張曉宇，張亞茹，張 瑩，蔣志芳，劉惠敏（保定市第二中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北涿州 072750）

惡性黑色素瘤是一種惡性程度較高、預(yù)后較差的皮膚科腫瘤[1]。由于缺乏對(duì)致癌基因的了解和鑒定，使得惡性黑色素瘤的早期診斷及治療存在局限性。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀核糖核酸（circular RNA，circRNA）在惡性黑色素瘤組織和正常組織中具有顯著性差異表達(dá)，參與惡性黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展，可能為該病的診斷及靶向治療帶來(lái)幫助[2-3]。以往的研究指出，circRNA_0020710及circRNA_0079593在惡性黑色素瘤中存在異常表達(dá)，參與疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，在惡性黑色素瘤的早期發(fā)現(xiàn)及指導(dǎo)治療等方面均具有重要意義[4-5]。由此我們推測(cè)，circRNA_0020710及circRNA_0079593在惡性黑色素瘤中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可能是惡性黑色素瘤的潛在分子標(biāo)志物。然而，關(guān)于circRNA_0020710及circRNA_0079593是否可作為預(yù)測(cè)惡性黑色素瘤發(fā)生及疾病進(jìn)展的生物標(biāo)志物尚未清楚。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)惡性黑色素瘤組織circRNA_0020710及circRNA_0079593的表達(dá)，分析其診斷惡性黑色素瘤及預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的價(jià)值，旨在為該病的診療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 61例皮膚惡性黑色素瘤患者選自2019年1月～2022年3月保定市第二中心醫(yī)院，男性37例，女性24例，年齡35～72（55.62±10.18）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合中國(guó)惡性黑色素瘤規(guī)范化病理診斷專(zhuān)家共識(shí)(2017年版)[6]；②>18歲，行手術(shù)切除術(shù)，有完整臨床資料和結(jié)果。排除標(biāo)準(zhǔn)：①已接受過(guò)其他方法治療；②并發(fā)免疫性疾病、感染性疾病及其他惡性腫瘤者。22例患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，39例患者無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；組織學(xué)分級(jí)，41例Ⅰ～Ⅱ級(jí)，20例Ⅲ～Ⅳ級(jí)；腫瘤部位：36例四肢和軀干（肢端），25例消化道、鼻和泌尿系黏膜（非肢端）；分化程度：34例中高分化，27例低分化。

1.2 儀器和試劑 ABI 7500型熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，PCR試劑盒和Trizol試劑盒（Qiagen公司）；高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司）。

1.3 方法 采集惡性黑色素瘤組織和正常組織（取距病灶>2cm的正常皮膚組織），使用Trizol試劑提取組織總RNA（將組織樣本置于液氮內(nèi)研磨，每50～100mg樣本加Trizol 1ml），置于-80℃保存待檢。circRNA_0020710及circRNA_0079593檢測(cè)：circRNA_0020710引物（上游：5’-AGCACTGC TTGATGCTCGAACTA-3’，下游：5’-TATCGCCTAC GAGTACTACTG-3’），circRNA_0079593引物（上游：5’-AGACTAGCTATCTGATGAGAATA-3’，下游：5’-TACACGGTACAGCTCAATGTG-3’）。以甘油醛3-磷酸脫氫酶為內(nèi)參基因（上游：5’-TCAGCTG ATGCTAGGAGCGTAT-3’，下游：5’-ACGACTGG CACTGTTACGCT-3’），用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)檢測(cè)circRNA。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min（1個(gè)循環(huán)）；95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，40個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct法計(jì)算circRNA表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。應(yīng)用受試者工作特征（ROC）曲線分析circRNA_0020710及circRNA_0079593診斷惡性黑色素瘤及預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的價(jià)值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 惡性黑色素瘤組織中circRNA_0020710及circRNA_0079593表達(dá) 惡性黑色素瘤組織中circRNA_0020710及circRNA_0079593表達(dá)水平均明顯高于正常組織（4.95±2.37 vs 1.84±0.92，2.70±1.15 vs 0.91±0.34），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=18.946，15.248，均P<0.001）。

2.2 circRNA_0020710及circRNA_0079593表達(dá)與惡性黑色素瘤患者的臨床特征 見(jiàn)表1。惡性黑色素瘤患者circRNA_0020710及circRNA_0079593表達(dá)水平升高與組織分級(jí)Ⅲ～Ⅳ級(jí)、腫瘤部位、低分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.001）。

表1 circRNA_0020710及circRNA_0079593表達(dá)水平與惡性黑色素瘤患者臨床特征的關(guān)系（±s）

表1 circRNA_0020710及circRNA_0079593表達(dá)水平與惡性黑色素瘤患者臨床特征的關(guān)系（±s）

類(lèi) 別ncircRNA_0020710t值P值circRNA_0079593t值P值年齡（歲）＜55284.74±2.281.2140.1522.60±1.101.1640.173≥55335.21±2.462.86±1.24性別男375.07±2.411.1360.1772.65±1.080.9840.251女244.82±2.302.78±1.20組織分級(jí)Ⅰ～Ⅱ級(jí)413.87±1.9616.712<0.0012.15±0.9813.328<0.001Ⅲ～Ⅳ級(jí)206.35±3.463.60±1.76腫瘤部位肢端364.61±2.089.620<0.0012.36±1.0411.106<0.001非肢端255.62±2.743.48±1.71分化程度中高分化344.09±1.9415.708<0.0012.40±1.0310.415<0.001低分化276.14±3.183.42±1.68潰瘍有295.30±2.511.6300.0942.92±1.281.4180.106無(wú)324.67±2.242.56±1.05淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有226.80±3.7020.713<0.0014.02±1.8118.635<0.001無(wú)393.26±1.551.64±0.72

2.3 circRNA_0020710及circRNA_0079593對(duì)惡性黑色素瘤的診斷價(jià)值 見(jiàn)表2和圖1。circRNA_0020710及circRNA_ 0079593診斷惡性黑色素瘤的最佳截?cái)嘀禐?.15和1.78，其診斷惡性黑色素瘤的曲線下面積均大于0.800，敏感度分別為84.6%和81.0%，特異度分別為82.4%和77.5%。

圖1 circRNA_0020710及circRNA_0079593診斷惡性黑色素瘤的ROC曲線

表2 circRNA_0020710及circRNA_0079593對(duì)惡性黑色素瘤的診斷價(jià)值

2.4 circRNA_0020710及circRNA_0079593預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的價(jià)值 見(jiàn)表3和圖2。circRNA_0020710及circRNA_0079593預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的最佳截?cái)嘀禐?.83和2.75，其預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的曲線下面積均大于0.835，其敏感度分別為87.4%和84.0%，特異度分別為85.7%和80.8%。

圖2 circRNA_0020710及circRNA_0079593預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ROC曲線

表3 circRNA_0020710及circRNA_0079593預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的價(jià)值（%）

3 討論

惡性黑色素瘤是一種侵襲能力強(qiáng)、惡性程度高，極易發(fā)生淋巴結(jié)及致死率高的皮膚癌，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康[7]。最近有報(bào)道稱(chēng)，一些circRNA在惡性黑色素瘤中有差異表達(dá)，細(xì)胞或組織特異性表達(dá)使其成為合適的候選診斷或治療生物標(biāo)志物[8]。CONG等[8]研究指出，circRNA_0020710作為一種致癌基因，在惡性黑色素瘤中調(diào)控異常，并參與了癌變過(guò)程，對(duì)惡性黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展影響較大。另有研究認(rèn)為，circRNA_0079593參與惡性黑色素瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，可能在惡性黑色素瘤的癌變過(guò)程及治療方面發(fā)揮重大的作用，臨床應(yīng)用前景較好[9]。

本研究顯示，與正常組織比較，惡性黑色素瘤組織circRNA_0020710及circRNA_0079593表達(dá)水平均明顯升高，提示circRNA_0020710及circRNA_0079593在惡性黑色素瘤中呈高表達(dá)，其可能是促進(jìn)惡性黑色素瘤發(fā)生的主要基因之一。KHORSANDI等[10]研究表明，一些circRNA_0025039在惡性黑色素瘤組織中顯著上調(diào)，在惡性黑色素瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和遷移中發(fā)揮關(guān)鍵作用，參與惡性黑色素瘤癌變的進(jìn)展。本研究組織分級(jí)Ⅲ～Ⅳ級(jí)、腫瘤部位非肢端、低分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，circRNA_0020710及circRNA_0079593表達(dá)水平均顯著增加，提示circRNA_0020710及circRNA_0079593表達(dá)水平升高與疾病進(jìn)展有關(guān)，其高表達(dá)可能促進(jìn)惡性黑色素瘤的進(jìn)展過(guò)程。MONTICO等[11]研究發(fā)現(xiàn)，惡性黑色素瘤組織和細(xì)胞中circRNA_0084043顯著上調(diào)，circRNA_0084043的高表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和生長(zhǎng)，在惡性黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

本研究circRNA_0020710及circRNA_0079593單項(xiàng)指標(biāo)對(duì)惡性黑色素瘤診斷及其預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均具有一定價(jià)值，其敏感度和特異度均較好，說(shuō)明circRNA_0020710及circRNA_0079593可作為惡性黑色素瘤的診斷及預(yù)測(cè)淋巴轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物，對(duì)疾病的診斷及預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有很好的幫助。HAO等[12]研究發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，circRNA_0079593在惡性黑色素瘤組織和細(xì)胞系中顯著高表達(dá)，其過(guò)表達(dá)顯著提高了惡性黑色素瘤細(xì)胞的增殖率和侵襲能力，可能是惡性黑色素瘤新的生物標(biāo)志物。另有研究認(rèn)為，circRNA_0079593作為惡性黑色素瘤發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)控因子，參與疾病的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移，可作為惡性黑色素瘤潛在的診斷、治療和預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物[13]。

綜上所述，惡性黑色素瘤組織中circRNA_0020710及circRNA_0079593水平明顯升高，與組織分級(jí)Ⅲ～Ⅳ級(jí)、腫瘤部位、低分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，其對(duì)惡性黑色素瘤診斷及預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均具有很好的價(jià)值，可作為該病診斷及病情判斷的分子標(biāo)志物。但本研究病例來(lái)源較單一，樣本量較少，未來(lái)仍需更多的臨床研究進(jìn)一步證實(shí)。