218);PCR引物由武漢賽維爾生物科技有限公司合成。

1.3 儀器AU5800型全自動生化分析儀(美國Beckman公司);DESK/MIDI/250/1000型全景切片掃描儀(匈牙利3DHISTECH公司);CFX型熒光定量PCR儀(美國Bio-rad公司);D3024R型臺式高速冷凍型微量離心機(jī)[大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)有限公司,最大轉(zhuǎn)速15 000 r·min-1,步長:10 r·min-1];NanoDrop2000型超微量分光光度計(jì)(美國Thermo Fisher Scientific公司);RT-6100型酶標(biāo)檢測儀(深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司);Neofuge 23R型冷凍離心機(jī)(力康生物醫(yī)療科技股份有限公司);ADW-1002-M型純水儀(重慶艾科浦公司);DS-2S100型脫色搖床(武漢賽維爾生物科技有限公司);SVE-2型電泳儀(北京六一儀器廠)。

2 方法

2.1 動物分組、造模及給藥42只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,隨機(jī)選出8只作為空白組,給予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng);其余大鼠作為造模組,采用高脂高糖飼料喂養(yǎng),并給予1% STZ(55 mg·kg-1)溶液一次性腹腔注射造模,造模3 d后連續(xù)監(jiān)測血糖,當(dāng)大鼠血糖≥16.7 mmol·L-1為糖尿病造模成功,繼續(xù)高脂高糖飼料喂養(yǎng),2周后測得大鼠尿蛋白呈陽性,為DN模型建立成功。24只造模成功大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、纈沙坦組和雷公藤多苷組,每組8只。纈沙坦組和雷公藤多苷組大鼠分別給予纈沙坦(代文)膠囊(8.33 mg·kg-1·d-1)及雷公藤多苷片(5 mg·kg-1·d-1)溶液灌胃,空白組和模型組大鼠灌服等體積生理鹽水,灌胃體積為10 mL·kg-1,每日1次,連續(xù)給藥6周。

2.2 24 h尿蛋白定量檢測灌胃結(jié)束后,禁食不禁水24 h,代謝籠收集大鼠24 h 尿液,離心后留取上清液檢測24 h尿蛋白定量(24 hour urinary protein,24hUTP)。

2.3 全自動生化分析儀測定血糖(blood glucose,GLU)、血清肌酐(serum creatinine,SCr)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)水平10%水合氯醛腹腔注射麻醉后腹主動脈取血,3 500 r·min-1(離心半徑:10 cm)離心10 min,留取血清,全自動生化分析儀檢測GLU、SCr、BUN水平。

2.4 HE染色觀察大鼠腎臟組織病理變化取血后迅速剝離腎臟,右腎腎門冠狀面切下1 cm×1 cm×1 cm大小樣本置于4%多聚甲醛中。將固定后的腎臟組織進(jìn)行梯度酒精脫水、二甲苯透明,石蠟包埋、冷卻后切片、蘇木精-伊紅染色,光鏡下觀察腎臟組織病理形態(tài)改變。

2.5 ELISA法檢測血清NOD2、NF-κB水平具體操作步驟嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。將血清樣品加于酶標(biāo)板孔底部,除空白孔外,每孔加入酶標(biāo)試劑100 μL,封板膜封板后37 ℃孵育1 h,配液、洗滌,加入顯色劑,37 ℃避光顯色15 min,采用酶標(biāo)儀于450 nm波長處測量各孔的吸光度值。

2.6 Western Blot法檢測腎組織NOD2、NF-κB蛋白表達(dá)水平凍存管中的腎組織以PBS洗滌3次,剪碎后加裂解液勻漿,勻漿后12 000 r·min-1,4 ℃ 離心10 min,收集上清,即為總蛋白溶液,BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度,沸水浴變性 15 min,-20 ℃保存?zhèn)溆?蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳,300 mA恒流轉(zhuǎn)膜30 min,室溫封閉 30 min,加入一抗(稀釋比例為1：1 000)4 ℃搖床孵育過夜,加入二抗(稀釋比例為1：5 000)室溫孵育30 min;壓膠片、顯影、定影,膠片掃描存檔,Photoshop整理去色,Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的光密度值,蛋白相對表達(dá)量為目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值。

2.7 熒光定量PCR法檢測腎組織NOD2、NF-κBmRNA表達(dá)水平總RNA抽提后逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA,PCR擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性15 s、60 ℃退火/延伸30 s(40個循環(huán)),65 ℃→95 ℃ 每升溫0.5 ℃采集一次熒光信號。采用2-△△CT法進(jìn)行計(jì)算分析。引物序列見表1。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠GLU、SCr、BUN、24 hUTP結(jié)果比較與空白組比較,模型組大鼠GLU、SCr、BUN、24 hUTP 水平明顯升高(P<0.05);與模型組比較,給藥組大鼠GLU、SCr、BUN、24 hUTP水平明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠GLU、SCr、BUN、24hUTP結(jié)果比較

3.2 各組大鼠腎臟病理結(jié)果比較光鏡觀察發(fā)現(xiàn),與空白組比較,模型組大鼠腎小球肥大,腎小管上皮細(xì)胞氣球樣變性,胞質(zhì)空泡化,腎血管淤血、擴(kuò)張,基底膜增厚;與模型組比較,兩個治療組大鼠腎臟組織病理改變較輕,腎小球未見明顯病理改變,表現(xiàn)為腎小管輕度增厚、擴(kuò)張。見圖1。

注:A:空白組;B:模型組;C:纈沙坦對照組;D:雷公藤多苷組。圖1 各組大鼠腎臟病理變化(HE染色,×400)

3.3 各組大鼠血清NOD2和NF-κB 水平比較與空白組比較,模型組大鼠血清NOD2、NF-κB水平明顯升高(P<0.05);與模型組比較,給藥組大鼠血清NOD2、NF-κB水平均明顯降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清NOD2和NF-κB水平比較

3.4 各組大鼠腎組織NOD2和NF-κB蛋白表達(dá)水平比較與空白組比較,模型組大鼠腎組織NOD2、NF-κB 蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05);與模型組比較,給藥組大鼠腎組織NOD2、NF-κB蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)。見圖2、表4。

注:A:空白組 B:模型組 C:纈沙坦對照組 D:雷公藤多苷組。圖2 各組大鼠腎組織NOD2、NF-κB蛋白電泳條帶

表4 各組大鼠腎組織NOD2、NF-κB蛋白表達(dá)水平比較

3.5 各組大鼠腎組織NOD2和NF-κBmRNA表達(dá)水平比較與空白組比較,模型組大鼠腎組織NOD2、NF-κBmRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05);與模型組比較,兩治療組大鼠腎組織NOD2、NF-κBmRNA表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠腎組織NOD2、NF-κB mRNA表達(dá)水平比較

4 討論

雷公藤始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,屬衛(wèi)矛科植物,其化學(xué)成分復(fù)雜,主要包括二萜類、三萜類、生物堿類、糖類、倍半萜類等[10]。雷公藤制劑作為免疫抑制劑類藥物,廣泛應(yīng)用于多種原發(fā)及繼發(fā)性腎臟疾病,可有效減少尿蛋白,延緩腎損傷[11-13]。雷公藤多苷是雷公藤的主要活性成分,可通過抗炎、降低氧化應(yīng)激、降低胰島素抵抗、保護(hù)足細(xì)胞、修復(fù)腎小管間質(zhì)損傷等途徑治療DN,且具有多組分、多靶點(diǎn)、多系統(tǒng)的特點(diǎn)[14]。既往研究發(fā)現(xiàn),雷公藤多苷治療DN效果明顯,其機(jī)制可能與下調(diào)DN大鼠腎組織Ras同源基因家族成員A(Ras homolog gene family,member A,RhoA)、Rho相關(guān)的卷曲螺旋激酶1(Rho associated coiled coil-forming kinase 1,ROCK1)有關(guān)[15]。此外多項(xiàng)研究結(jié)果也表明,雷公藤多苷在治療DN上有很好的應(yīng)用價值[16-18]。本研究結(jié)果同樣表明,雷公藤多苷可抑制NOD2/NF-κB通路,改善腎臟功能,發(fā)揮治療作用。

DN在糖尿病患者中的發(fā)病率超過40%,且在我國的發(fā)病率呈逐年上升趨勢,已成為ESRD的主要病因,嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量[19]。DN的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,目前認(rèn)為免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)在其發(fā)病過程中作用重大。天然免疫模式識別受體(pattemrecognition receptors,PRRs)是先天免疫系統(tǒng)中的重要成分,NOD樣受體是其主要的亞家族之一,可影響自身免疫、炎癥疾病的轉(zhuǎn)歸等[20-23]。NOD的亞型NOD2于炎癥細(xì)胞和腎臟中高表達(dá),是DN中連接腎損傷、炎癥和足細(xì)胞胰島素抵抗的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵成分之一[24]。NF-κB蛋白是Rel蛋白家族的核轉(zhuǎn)錄因子,NF-κB通路激活能促進(jìn)多種炎性細(xì)胞因子的表達(dá)[25-26],使腎臟炎癥反應(yīng)進(jìn)一步增強(qiáng),在DN的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[27-28]。王露等[29]通過臨床觀察發(fā)現(xiàn),DN患者血清NF-κB水平明顯升高,且與患者腎功能指標(biāo)均存在相關(guān)性,可能是NF-κB引起的炎癥反應(yīng)加重腎臟負(fù)擔(dān)從而引起一系列腎功能指標(biāo)發(fā)生變化。NOD2與 NF-κB 關(guān)系密切,NOD2能夠誘導(dǎo)NF-κB的激活,并觸發(fā)細(xì)胞信號級聯(lián),促使細(xì)胞因子和趨化因子表達(dá),導(dǎo)致DN患者腎臟細(xì)胞損傷和進(jìn)行性纖維化[30]。研究也證實(shí),調(diào)節(jié)NOD2/NF-κB通路可以改善DN腎臟損傷,因此,抑制NOD2/NF-κB的表達(dá)可能是治療DN的新靶標(biāo)[31]。本研究發(fā)現(xiàn),雷公藤多苷可通過抑制此通路改善DN大鼠腎功能,進(jìn)一步明確了雷公藤多苷對DN的治療作用及作用機(jī)制。

通過對比發(fā)現(xiàn),模型組大鼠腎臟病理損傷嚴(yán)重,表現(xiàn)為腎小球肥大、基底膜增厚、腎小管上皮細(xì)胞及腎血管多處損傷,雷公藤多苷組腎臟病理損害程度較輕,腎小球未見明顯病理改變,表現(xiàn)為腎小管輕度增厚、擴(kuò)張。此外,兩治療組GLU、SCr、BUN及 24 hUTP 水平降低,且雷公藤多苷組降蛋白作用相對優(yōu)于纈沙坦對照組,提示雷公藤多苷可有效降低大鼠血糖及蛋白尿水平,改善腎功能,延緩腎損傷。

綜上所述,雷公藤多苷可通過抑制NOD2/NF-κB通路活性減輕腎損傷,從而發(fā)揮對DN大鼠的治療作用。本研究對臨床應(yīng)用雷公藤多苷治療DN提供了參考,考慮到臨床應(yīng)用雷公藤多苷時存在一定的毒副作用,其臨床應(yīng)用劑量需要通過進(jìn)一步研究確定。