蘆慧敏，李詠富,2*，邱菊

（1.貴陽(yáng)學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550005）（2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展研究所，貴州貴陽(yáng) 550006）

羊肚菌（Morchella），又名羊雀菌、羊肚菜或草笠竹，屬于子囊菌門(mén)、盤(pán)菌綱、盤(pán)菌目、羊肚菌科大型真菌，因形似羊肚而得名[1,2]。羊肚菌含多糖、優(yōu)質(zhì)蛋白、多酚、礦物質(zhì)和纖維素等營(yíng)養(yǎng)要素[3-5]，具有抗疲勞、抗氧化、抗腫瘤等作用[6,7]，是一類(lèi)低熱量、高營(yíng)養(yǎng)的食用真菌。另外，羊肚菌中含有的脯氨酸類(lèi)化合物，使其具有獨(dú)特的香氣，這種香氣在調(diào)味品中得到了廣泛的應(yīng)用[8]。近幾年羊肚菌產(chǎn)業(yè)大幅度增長(zhǎng)，根據(jù)行業(yè)調(diào)查，羊肚菌產(chǎn)量從2018年的3×104t左右增長(zhǎng)到2020年的1.5×105t左右，增長(zhǎng)了500%左右[9,10]。

多酚類(lèi)物質(zhì)是一種天然的抗氧化劑，它含有大量的酚羥基，可以有效地清除自由基[11]，因而國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)其進(jìn)行了大量的研究。目前多酚的提取方法主要采用溶劑萃取的方式，此外超聲輔助提取技術(shù)也越來(lái)越多地應(yīng)用于多酚的提取上，并取得了不錯(cuò)的提取效果。Ivana等[12]利用溶劑提取龍葵果多酚，并在乙醇體積分?jǐn)?shù)74.7%、60 ℃下提取40.3 min，提取的多酚含量較高；楊文娟等[13]利用超聲輔助溶劑提取花生根多酚，并在體積分?jǐn)?shù)70%乙醇、料液比1:30（g/mL）、45 ℃下提取50 min，提取的多酚中含有較多的兒茶素，且咖啡酸、p-香豆酸、白藜蘆醇等也有較不錯(cuò)的吸收；翟飛紅等[14]對(duì)羊肚菌、香菇、真姬菇進(jìn)行多酚提取，70%乙醇相同提取條件下，羊肚菌多酚的含量最高，且羊肚菌的抗氧化能力最佳，由此可見(jiàn)羊肚菌中多酚具有較香菇、真姬菇更佳的抗氧化能力；廖霞等[15]對(duì)黑脈羊肚菌進(jìn)行了3種溶劑的提取，對(duì)不同溶劑提取的6種多酚組分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)甲醇相提取了6種多酚，水相提取了5種，而乙酸乙酯相提取了4種，由此可見(jiàn)溶劑對(duì)不同酚類(lèi)物質(zhì)的溶出起著關(guān)鍵的作用；盧可可等[16]對(duì)三個(gè)產(chǎn)地的羊肚菌多酚提取后進(jìn)行組分測(cè)定，沒(méi)食子酸、原兒茶酸等含量均在500～1 000 μg/g之間，由此可見(jiàn)羊肚菌中含有較為豐富的酚類(lèi)物質(zhì)。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)常見(jiàn)食用菌多酚的提取方法進(jìn)行了研究，但關(guān)于羊肚菌多酚提取工藝優(yōu)化的文獻(xiàn)報(bào)道很少，而且不同萃取條件下的酚類(lèi)物質(zhì)也不清楚，制約了其開(kāi)發(fā)與應(yīng)用。本研究通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化羊肚菌超聲輔助溶劑提取多酚類(lèi)化合物，并對(duì)不同提取條件下的羊肚菌多酚進(jìn)行高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）鑒定，分析不同提取條件下酚類(lèi)物質(zhì)提取的差異，以期為羊肚菌后續(xù)的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)材料：六妹羊肚菌，貴州森之源農(nóng)業(yè)科技有限公司；沒(méi)食子酸，北京索萊寶科技有限公司；福林酚試劑，北京索萊寶科技有限公司；丙酮，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水碳酸鈉，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；乙腈，美國(guó)Sigma公司；無(wú)水乙醇、甲醇、2-(3,4-二羥基苯基)乙胺、4-羥基苯乙胺、沒(méi)食子酸、焦性沒(méi)食子酸、原兒茶酸、對(duì)羥基苯甲酸、兒茶素、咖啡酸、綠原酸、葒草苷、蘆丁、金絲桃苷、白藜蘆醇、木犀草素、槲皮素、阿魏酸，均購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司。

實(shí)驗(yàn)儀器：粉碎機(jī)IKA A11 basic，廣州艾卡；超聲波清洗機(jī)，昆山市超聲儀器；離心機(jī)，湖南湘儀；酶標(biāo)儀，賽默飛；Agilent HPLC 1260，安捷倫。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 羊肚菌多酚的提取工藝流程

將購(gòu)買(mǎi)的新鮮羊肚菌進(jìn)行凍干處理后放入密封袋內(nèi)，干燥器保存。將羊肚菌干品進(jìn)行粉碎處理，過(guò)50目篩備用。稱(chēng)取一定量的羊肚菌粉末，加入不同溶劑，在不同料液比、溫度、時(shí)間、功率條件下進(jìn)行提取，超聲提取完成后以5 000 r/min離心20 min，從離心管中取出上清液，并用0.45 μm濾頭過(guò)濾，得到羊肚菌多酚提取液備用。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

稱(chēng)?。?.100±0.005）g羊肚菌粉末，以料液比1:60（g/mL）、超聲溫度45 ℃、超聲時(shí)間30 min、超聲功率300 W為固定因素，分別考察溶劑類(lèi)型（體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液、體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇溶液、體積分?jǐn)?shù)為60%的丙酮溶液、水）、乙醇體積分?jǐn)?shù)0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%）、料液比（1:40、1:50、1:60、1:70、1:80）（g/mL）、超聲溫度25、35、45、55、65 ℃、超聲時(shí)間30、60、90、120、150、180 min、超聲功率240、300、360、420、480 W對(duì)羊肚菌多酚含量的影響。以上實(shí)驗(yàn)每組三個(gè)平行。

1.2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，以多酚含量為響應(yīng)值，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸優(yōu)化，設(shè)計(jì)因素水平編碼見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Box-Behnken experiment factor-level design

1.2.4 多酚測(cè)定

多酚的測(cè)定以沒(méi)食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，將沒(méi)食子酸溶液稀釋成0.5、0.25、0.125、0.06、0.03 mg/mL。分別吸取200 μL不同濃度的沒(méi)食子酸溶液至離心管中，向離心管中加入200 μL福林酚試劑，搖勻，靜置10 min，再加入1 mL 75 g/L的Na2CO3，再加入1.6 mL水，避光反應(yīng)2 h，于765 nm處測(cè)定吸光值，平行三次取平均值。以沒(méi)食子酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程：y=3.90x+0.1，R2=0.994。以同樣的方法測(cè)定羊肚菌樣品的多酚含量。

式中：

A——羊肚菌多酚含量，mg/g；

C——羊肚菌多酚的質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——提取液體積，mL；

N——稀釋倍數(shù)；

M——羊肚菌粉末質(zhì)量，g。

1.2.5 HPLC測(cè)定羊肚菌單酚

以2-(3,4-二羥基苯基)乙胺、4-羥基苯乙胺、焦性沒(méi)食子酸、木犀草素、蘆丁、對(duì)羥基苯甲酸、金絲桃苷、沒(méi)食子酸、兒茶素、咖啡酸、槲皮素、綠原酸、原兒茶酸、葒草苷、白藜蘆醇、阿魏酸為標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解配置成5、25、50、125、250 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，10種酚類(lèi)物質(zhì)的線(xiàn)性關(guān)系良好（R2＞0.99）。利用HPLC對(duì)單因素以及響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的羊肚菌多酚進(jìn)行稀釋、測(cè)定，計(jì)算樣品中單類(lèi)酚的含量。

HPLC分析條件：色譜柱為YMC-Pack ODS-AQ（250 mm×4.6 mm，3 μm）。流動(dòng)相A為0.1%甲酸，B為乙腈；梯度洗脫：0～25 min，2% B；25～45 min，12% B；45～55 min，25% B；55～60 min，35% B；60～65 min，40% B；65～70 min，2%B。流速1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫20 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)220、280、320、360 nm。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析

每組實(shí)驗(yàn)平行三次，采用Origin 2021對(duì)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行繪圖；采用Design-Expert.8軟件對(duì)各因素進(jìn)行回歸擬合，構(gòu)建模型，繪制響應(yīng)曲面圖，評(píng)估分析統(tǒng)計(jì)顯著性。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 不同溶劑對(duì)羊肚菌多酚含量的影響

當(dāng)使用水作為提取溶劑時(shí)，羊肚菌多酚的得率最高，其次是體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液、體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇溶液、體積分?jǐn)?shù)為60%丙酮溶液，這可能是由于羊肚菌多酚極性較大，與水的極性更為接近。水可以提取更多的食用菌多酚，這與一些研究者[17-19]提出的鹿茸菇及秀珍菇等其他食用菌中水相提取高于其他相的結(jié)論一致。但純水不一定與羊肚菌多酚的極性完全接近，因此可以向水中加入不同體積的有機(jī)溶劑中和極性，從而找到更接近羊肚菌多酚極性的提取液，設(shè)計(jì)不同有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)羊肚菌多酚得率的實(shí)驗(yàn)。又因?yàn)?0%乙醇的得率在體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇溶液、體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液、體積分?jǐn)?shù)為60%丙酮溶液中最高，且乙醇作為溶劑比甲醇、丙酮更加安全可靠，因而在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將設(shè)計(jì)不同乙醇濃度的溶劑提取羊肚菌多酚（圖1a所示）。

圖1 各因素對(duì)多酚含量的影響Fig.1 Effect of various factors on the content of polyphenols

2.1.2 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)羊肚菌多酚含量的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)羊肚菌多酚的得率影響較大，乙醇體積分?jǐn)?shù)在10%～100%范圍內(nèi)，羊肚菌的多酚含量隨著乙醇濃度的增大而降低，這可能是由于乙醇濃度的升高，溶劑的極性與羊肚菌多酚的極性差異變大，抑制了某些酚類(lèi)物質(zhì)的充分溶解[20]，故而羊肚菌多酚的得率下降。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，羊肚菌的得率最高。因此，最終選定乙醇體積分?jǐn)?shù)10%的溶液為最優(yōu)提取溶劑（圖1b所示）。

2.1.3 不同料液比對(duì)羊肚菌多酚含量的影響

液料比為1:40～1:60（g/mL）時(shí)，羊肚菌多酚會(huì)隨料液比的增加而增加，其原因在于隨料液比的增加，試樣與溶劑的接觸面積增大，從而避免了介質(zhì)飽和[21]，故而提高了提取效率；到1:60（g/mL）時(shí)，多酚的溶出達(dá)到平衡；繼續(xù)增加料液比，多酚含量逐漸下降，這可能是由于雜質(zhì)的增多抑制了多酚濃度[22]。因此，選定最優(yōu)料液比為1:60（g/mL）（圖1c所示）。

2.1.4 不同超聲時(shí)間對(duì)羊肚菌多酚含量的影響

在180 min內(nèi)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，羊肚菌多酚的含量逐漸增多，這可能是由于超聲時(shí)間的增加，胞內(nèi)多酚溶出的濃度逐漸增加，在90 min后，溶出的效率相較于前90 min更低，因此，為減少提取成本和提高提取效率，選定最優(yōu)超聲時(shí)間為90 min（圖1d所示）。

2.1.5 不同超聲溫度對(duì)羊肚菌多酚含量的影響

在25～35 ℃時(shí)，羊肚菌多酚的含量隨溫度的升高而增加，其原因可能是35 ℃時(shí)容易軟化羊肚菌的細(xì)胞壁，進(jìn)而影響其細(xì)胞膜的透過(guò)率，從而加速多酚物質(zhì)的溶出[17]；在35～65 ℃范圍內(nèi)，羊肚菌多酚含量隨著溫度的升高逐漸降低，這可能是由于多酚不耐高溫，在更高的溫度下極易分解、氧化，導(dǎo)致其多酚結(jié)構(gòu)被破壞，從而降低了多酚的提取[20]。因此，選定最優(yōu)提取溫度為35 ℃（圖1e所示）。

2.1.6 不同超聲功率對(duì)羊肚菌多酚含量的影響

在240～300 W范圍內(nèi)，羊肚菌多酚含量隨著功率的增加而增加，這可能是由于超聲波產(chǎn)生的空化和振動(dòng)效應(yīng)有效地改善了羊肚菌的傳質(zhì)，促進(jìn)了結(jié)構(gòu)的改變，比如微通道的形成加速了多酚物質(zhì)的溶出，這大大縮短了羊肚菌多酚的提取時(shí)間，并保持了樣品的質(zhì)量[23-25]。在300～480 W范圍內(nèi)，羊肚菌多酚含量隨著功率的增加而逐漸降低，這可能是由于過(guò)高的功率對(duì)羊肚菌的破壞能力更強(qiáng)，導(dǎo)致羊肚菌多酚的結(jié)構(gòu)被破壞[20]。因此，選定最優(yōu)提取功率為300 W（圖1f所示）。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面模型設(shè)計(jì)與分析

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)，對(duì)影響得率較顯著的三個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化多酚提取工藝，選取料液比、超聲溫度、超聲功率三個(gè)因素，共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面分析，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Box-Behnken experiment design and result

表3 超聲提取回歸方程方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance of the constructed regreesion model by ultrasonic-assisted extraction

通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元非線(xiàn)性回歸分析，建立了預(yù)測(cè)羊肚菌多酚得率的二階多項(xiàng)式模型：

Y=22.23-0.46A-0.46B+0.078C-0.81AB+0.011AC-0.35BC-2.31A2-3.35B2-1.00C2

高F值（45.96）和低于0.05的P值（P＜0.000 1）表明建議模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，而R2值（0.983 4）和R2adj（0.962 0）進(jìn)一步驗(yàn)證了該模型，模型可解釋96.20%響應(yīng)值變化。相關(guān)系數(shù)R2接近1，表明模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合良好。且二次項(xiàng)系數(shù)均為負(fù)數(shù)，有極大值，這也證明了模型的可靠性。根據(jù)方差分析結(jié)果，料液比和超聲溫度是影響羊肚菌多酚含量較為重要的因素，獨(dú)立因素的積極影響意味著他們的積極變化，從而導(dǎo)致響應(yīng)值的增加；料液比-超聲溫度對(duì)羊肚菌多酚的產(chǎn)率具有較為顯著的影響（P＜0.01），其他兩個(gè)的交互作用并不十分明顯。由F值大小可知，各因素對(duì)羊肚菌多酚含量的影響大致為：超聲溫度（B）＞料液比（A）＞超聲功率（C）。除了超聲功率及其二次效應(yīng)外，所有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的因素和交互作用對(duì)羊肚菌多酚的含量都有積極的影響。

2.2.2 響應(yīng)面分析

各因素間對(duì)羊肚菌多酚含量的交互作用影響的響應(yīng)曲面如圖2所示，通過(guò)料液比、超聲溫度、超聲功率之間交互關(guān)系的直觀表現(xiàn)表明，響應(yīng)曲面均為開(kāi)口向下的凸型曲面，多酚含量存在最大值。模型響應(yīng)面3D圖清楚地顯示了所有分析變化對(duì)羊肚菌多酚含量的積極影響。

圖2 料液比、超聲溫度、超聲功率之間的交互作用對(duì)多酚含量的等高線(xiàn)及響應(yīng)面圖Fig.2 Contour diagram and response surface of the interaction of liquid ratio, ultrasonic temperature and ultrasonic power on polyphenol content

結(jié)合P值并結(jié)合圖2分析可見(jiàn)，圖表與上述的方差分析結(jié)果一致，液料比-超聲溫度兩者間存在更顯著的交互作用。

2.2.3 最佳提取工藝確定及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過(guò)Design-Expert.8軟件求解回歸方程，得出最優(yōu)的羊肚菌提取工藝為：料液比1:66.9（g/mL）、超聲溫度33.43 ℃、超聲功率304.15 W。由于實(shí)驗(yàn)室實(shí)際操作的局限性，確定試驗(yàn)提取工藝為乙醇濃度10%、料液比1:67（g/mL）、超聲時(shí)間90 min、超聲溫度33 ℃、超聲功率300 W。在此條件下平行測(cè)定三次，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的多酚含量為22.39 mg/g，與預(yù)測(cè)值接近，偏差較小，證實(shí)此模型用于羊肚菌多酚提取工藝是可行的。這比前人研究[14-16]提取羊肚菌多酚使用搖床（14.478 mg/g）以及室溫放置（4.35 mg GAE/g）的提取方法的得率增加了0.54～4.15倍。

2.3 羊肚菌中單酚物質(zhì)分析

16種酚類(lèi)物質(zhì)混標(biāo)圖譜如圖3所示，對(duì)照單標(biāo)圖譜，確定混標(biāo)中16種酚類(lèi)物質(zhì)的保留時(shí)間，圖3中1為2-(3,4-二羥基苯基)乙胺，2為4-羥基苯乙胺，3為沒(méi)食子酸，4為焦性沒(méi)食子酸，5為原兒茶酸，6為對(duì)羥基苯甲酸，7為兒茶素，8為咖啡酸，9為綠原酸，10為葒草苷，11為蘆丁，12為金絲桃苷，13為白藜蘆醇，14為木犀草素，15為槲皮素，16為阿魏酸。

圖3 16種酚類(lèi)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的基峰色譜圖Fig.3 Base peak chromatograms of 16 phenolic standards

2.3.1 不同乙醇濃度中酚類(lèi)物質(zhì)分析

對(duì)羊肚菌不同乙醇濃度提取的10種多酚類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行了檢測(cè)，由表4中十種酚類(lèi)物質(zhì)的總量看出，隨著乙醇濃度的升高，酚類(lèi)物質(zhì)的含量逐漸減小，這與福林酚比色法測(cè)定的結(jié)果基本一致，這可能是由于乙醇濃度的增大，與某些酚類(lèi)物質(zhì)如葒草苷、金絲桃苷等的極性差異較大有關(guān)，純水提取的這10種酚類(lèi)物質(zhì)的種類(lèi)最多，其次是20%、30%乙醇體積分?jǐn)?shù)提取，提取了8種酚類(lèi)物質(zhì)；10%、40%乙醇體積分?jǐn)?shù)提取，提取了7種酚類(lèi)物質(zhì)。酪胺、沒(méi)食子酸、對(duì)羥基苯甲酸在10%乙醇濃度時(shí)得率最高，多巴胺、焦性沒(méi)食子酸、原兒茶酸、兒茶素、葒草苷、金絲桃苷在純水提取時(shí)得率最高，而木犀草素在20%乙醇體積分?jǐn)?shù)提取時(shí)得率最高。

表4 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)中酚類(lèi)物質(zhì)分析Table 4 Analysis of phenolic substances in different ethanol concentrations (μg/mL)

2.3.2 不同料液比中酚類(lèi)物質(zhì)分析

對(duì)羊肚菌不同料液比提取的10種多酚類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行了檢測(cè)，由表5中十種酚類(lèi)物質(zhì)的總量看出，隨著料液比的增加，酚類(lèi)物質(zhì)的含量逐漸減小，以mg/g計(jì)算得出的結(jié)果是1:50（g/mL）時(shí)的酚類(lèi)物質(zhì)最高，其次是1:60（g/mL），這可能是由于其他未知的酚類(lèi)物質(zhì)并未計(jì)算其中，導(dǎo)致結(jié)果與福林酚比色法有些許差異。使用更高的料液比提取時(shí)，檢測(cè)到了更多的酚類(lèi)物質(zhì)，說(shuō)明較高的料液比有利于這10種酚類(lèi)物質(zhì)的溶出。

表5 不同料液比提取酚類(lèi)物質(zhì)分析Table 5 Analysis of phenolic substances extracted with different solid-liquid ratios (μg/mL)

2.3.3 不同超聲溫度下酚類(lèi)物質(zhì)分析

對(duì)羊肚菌不同超聲溫度提取的10種多酚類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行了檢測(cè)，由表6中十種酚類(lèi)物質(zhì)的總量看出，在25～45 ℃時(shí)，隨著超聲溫度的增加，酚類(lèi)物質(zhì)的含量逐漸增加；在45～65 ℃時(shí)，隨著超聲溫度的增加，酚類(lèi)物質(zhì)的含量逐漸減少；且在45 ℃時(shí)，檢測(cè)到的酚類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)更多，這說(shuō)明適當(dāng)提高溫度，有助于酚類(lèi)物質(zhì)的溶出，溫度過(guò)高，酚類(lèi)物質(zhì)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)被破壞的更多，導(dǎo)致多酚總量減少。多巴胺、酪胺在35 ℃時(shí)得率最高，而焦性沒(méi)食子酸、原兒茶酸在25℃時(shí)得率最高，對(duì)羥基苯乙酸、兒茶素、金絲桃苷等在45 ℃時(shí)得率最高。

表6 不同超聲溫度提取酚類(lèi)物質(zhì)分析Table 6 Analysis of phenolic substances extracted by different ultrasonic temperatures (μg/mL)

2.3.4 不同超聲功率下酚類(lèi)物質(zhì)分析

對(duì)羊肚菌不同超聲功率提取的10種多酚類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行了檢測(cè)，由表7中10種酚類(lèi)物質(zhì)的總量看出，功率對(duì)這10種酚類(lèi)物質(zhì)提取的影響不大，但總體呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，這可能是由于功率的增加對(duì)這10種酚類(lèi)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)有影響，導(dǎo)致內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使其由240 W時(shí)提取的7種酚類(lèi)物質(zhì)減少到了480 W時(shí)的5種，這說(shuō)明較低的功率有利于這10種酚類(lèi)物質(zhì)的溶出且保持它們的結(jié)構(gòu)。

表7 不同超聲功率提取酚類(lèi)物質(zhì)分析Table 7 Analysis of phenolic substances extracted by different ultrasonic powers (μg/mL)

表8 最佳工藝提取酚類(lèi)物質(zhì)分析Table 8 Analysis of phenols extracted by optimal process (μg/mL)

2.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化最佳工藝酚類(lèi)物質(zhì)分析

響應(yīng)曲面中，羊肚菌在乙醇體積分?jǐn)?shù)10%、料液比1:60（g/mL）、35 ℃、300 W下超聲90 min，得率最高，以此條件下的提取液進(jìn)行酚類(lèi)物質(zhì)檢測(cè)，共檢測(cè)出8種酚類(lèi)物質(zhì)，8種酚類(lèi)物質(zhì)的總量達(dá)到了76.08 μg/mL，達(dá)到了較高的含量。

3 結(jié)論

本文采用響應(yīng)面法對(duì)羊肚菌多酚的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，首先對(duì)溶劑類(lèi)型、乙醇濃度、料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度、超聲功率等提取條件進(jìn)行了單因素優(yōu)化，并對(duì)影響較為顯著的幾個(gè)因素進(jìn)行三因素三水平Box-Behnken設(shè)計(jì)，得出了最佳工藝參數(shù)：10%乙醇體積分?jǐn)?shù)，料液比1:67（g/mL），超聲時(shí)間90 min，超聲溫度33 ℃，超聲功率300 W，此工藝條件下提取羊肚菌多酚含量為22.39 mg/g。根據(jù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，模型較為顯著（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），擬合程度高（96.2%），三因素對(duì)得率影響順序?yàn)椋撼暅囟龋玖弦罕龋境暪β?。同時(shí)對(duì)各提取條件下的羊肚菌多酚進(jìn)行了HPLC檢測(cè)，共檢測(cè)出10種酚類(lèi)物質(zhì)，且各單因素條件下提取的10種酚類(lèi)物質(zhì)的含量曲線(xiàn)也與福林酚比色法測(cè)定數(shù)據(jù)基本一致。另外，HPLC測(cè)定出其他峰譜成分仍然未知，具體還需進(jìn)一步研究。