徐娟，陳翔宇，李蒙蒙，林麗軍，陸利霞，劉元建，熊曉輝

（南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院，江蘇南京 211816）

微球（聚苯乙烯微球）廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、分析化學(xué)、標(biāo)準(zhǔn)計(jì)量以及吸附等領(lǐng)域[1]。熒光修飾的微球可作為計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球?qū)?xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)[2,3]。Cunningham等[4]添加已知濃度計(jì)數(shù)微球?qū)悠分械牟《具M(jìn)行熒光顯微鏡計(jì)數(shù)，結(jié)果表明在每毫升2.17×106～1.37×108個(gè)病毒的范圍內(nèi)該方法與膜過(guò)濾的計(jì)數(shù)結(jié)果無(wú)顯著性差異（P=0.531）。Ou等[5]在對(duì)濃度為每毫升104～108個(gè)活死菌進(jìn)行計(jì)數(shù)時(shí)，發(fā)現(xiàn)利用熒光微球的流式細(xì)胞術(shù)與瓊脂平板計(jì)數(shù)之間線(xiàn)性關(guān)系一致。另外，用于流式細(xì)胞儀的標(biāo)準(zhǔn)微球類(lèi)型不同，報(bào)道有濃度為每毫升1.0×108個(gè)的6.0 μm微球，濃度為每毫升106個(gè)的5.0～7.9 μm微球等[6,7]。但未有研究報(bào)道標(biāo)準(zhǔn)微球用于計(jì)數(shù)不同濃度細(xì)胞（病毒）時(shí)的適宜使用濃度。

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 39730-2020《細(xì)胞計(jì)數(shù)通用要求流式細(xì)胞測(cè)定法》中對(duì)計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球的使用濃度未說(shuō)明，且對(duì)標(biāo)準(zhǔn)微球使用中的聚集問(wèn)題缺少措施。ISO 20391-1:2018中對(duì)懸浮液中的細(xì)胞及微球需要保證均一性，才可實(shí)現(xiàn)所取樣反映實(shí)際樣品中的數(shù)量。已有研究表明體積分?jǐn)?shù)低于1%的Tween 20和體積分?jǐn)?shù)低于5%的Tween 80可有效降低微生物聚集且不會(huì)對(duì)細(xì)胞活性造成影響[8,9]。但缺少使用Tween 20和Tween 80促進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)微球的分散研究。本研究中發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)微球在液體中會(huì)發(fā)生聚集、結(jié)團(tuán)現(xiàn)象，導(dǎo)致細(xì)胞計(jì)數(shù)的不準(zhǔn)確，且產(chǎn)生顯著影響。

依據(jù)計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球法，對(duì)細(xì)胞和微球直接計(jì)數(shù)時(shí)統(tǒng)計(jì)的細(xì)胞和微球數(shù)量與計(jì)數(shù)結(jié)果相關(guān)。在顯微鏡直接計(jì)數(shù)過(guò)程中，當(dāng)載玻片上統(tǒng)計(jì)的細(xì)胞或微球數(shù)量大于350個(gè)時(shí)，才能獲得可靠的結(jié)果[10,11]。Braun等[12]在顯微鏡計(jì)數(shù)干燥土壤中的總細(xì)胞數(shù)實(shí)驗(yàn)中要求統(tǒng)計(jì)的細(xì)胞數(shù)量大于1 000個(gè)。而GB/T 39730-2020中僅說(shuō)明需采集的微球及細(xì)胞的數(shù)量，但并未說(shuō)明不同細(xì)胞濃度所對(duì)應(yīng)的計(jì)數(shù)數(shù)量。

本文以計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球和釀酒酵母ATCC9080為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究了計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球的分散條件及微球濃度對(duì)釀酒酵母細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響，分析了標(biāo)準(zhǔn)微球及細(xì)胞統(tǒng)計(jì)數(shù)量對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果的影響，并將標(biāo)準(zhǔn)微球計(jì)數(shù)與平板計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行了比較，為計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球用于微生物的準(zhǔn)確計(jì)數(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球（直徑8 μm），知益微球科技有限公司；釀酒酵母ATCC9080（S.cerevisiae），本實(shí)驗(yàn)室保藏菌株；0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffer Saline，PBS，pH值7.0），上海生工生物工程有限公司；Tween 20和Tween 80，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酵母浸出粉葡萄糖培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

生物顯微鏡BM1000，南京江南永新光學(xué)有限公司；智能生化培養(yǎng)箱SHP-100，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球的懸液制備及分散

1.3.1.1 計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球分散處理實(shí)驗(yàn)

（1）Tween 20對(duì)計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球分散的影響

在無(wú)菌PBS緩沖液中加入不同體積的Tween 20，得到體積分?jǐn)?shù)為0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%的Tween 20，采用0.22 μm濾膜過(guò)濾后得到不同體積分?jǐn)?shù)的PBS吐溫20溶液（PBS-Tween 20，PBST2）。稱(chēng)取0.0150 g微球粉末分別溶解于10 mL無(wú)菌PBS緩沖液和不同體積分?jǐn)?shù)的PBST2中，經(jīng)超聲（50 Hz）分散至無(wú)肉眼可見(jiàn)結(jié)塊后得到待測(cè)微球溶液。每個(gè)處理組重復(fù)三次。以無(wú)菌PBS緩沖液處理組為對(duì)照組，計(jì)算不同體積分?jǐn)?shù)Tween 20處理的計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球分散指數(shù)（I）。

（2）Tween 80對(duì)計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球分散的影響

在無(wú)菌PBS緩沖液中加入不同體積的Tween 80，得到體積分?jǐn)?shù)為0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%的Tween 80，采用0.22 μm濾膜過(guò)濾后得到不同體積分?jǐn)?shù)的PBS吐溫80溶液（PBS-Tween 80，PBST8）。其它同（1）處理，計(jì)算不同體積分?jǐn)?shù)Tween 80處理的計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球分散指數(shù)（I）。

1.3.1.2 計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球分散指數(shù)測(cè)定

使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球溶液，觀(guān)察分散處理前后微球分散情況，分散指數(shù)（I）計(jì)算見(jiàn)公式1[8]。

式中：

I——分散指數(shù)；

T1——分散后標(biāo)準(zhǔn)微球在血球計(jì)數(shù)板五個(gè)中格總數(shù)，個(gè)；

T0——對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)微球在血球計(jì)數(shù)板五個(gè)中格總數(shù)，個(gè)。

1.3.2 釀酒酵母菌懸液的制備

取用酵母浸出粉葡萄糖培養(yǎng)基在30 ℃，160 r/min培養(yǎng)18 h的釀酒酵母液體培養(yǎng)液，重懸后用無(wú)菌的PBS溶液進(jìn)行十倍稀釋得到一系列菌懸液。采用血球計(jì)數(shù)板對(duì)菌懸液進(jìn)行三次重復(fù)計(jì)數(shù)，選取其中濃度為每毫升105～107個(gè)的菌液作為計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球法和平板計(jì)數(shù)法的計(jì)數(shù)樣品。

1.3.3 釀酒酵母濃度計(jì)數(shù)

1.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)微球計(jì)數(shù)釀酒酵母濃度

將0.0150 g微球粉末溶解于5 mL 0.08%的PBST2，用0.08% PBST2稀釋后經(jīng)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)得到每毫升4.25×104、8.60×105、7.56×106、2.17×107個(gè)的微球溶液。移取100 μL制備的不同濃度微球溶液分別與100 μL待測(cè)釀酒酵母溶液混勻，制成微球、釀酒酵母的混合溶液后，用扁平玻璃毛細(xì)管吸取部分混合溶液在10×40倍鏡下進(jìn)行顯微鏡計(jì)數(shù)”，隨機(jī)獲取20～45個(gè)顯微鏡圖像，使用ImageJ軟件計(jì)數(shù)圖像中釀酒酵母和微球[13]。每個(gè)樣品進(jìn)行三次重復(fù)并計(jì)算平均值及標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算結(jié)果間的變異系數(shù)（Coefficient of Variation，CV）。

標(biāo)準(zhǔn)微球計(jì)數(shù)釀酒酵母濃度計(jì)算參考GB/T 39730-2020，見(jiàn)公式2。

式中：

C——釀酒酵母濃度，個(gè)/mL；

Ncell——單個(gè)圖像中釀酒酵母的平均數(shù)量，個(gè)；

Nball——單個(gè)圖像中標(biāo)準(zhǔn)微球的平均數(shù)量，個(gè)；

Qball——釀酒酵母中添加的計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球總數(shù)量，個(gè)；

V——與標(biāo)準(zhǔn)微球混合的待測(cè)釀酒酵母溶液的原體積，mL；

D——釀酒酵母溶液的稀釋倍數(shù)。

1.3.3.2 平板計(jì)數(shù)釀酒酵母濃度

將標(biāo)準(zhǔn)微球與釀酒酵母混合懸液采用平板計(jì)數(shù)釀酒酵母濃度，依據(jù)GB 4789.15-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)》進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)分析

Microsoft Office Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；Origin 2018進(jìn)行圖像繪制；IBM SPSS Statistics 26軟件采用沃勒-鄧肯法（Waller-Duncan）進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05為存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球分散處理結(jié)果

2.1.1 Tween 20對(duì)計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球分散的影響

在使用流式細(xì)胞儀對(duì)熒光微球計(jì)數(shù)之前，先采用渦旋混合器對(duì)微球溶液進(jìn)行混勻，但未說(shuō)明標(biāo)準(zhǔn)微球是否分散及其效果[14]。圖1是計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球在不同體積分?jǐn)?shù)Tween 20中的分布情況。

圖1 不同體積分?jǐn)?shù)的Tween 20對(duì)計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球分散現(xiàn)象Fig.1 Dispersion of counting standard microspheres with different volume fractions of Tween 20

由圖1a可知計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球在未添加Tween 20的PBS溶液中存在大量聚集和分層現(xiàn)象（在顯微鏡圖像中有的微球模糊），可見(jiàn)多個(gè)計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球聚集體以及部分微球懸浮或沉淀情況。而計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球的聚集會(huì)直接影響標(biāo)準(zhǔn)微球計(jì)數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此在計(jì)數(shù)之前需要對(duì)標(biāo)準(zhǔn)微球進(jìn)行混勻或者分散處理。

由圖1b～1d可發(fā)現(xiàn)，不同體積分?jǐn)?shù)的Tween 20促進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)微球分散，并隨著Tween 20的體積分?jǐn)?shù)增加，微球的聚集和分層現(xiàn)象逐漸改善；且體積分?jǐn)?shù)在0.08%時(shí)微球聚集團(tuán)變?yōu)閱蝹€(gè)分散的微球，不再分層。分散指數(shù)是指處理組與對(duì)照組在血球計(jì)數(shù)板五個(gè)中格總數(shù)的差值與對(duì)照組五個(gè)中格總數(shù)的比值。對(duì)于同一濃度微球懸液，處理后的分散指數(shù)越大，則說(shuō)明與對(duì)照組相比，微球聚集減少，進(jìn)入計(jì)數(shù)區(qū)的粒子數(shù)量越多，說(shuō)明微球分層和聚集導(dǎo)致問(wèn)題得到了改善。因此可通過(guò)分散指數(shù)判斷分散效果。

由圖2可知，不同體積分?jǐn)?shù)的Tween 20處理組的分散指數(shù)較對(duì)照組均顯著增加（P＜0.05），表明該處理改善了微球的聚集情況，且隨著Tween 20體積分?jǐn)?shù)的增加，分散指數(shù)先增加后趨于穩(wěn)定。其中當(dāng)Tween 20體積分?jǐn)?shù)為0.08%時(shí)，釀酒酵母分散指數(shù)為3.32，此后隨著Tween 20體積分?jǐn)?shù)增加，分散指數(shù)變化不顯著（P＞0.05），即體積分?jǐn)?shù)為0.08%～0.12%的Tween 20對(duì)標(biāo)準(zhǔn)微球均有促分散效果。但增大Tween 20體積分?jǐn)?shù)，在分散時(shí)會(huì)產(chǎn)生較多氣泡。Brando等[15]發(fā)現(xiàn)渦旋或混勻時(shí)產(chǎn)生的微氣泡會(huì)聚集微球并使得移取液中微球的數(shù)量發(fā)生變化。研究表明0.2%～1.0% Tween 20不會(huì)影響釀酒酵母細(xì)胞活性[8]。因此采用更低體積分?jǐn)?shù)的0.08% Tween 20的微球溶液計(jì)數(shù)釀酒酵母也不會(huì)對(duì)其活性造成影響。另外如圖3所示，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在含0.08% Tween 20的微球溶液中，除去因出芽繁殖形成的少數(shù)聚集外，釀酒酵母并未出現(xiàn)明顯的聚集。Cilliers等[16]在奶酪勻漿中回收微生物群時(shí)，使用0.02%Tween 20和1 mmol/L EDTA來(lái)對(duì)微生物進(jìn)行分散。然而在0.08% Tween 20中微球仍會(huì)存在極少數(shù)2～3個(gè)微球聚集（圖1d），但這部分聚集僅占計(jì)數(shù)區(qū)域微球總數(shù)的1%，并不會(huì)對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果造成誤差。

圖2 不同體積分?jǐn)?shù)的Tween 20對(duì)計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球分散指數(shù)的影響Fig.2 Effect of different volume fractions of Tween 20 on the dispersion index of counting standard microspheres

圖3 釀酒酵母在含有0.08% Tween 20的微球溶液中的分散狀態(tài)Fig.3 Dispersion of S.cerevisiae in a microsphere solution containing 0.08% Tween 20

計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球易發(fā)生團(tuán)聚現(xiàn)象并且表面具有疏水性，疏水作用使微球在PBS溶液中無(wú)法形成穩(wěn)定的溶液[17]。Tween 20是一種常用的非離子型表面活性劑，能在微球表面增加羧基、醚類(lèi)等親水性基團(tuán)，可改善微球在水溶液中的分散，使得微球在溶液中能夠均勻分散[18]。Jodar-Reyes[19]等也報(bào)道兩親性分子吸附在聚苯乙烯乳膠顆粒表面主要是依靠表面疏水區(qū)域之間的疏水吸引。因此通過(guò)Tween 20可改善標(biāo)準(zhǔn)微球聚集。

2.1.2 Tween 80對(duì)計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球分散的影響

圖4是計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球在不同體積分?jǐn)?shù)的Tween 80中的分布情況。由圖4a可知，計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球在未添加Tween 80的PBS溶液中存在計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球聚集體以及部分微球懸浮或沉淀情況。與對(duì)照組相比，隨著Tween 80體積分?jǐn)?shù)增加，微球聚集的現(xiàn)象逐漸改善，微球聚集團(tuán)減少并呈現(xiàn)單個(gè)分散的微球，表明Tween 80有助于計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球的分散。

圖4 不同體積分?jǐn)?shù)Tween 80對(duì)計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球分散現(xiàn)象Fig.4 Dispersion of counting standard microspheres with different volume fractions of Tween 80

根據(jù)圖5可知，隨著Tween 80體積分?jǐn)?shù)的增加，分散指數(shù)先增加后趨于穩(wěn)定。其中當(dāng)Tween 80體積分?jǐn)?shù)為0.06%時(shí)，釀酒酵母分散指數(shù)為3.37，此后隨著Tween 80體積分?jǐn)?shù)增加，分散指數(shù)變化不顯著（P＞0.05）。與對(duì)照組相比，Tween 80對(duì)計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球的分散有顯著效果（P＜0.05），且當(dāng)Tween 80體積分?jǐn)?shù)達(dá)到0.06%～0.12%，分散結(jié)果達(dá)到最佳。與0.08%Tween 20相比，0.06% Tween 80也能使微球的最大分散指數(shù)達(dá)到3.30。

圖5 不同體積分?jǐn)?shù)的Tween 80對(duì)計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球分散指數(shù)的影響Fig.5 Effect of different volume fractions of Tween 80 on the dispersion index of counting standard microspheres

與Tween 20類(lèi)似，Tween 80是一種親水性的表面活性劑，其分子結(jié)構(gòu)中含有親脂性的脂肪鏈和親水性的氧乙烯鏈，對(duì)疏水性物質(zhì)有助溶作用。因此加入Tween 80可能改變聚苯乙烯微球表面的疏水性，從而促進(jìn)微球聚集體的分散。此外，對(duì)油脂類(lèi)樣品中微生物進(jìn)行計(jì)數(shù)時(shí)，也常使用Tween 80形成均勻分散溶液，且5% Tween 80不會(huì)影響菌落總數(shù)的平板計(jì)數(shù)結(jié)果[9,20]。

2.2 計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球濃度對(duì)不同濃度釀酒酵母細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響

采用已知數(shù)量的微球?qū)︶劸平湍高M(jìn)行計(jì)數(shù)是利用單個(gè)圖像中釀酒酵母細(xì)胞與微球數(shù)量的比值等于原混合溶液中兩者的比例，從而間接計(jì)算出待測(cè)釀酒酵母細(xì)胞的數(shù)量。當(dāng)流式細(xì)胞儀無(wú)法精確控制或監(jiān)測(cè)檢測(cè)樣本的體積，可通過(guò)加入已知數(shù)量的微球獲得細(xì)胞的濃度[21]。為獲得計(jì)數(shù)釀酒酵母細(xì)胞適宜的微球濃度，實(shí)驗(yàn)分別使用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)微球?qū)︶劸平湍妇哼M(jìn)行計(jì)數(shù)。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用濃度小于每毫升105個(gè)的標(biāo)準(zhǔn)微球進(jìn)行計(jì)數(shù)，大量圖像中無(wú)微球存在，單個(gè)圖像中微球平均數(shù)量小于1個(gè)。即微球濃度太低會(huì)導(dǎo)致其在單個(gè)圖像中分布的數(shù)量較少，計(jì)數(shù)結(jié)果的穩(wěn)定性差。Seo等[22]報(bào)道單個(gè)顯微圖像的細(xì)胞數(shù)小于45個(gè)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果之間的高度差異。當(dāng)過(guò)濾器上細(xì)菌細(xì)胞數(shù)量小于105個(gè)時(shí)，顯微鏡計(jì)數(shù)會(huì)高估真實(shí)細(xì)菌濃度且高估范圍為15.0%～99.3%[23]。另外，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)微球的濃度大于每毫升107個(gè)時(shí)，導(dǎo)致整個(gè)圖像中全部被微球充滿(mǎn)，而影響對(duì)釀酒酵母細(xì)胞的識(shí)別統(tǒng)計(jì)。因此實(shí)驗(yàn)選取每毫升105、106、107個(gè)標(biāo)準(zhǔn)微球進(jìn)行分析。

對(duì)不同濃度釀酒酵母分別添加不同濃度計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球，采集顯微圖像后，計(jì)算獲得釀酒酵母濃度結(jié)果見(jiàn)表1。表1表明，同一釀酒酵母樣品添加每毫升105～107個(gè)微球，對(duì)釀酒酵母濃度結(jié)果無(wú)顯著影響（P＞0.05）。但通過(guò)比較添加不同濃度微球計(jì)數(shù)釀酒酵母的變異系數(shù)CV可知，對(duì)每毫升105～107個(gè)釀酒酵母進(jìn)行計(jì)數(shù)使用每毫升106個(gè)的微球更優(yōu)，且不同比例時(shí)組內(nèi)變異系數(shù)分別為5.13%、1.56%、3.47%。

表1 不同濃度計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球?qū)︶劸平湍傅挠?jì)數(shù)結(jié)果Table 1 Results of counting S.cerevisiae by different concentrations of counting standard microspheres

圖像計(jì)數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性與采集的圖像數(shù)量有關(guān)。Muthukrishnan等[10]發(fā)現(xiàn)當(dāng)載玻片上細(xì)菌不均勻分布時(shí)，至少需要計(jì)算20個(gè)隨機(jī)圖像或350個(gè)細(xì)菌細(xì)胞，才能可靠地估算載玻片上的細(xì)菌總數(shù)。Lander等[24]報(bào)道顯微鏡和原型激光掃描細(xì)胞儀對(duì)微球的計(jì)數(shù)結(jié)果存在波動(dòng)，這是因?yàn)橛?jì)數(shù)時(shí)隨機(jī)選取的計(jì)數(shù)區(qū)域小，小于計(jì)數(shù)濾膜總面積的10%，該方法的隨機(jī)性在對(duì)低濃度的粒子計(jì)數(shù)時(shí)會(huì)變得更加明顯。從表1結(jié)果表明與每毫升106～107個(gè)的釀酒酵母相比，每毫升105個(gè)釀酒酵母在單個(gè)圖像中的分布數(shù)量差異大，進(jìn)而使計(jì)數(shù)結(jié)果的變異系數(shù)大。因此對(duì)于低濃度樣品需要統(tǒng)計(jì)更多的圖像才能使計(jì)數(shù)結(jié)果趨于穩(wěn)定。在本研究中也發(fā)現(xiàn)對(duì)每毫升105～107個(gè)釀酒酵母計(jì)數(shù)，對(duì)應(yīng)地采集圖像數(shù)分別大于32、20、12個(gè)時(shí)計(jì)數(shù)結(jié)果趨于穩(wěn)定。因此為保證計(jì)數(shù)結(jié)果準(zhǔn)確，對(duì)每毫升105～107個(gè)釀酒酵母分別采集45、30和20個(gè)圖像。

平板計(jì)數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)微球計(jì)數(shù)釀酒酵母的結(jié)果如表2所示。統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)于同一樣品，兩種定量檢測(cè)結(jié)果間均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。另外，如圖6所示，兩種計(jì)數(shù)方法的擬合曲線(xiàn)為y=0.954 8x+0.395 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 9，說(shuō)明兩者有較好的相關(guān)性，即使用標(biāo)準(zhǔn)微球計(jì)數(shù)的結(jié)果也是準(zhǔn)確的。

圖6 兩種計(jì)數(shù)結(jié)果的相關(guān)性曲線(xiàn)Fig.6 Correlation curve between the counting results of the two methods

2.3 采集的計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球數(shù)量對(duì)不同濃度釀酒酵母計(jì)數(shù)的影響

對(duì)于微生物計(jì)數(shù)，一般要求計(jì)數(shù)結(jié)果應(yīng)保持在平均值±2SD范圍內(nèi)。另外，計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球法中要求采集微球的總數(shù)目不應(yīng)少于1 000個(gè)[25]。實(shí)驗(yàn)選取每毫升106個(gè)標(biāo)準(zhǔn)微球?qū)γ亢辽?05～107個(gè)釀酒酵母進(jìn)行計(jì)數(shù)，每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)，不同標(biāo)準(zhǔn)微球統(tǒng)計(jì)量對(duì)釀酒酵母計(jì)數(shù)結(jié)果的影響如圖7所示。從圖7表明，統(tǒng)計(jì)的微球總數(shù)量分別大于2 000個(gè)（采集細(xì)胞總數(shù)量大于200個(gè)）、1 500個(gè)（采集細(xì)胞總數(shù)量大于400個(gè)）、1 000個(gè)（采集細(xì)胞總數(shù)量大于2 600個(gè)）時(shí)，釀酒酵母計(jì)數(shù)濃度和單個(gè)圖像中微球的平均數(shù)量趨于穩(wěn)定，標(biāo)準(zhǔn)差逐漸減小。此時(shí)圖7a～c中單個(gè)圖像中微球的平均數(shù)量分別為68個(gè)、69個(gè)、72個(gè)，表明單個(gè)圖像中微球的平均數(shù)量始終保持在平均值±2SD范圍內(nèi)（69.75±3.93個(gè)）。該結(jié)果補(bǔ)充了GB/T 39730中需要統(tǒng)計(jì)的微球及細(xì)胞數(shù)量，可更準(zhǔn)確、方便獲得細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果。

圖7 統(tǒng)計(jì)的微球總數(shù)量對(duì)釀酒酵母濃度和單個(gè)圖像中微球的平均數(shù)量的影響Fig.7 Effect of total statistical amounts of microsphere on the concentration of S.cerevisiae and the average number of microspheres in individual image

3 討論

在采用標(biāo)準(zhǔn)微球?qū)Σ煌瑵舛任⑸镉?jì)數(shù)時(shí)，微球的分散、使用濃度以及對(duì)應(yīng)的統(tǒng)計(jì)數(shù)量對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果有重要意義。已有研究表明微球聚集或取樣以及溶液中存在微氣泡均會(huì)導(dǎo)致計(jì)數(shù)結(jié)果出現(xiàn)偏差[15]。ISO 20391-1:2018中也提到聚集體或凝聚體會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞計(jì)數(shù)不足，在計(jì)數(shù)前需制備分散良好的樣品。為解決標(biāo)準(zhǔn)微球聚集問(wèn)題，本研究表明0.08% Tween 20或0.06% Tween 80可有效分散計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球，其較PBS對(duì)照組分散指數(shù)分別提高了3.32和3.37，微球濃度提高了4倍，表明微球分散均勻?qū)Y(jié)果的重要作用。這與Chae等[11]的研究成果一致，他認(rèn)為微球在濾膜表面的分布不均會(huì)導(dǎo)致計(jì)數(shù)有偏差，因此在對(duì)微球進(jìn)行計(jì)數(shù)時(shí)需要保證分布均勻，提高計(jì)數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

為確定標(biāo)準(zhǔn)微球用于計(jì)數(shù)不同濃度細(xì)胞時(shí)的適宜使用濃度，本研究表明，與每毫升105個(gè)微球?qū)γ亢辽?05～107個(gè)釀酒酵母計(jì)數(shù)相比，使用每毫升106個(gè)微球得到的計(jì)數(shù)結(jié)果數(shù)據(jù)穩(wěn)定。這是因?yàn)楫?dāng)微球濃度過(guò)低時(shí)移取液中微球?yàn)椴此煞植糩26]。依據(jù)計(jì)數(shù)微球粒徑，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)微球的濃度高于每毫升107個(gè)時(shí)，微球會(huì)鋪滿(mǎn)整個(gè)圖像進(jìn)而影響對(duì)目標(biāo)細(xì)胞的識(shí)別與統(tǒng)計(jì)。因此，選擇適宜的計(jì)數(shù)微球濃度可利于結(jié)果的準(zhǔn)確性，也為計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球的應(yīng)用提供參數(shù)。

此外，對(duì)微生物進(jìn)行直接計(jì)數(shù)需明確統(tǒng)計(jì)數(shù)量，如顯微鏡計(jì)數(shù)樣品至少需要統(tǒng)計(jì)400～1 000個(gè)細(xì)菌細(xì)胞[12,27]。通過(guò)本研究的統(tǒng)計(jì)分析，確立不同濃度細(xì)胞需要統(tǒng)計(jì)的微球數(shù)量，不同于GB/T 39730-2020中統(tǒng)計(jì)1 000個(gè)微球的要求，表明為準(zhǔn)確獲得細(xì)胞濃度需增加微球數(shù)量至2 000個(gè)。

本研究將計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球與顯微鏡圖像結(jié)合，為微生物快速計(jì)數(shù)提供了依據(jù)。傳統(tǒng)的顯微鏡計(jì)數(shù)需已知測(cè)定的體積或者面積，當(dāng)載玻片上形成菌膜的具體面積未知時(shí)，需要對(duì)載玻片上涂片的全部區(qū)域進(jìn)行采集[28]。本實(shí)驗(yàn)基于微球計(jì)數(shù)無(wú)需已知計(jì)數(shù)室體積，利用微球與釀酒酵母的比例進(jìn)行計(jì)數(shù)，可在普通的載玻片上或者在不能準(zhǔn)確定量計(jì)數(shù)溶液的體積或過(guò)濾面積時(shí)進(jìn)行計(jì)數(shù)。而傳統(tǒng)熒光顯微鏡計(jì)數(shù)是基于膜面積進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，檢測(cè)成本高[29,30]。因此可進(jìn)一步研究在載玻片上采用計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)微球法代替膜過(guò)濾的方法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)表明0.08% Tween 20溶液和0.06% Tween 80溶液對(duì)微球的分散效果最佳，分散均勻的標(biāo)準(zhǔn)微球可用于微生物的準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。以每毫升105～107個(gè)釀酒酵母為分析對(duì)象，每毫升106個(gè)標(biāo)準(zhǔn)微球?qū)︶劸平湍赣?jì)數(shù)結(jié)果的穩(wěn)定性最好，統(tǒng)計(jì)的微球數(shù)量分別應(yīng)不小于2 000、1 500、1 000個(gè)，細(xì)胞數(shù)量分別應(yīng)不小于200、400、2 600個(gè)。在該計(jì)數(shù)條件下，其計(jì)數(shù)結(jié)果與平板計(jì)數(shù)結(jié)果一致。使用同一標(biāo)準(zhǔn)微球?qū)Σ煌瑵舛柔劸平湍附M計(jì)數(shù)的單個(gè)圖像中微球平均數(shù)量始終保持在平均值±2SD范圍內(nèi)，可準(zhǔn)確獲得釀酒酵母濃度，明確了GB/T 39730-2020標(biāo)準(zhǔn)微球使用條件。