黃 冰，遲 晨，蔣玉新，洪 沫，曹 冉，崔 麗，曹云峰（.大連博源醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室有限公司質(zhì)量部，遼寧大連 6000；.上海市生物醫(yī)藥技術(shù)研究院國家衛(wèi)生健康委員會(huì)計(jì)劃生育藥具重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 0003）

同型半胱氨酸 (homocysteine，Hcy) 是用于心腦血管等疾病檢測(cè)的常規(guī)項(xiàng)目[1-3]，隨著質(zhì)譜方法的發(fā)展，使用同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（isotope dilution-liquid chromatography/tandem mass spectrometry，ID-LC/MS/MS)檢測(cè)Hcy的實(shí)驗(yàn)室數(shù)量也逐漸增加，各實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果的可比性成為了質(zhì)譜檢測(cè)的主要挑戰(zhàn)。

能力驗(yàn)證 (proficiency testing，PT) 是能力驗(yàn)證組織者 (proficiency testing provider，PTP) 組織的，利用實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)，按照預(yù)先制定的準(zhǔn)則評(píng)價(jià)參加者能力的活動(dòng)。PT對(duì)于發(fā)現(xiàn)檢測(cè)中存在的共性及特殊問題[4-8]、實(shí)現(xiàn)不同實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果互認(rèn)具有重要意義[8-10]?；谏鲜霰尘埃締挝婚_展基于IDLC/MS/MS的“人血清中同型半胱氨酸測(cè)定能力驗(yàn)證”活動(dòng)，對(duì)各參加實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果進(jìn)行評(píng)定，并提出改善建議。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)室 本研究對(duì)象為分布在9個(gè)省份10個(gè)城市的14家質(zhì)譜檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 儀器與試劑 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（愛博才思）；微量移液器（艾本德）；磁力攪拌器（アズpeas株式會(huì)社）；多管渦旋混合儀（美國萊博特）；恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；天平（上海天美天平儀器有限公司）；甲醇，乙腈 (Merck)；甲酸 (Sigma-Aldhich)；二硫蘇糖醇(Macklin)；同型半胱氨酸 (CATO)；同型半胱氨酸-D4 (CIL) 。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集與制備：收集健康志愿者的血清基質(zhì)150ml用于制備能力驗(yàn)證樣品。根據(jù)初測(cè)值將不同來源的血清基質(zhì)分為高低二種濃度 (樣品A，樣品B，μmol/L)，分別充分混合、攪拌、靜置后分裝至無菌凍存管，規(guī)格為0.5ml/支。粘貼標(biāo)簽后儲(chǔ)存于-70℃冰箱。

1.3.2 樣品均勻性：從樣品總體中隨機(jī)抽取每種濃度樣品10個(gè)，采用ID-LC/MS/MS法將每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)量2次；為防止漂移，2次測(cè)量按隨機(jī)次序進(jìn)行。參考CNAS-GL003《能力驗(yàn)證樣品均勻性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)指南》[11]，采用單因素方差分析法對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理；P>0.05時(shí)認(rèn)為能力驗(yàn)證樣品均勻。

1.3.3 樣品穩(wěn)定性：考察能力樣品在凍融1次、-20℃&50天、干冰運(yùn)輸90h 3個(gè)條件下穩(wěn)定性，從每種濃度包裝單元中隨機(jī)抽取各條件下的樣本3個(gè)以上，采用ID-LC/MS/MS法將每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)量2次，以均勻性檢驗(yàn)結(jié)果為第1次穩(wěn)定性數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)。P>0.05時(shí)認(rèn)為能力驗(yàn)證樣品在該條件下穩(wěn)定。

1.3.4 樣品發(fā)放與檢測(cè)：每個(gè)實(shí)驗(yàn)室隨機(jī)發(fā)放2種濃度的樣品各1支。樣品用泡沫盒加裝干冰運(yùn)輸，到達(dá)參加實(shí)驗(yàn)室后立即置于-20℃保存。樣品開封后，各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)按照《參試指導(dǎo)書》要求盡快檢測(cè)。

1.3.5 能力評(píng)定：參考CNAS-GL002 《能力驗(yàn)證結(jié)果的統(tǒng)計(jì)處理和能力評(píng)價(jià)指南》[12]及GB/T28043-2019《利用實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)進(jìn)行能力驗(yàn)證的統(tǒng)計(jì)方法》[6]進(jìn)行能力評(píng)定。由參加實(shí)驗(yàn)室的公議值確定指定值，指定值的不確定度不可忽略時(shí)，采用能力評(píng)定統(tǒng)計(jì)量Z’比分?jǐn)?shù)進(jìn)行能力評(píng)定。評(píng)定原則為：|Z’|≤2時(shí)“滿意”；2＜|Z’|＜3時(shí)“可疑”；|Z’|≥3時(shí)“不滿意”。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用單因素方差分析法和t檢驗(yàn)法分別對(duì)能力驗(yàn)證樣品進(jìn)行均勻性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)。采用格拉布斯檢驗(yàn)法識(shí)別離群值，要求離群值的數(shù)量不超過總數(shù)量的20%。采用穩(wěn)健算法A計(jì)算指定值和能力評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)差[13]。使用EXCEL編制模板，驗(yàn)證后完成計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 樣品均勻性 見表1。采用單因素方差分析時(shí)，在α=0.05的檢驗(yàn)水準(zhǔn)下，樣品A和樣品B均滿足均勻性要求。

表1 同型半胱氨酸均勻性檢驗(yàn)

2.2 樣品穩(wěn)定性 見表2。采用t檢驗(yàn)時(shí)，在α=0.05的檢驗(yàn)水準(zhǔn)下，樣品A和樣品B在穩(wěn)定性檢驗(yàn)條件下均滿足穩(wěn)定性要求。

表2 同型半胱氨酸穩(wěn)定性檢驗(yàn)

2.3 能力驗(yàn)證結(jié)果 回報(bào)結(jié)果的14家參加實(shí)驗(yàn)室反饋結(jié)果良好，沒有粗大誤差和異常值，參加實(shí)驗(yàn)室結(jié)果統(tǒng)計(jì)量結(jié)果見表3；能力評(píng)定統(tǒng)計(jì)量見表4。根據(jù)能力評(píng)定原則，參加實(shí)驗(yàn)室二種濃度檢測(cè)結(jié)果均為滿意，滿意率為100%。

表3 參加實(shí)驗(yàn)室結(jié)果統(tǒng)計(jì)量匯總

表4 能力評(píng)定統(tǒng)計(jì)量

3 討論

由于時(shí)效、經(jīng)濟(jì)、方法學(xué)要求、指標(biāo)適用范圍、信息不暢等原因，部分實(shí)驗(yàn)室參加PT活動(dòng)的可及性較差[14]。培養(yǎng)有能力在ISO/IEC 17043體系運(yùn)行下，組織部分常規(guī)項(xiàng)目PT活動(dòng)的PTP，可有效緩解臨床檢驗(yàn)中心壓力、增加檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室參加頻次、保障患者權(quán)益[15-17]。

明確要求同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（ID-LC/MS/MS)是本輪PT的一大創(chuàng)新，也是對(duì)現(xiàn)有需求缺口的補(bǔ)充[18-19]。本輪PT參加實(shí)驗(yàn)室數(shù)量和實(shí)際回報(bào)結(jié)果數(shù)量均較少，數(shù)量不足容易產(chǎn)生極端能力評(píng)定結(jié)果，使能力驗(yàn)證效力下降[14,20]，為PTP組織PT帶來了極大的挑戰(zhàn)。經(jīng)綜合分析，參加實(shí)驗(yàn)室數(shù)量較少的原因有以下4條：①質(zhì)譜法在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)界的應(yīng)用有待普及；②參加實(shí)驗(yàn)室對(duì)PT活動(dòng)的重要性認(rèn)識(shí)不夠；③PTP組織PT活動(dòng)的經(jīng)驗(yàn)不足；④參加實(shí)驗(yàn)室對(duì)非政府性質(zhì)PTP的信任度不夠。針對(duì)上述問題，PTP需要優(yōu)化專業(yè)人才布局，在PT活動(dòng)運(yùn)行中不斷積累經(jīng)驗(yàn)，提升自己的技能，如改進(jìn)質(zhì)量管理體系、保證計(jì)劃運(yùn)作質(zhì)量、提供更專業(yè)的指導(dǎo)意見等。此外可借力權(quán)威平臺(tái)如中國合格評(píng)定國家認(rèn)可委員會(huì)（China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNAS）機(jī)構(gòu)、研究院等，加大對(duì)外宣傳力度，提高PTP知名度，使各實(shí)驗(yàn)室認(rèn)識(shí)到PT的重要性。

參加實(shí)驗(yàn)室使用ID-LC/MS/MS法檢測(cè)人血清中同型半胱氨酸的滿意率為100%。在排除偶然因素后對(duì)各實(shí)驗(yàn)室的原始記錄進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)部分實(shí)驗(yàn)室存在色譜峰未保留的情況；雖然未對(duì)評(píng)定結(jié)果造成影響，但變異度較高，因此仍建議實(shí)驗(yàn)室選擇合適的色譜柱和洗脫條件，以保證Hcy具有適宜的保留時(shí)間，實(shí)現(xiàn)雜質(zhì)分離。