唐春花 楊 潔 盧曉玲 陳美侖 魏 錚 余 鵬** 趙 佳

（1）中南大學(xué)湘雅藥學(xué)院，長(zhǎng)沙 410013；2）長(zhǎng)沙信勵(lì)致和科技有限公司，長(zhǎng)沙 410013）

甾體激素，即類固醇激素，是一類以環(huán)戊烷并多氫菲為母核的激素，由膽固醇經(jīng)過一系列的酶解反應(yīng)而產(chǎn)生，按照其功能可分為性激素和皮質(zhì)激素，在維持生命、調(diào)節(jié)性功能、調(diào)控機(jī)體發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)、皮膚疾病治療及生育控制等方面發(fā)揮重要作用［1］。檢測(cè)體內(nèi)的甾體激素水平對(duì)于內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病的診斷和治療、生理狀態(tài)的監(jiān)測(cè)等有著重要的意義［2-3］；甾體激素類藥物在臨床上也有著極大的醫(yī)藥價(jià)值。但是，當(dāng)甾體激素進(jìn)入環(huán)境后，會(huì)成為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，污染水資源、土壤資源，威脅民眾的身體健康［4］。因此，能夠?qū)w內(nèi)、環(huán)境中的甾體激素進(jìn)行高靈敏度和高特異性監(jiān)測(cè)的技術(shù)具有極廣泛的應(yīng)用前景。

核酸適配體是一段寡聚核苷酸鏈，可折疊成多樣的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)，如莖、環(huán)、凸、G-四聯(lián)體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)等，與靶標(biāo)特異性結(jié)合［5］。因此可作為識(shí)別分子，用于分析檢測(cè)領(lǐng)域。此外，適配體相比于抗體，擁有穩(wěn)定性高、合成周期短、無免疫原性、靶標(biāo)物質(zhì)更廣且易修飾等優(yōu)點(diǎn)［5］。適配體的篩選是其應(yīng)用的前提，配體指數(shù)富集系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）是體外篩選適配體的方法［6］。適配體的篩選和分離方法多樣，針對(duì)各種靶標(biāo)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的不同，又衍生出許多SELEX分支技術(shù)［7］。

目前研究者已對(duì)甾體激素中的雌激素（如雌二醇（estradiol，E2）［8-13］、雌酮（estrone，E1）［10］）、雄激素（如睪酮（testosterone，TES）［14］、去甲睪酮［12］）、孕激素（如孕酮（progesterone，P4）［15-16］）以及皮質(zhì)激素（如皮質(zhì)醇（cortisol，COR）［17-18］）的核酸適配體進(jìn)行了篩選。本文總結(jié)了上述已報(bào)道甾體激素適配體的篩選原理及策略；對(duì)適配體序列、平衡解離常數(shù)（equilibrium dissociation constants，KD）及測(cè)定方法等進(jìn)行了簡(jiǎn)要?dú)w納；介紹了計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)在適配體篩選和優(yōu)化方面的新思路；對(duì)目前開發(fā)的各類甾體激素適配體傳感器進(jìn)行簡(jiǎn)要介紹，以期為后續(xù)研究提供參考。

1 甾體激素的種類、結(jié)構(gòu)及生理作用

甾體激素都含有環(huán)戊烷并多氫菲的甾體母核基本結(jié)構(gòu)（圖1），系由3個(gè)六元環(huán)脂烴（A環(huán)、B環(huán)、C環(huán)）和1個(gè)五元脂環(huán)（D環(huán)）組成。甾體激素按藥理作用可分為性激素和皮質(zhì)激素，按化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為雌甾烷、雄甾烷和孕甾烷三大類。

Fig.1 The structure of the steroid nucleus圖1 甾體母核結(jié)構(gòu)

雌激素以雌甾烷為母核，雌甾烷在C-13上連有甲基，此甲基碳原子編號(hào)為C-18，主要代表有E2、E1等。雌激素有內(nèi)源性和外源性之分，其作用為刺激卵泡發(fā)育、促進(jìn)第二性征出現(xiàn)、控制妊娠和哺乳等。

雄甾烷在C-13及C-10上連有甲基，碳原子編號(hào)分別為C-18、C-19，此類激素為雄激素，主要代表為TES，TES由睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成，對(duì)精子生成具有重要意義，且可以促進(jìn)第二性征出現(xiàn)，加快蛋白質(zhì)合成，與臨床上前列腺癌等多種疾病有密切的聯(lián)系。

孕甾烷在C-13及C-10上也連有甲基，分別為C-18、C-19，且在C-17上連有乙?；?，碳原子編號(hào)分別為C-20和C-21。孕激素和皮質(zhì)激素都以孕甾烷為母核。孕激素中具有代表性的為P4，它與女性的月經(jīng)周期、懷孕及胎兒發(fā)育有著密切的關(guān)系。

皮質(zhì)激素分為糖皮質(zhì)激素和鹽皮質(zhì)激素，皆以孕甾烷為母核，由腎上腺皮質(zhì)合成和分泌，在調(diào)節(jié)體內(nèi)的水鹽代謝和糖代謝發(fā)揮著重要作用。甾體激素的三種母核結(jié)構(gòu)及激素代表如表1所示。

Table 1 Three nucleus structures of steroid hormones and their representatives表 1 甾體激素的三種母核結(jié)構(gòu)及激素代表

甾體激素通常在非常低的濃度下以納摩爾每升或皮摩爾每升水平的濃度與核受體結(jié)合而發(fā)揮強(qiáng)烈的生理作用。由于在生物體內(nèi)含量極低，不同甾體激素之間由于結(jié)構(gòu)十分相似，還存在大量的立體異構(gòu)體，因此對(duì)甾體激素的高靈敏度和高特異性檢測(cè)難度較大。常見的檢測(cè)甾體激素的方法有色譜法和免疫法。色譜法如高效液相色譜、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等；免疫法如免疫熒光法、酶聯(lián)免疫測(cè)定法和放射免疫分析法等［19-21］。這兩類方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，但存在著價(jià)格昂貴、操作繁瑣、需要專業(yè)的技術(shù)人員、不適于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等缺點(diǎn)，因此亟需研發(fā)操作簡(jiǎn)單、結(jié)果快速、成本低廉、可用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)甾體激素的方法。

核酸適配體的出現(xiàn)為構(gòu)建新型的生物傳感器帶來了契機(jī)，自適配體開發(fā)的30多年時(shí)間里，已有廣泛的研究，在細(xì)胞［22-23］、蛋白質(zhì)［24-25］等大分子以及激素［26-27］、金屬離子［28-29］和生物毒素［30-31］等小分子檢測(cè)領(lǐng)域中都有大量實(shí)例可提供參考。

2 甾體激素的核酸適配體篩選原理與策略

SELEX技術(shù)自1990年開發(fā)至今已有30余年［6］，并逐漸出現(xiàn)了多種衍生形式，如毛細(xì)管電泳SELEX技術(shù)（capillary electrophoresis-SELEX，CE-SELEX）［32］、磁珠-SELEX［33］、細(xì)胞SELEX［34］、體內(nèi)SELEX［35］和一輪SELEX［36］等。

甾體激素適配體的篩選基本原理同SELEX篩選其他物質(zhì)一樣（圖2），其基本思路是體外先化學(xué)合成一個(gè)寡核苷酸文庫，將核苷酸文庫與靶物質(zhì)混合形成靶物質(zhì)-核酸的復(fù)合物，然后利用不同的分離方法分離出與靶物質(zhì)結(jié)合的核酸，以此核酸分子為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再進(jìn)行下一輪的循環(huán)篩選過程。通過重復(fù)的篩選與擴(kuò)增，對(duì)多個(gè)篩選回合后選擇的潛在適配體進(jìn)行測(cè)序，評(píng)估其親和力與特異性，最后得到與靶物質(zhì)高親和力與高特異性結(jié)合的適配體［7］。

Fig.2 The general process of aptamer isolation圖2 適配體篩選的一般流程

甾體激素屬于小分子化合物，分子質(zhì)量較?。ㄒ话?500 u），已有研究指出，小分子靶點(diǎn)選擇的適配體比其他靶點(diǎn)選擇的適配體親和力低，小分子的結(jié)構(gòu)相比大分子來說復(fù)雜度較低，這限制了小分子和適配體之間作用力的數(shù)量和強(qiáng)度，導(dǎo)致適配子-靶標(biāo)結(jié)合親和力降低，也一定程度影響了適配體的特異性［37］。篩選小分子靶標(biāo)適配體的主要挑戰(zhàn)之一是靶標(biāo)-核酸復(fù)合物和游離核酸的分離。靶標(biāo)的小尺寸并不會(huì)導(dǎo)致游離核酸和靶標(biāo)-核酸復(fù)合物之間存在較大的質(zhì)量差異，使分離過程復(fù)雜化。因此，選擇小分子時(shí)通常需要固定靶標(biāo)或者核酸其中一個(gè)生物分子［38］。一般來說，SELEX技術(shù)可以分為固定化靶標(biāo)與非固定化靶標(biāo)技術(shù)。

固定化靶標(biāo)技術(shù)是最早運(yùn)用的SELEX技術(shù)之一。在1990年，Ellington等［6］通過固定化靶標(biāo)技術(shù)，將靶標(biāo)分子有機(jī)染料偶聯(lián)到固體載體基質(zhì)瓊脂糖顆粒上，隨后將瓊脂糖顆粒填入層析柱，通過親和柱層析的方法洗脫分離靶標(biāo)-核酸復(fù)合物與游離寡核苷酸，并通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）將候選核酸序列從瓊脂糖凝膠顆粒上洗脫下來，從而獲得了幾種小分子有機(jī)染料的RNA適配體。后來又有研究者將小分子靶標(biāo)通過化學(xué)偶聯(lián)的方式將固定在磁珠上進(jìn)行篩選，即磁珠-SELEX［39-40］，當(dāng)核酸文庫與磁珠-靶標(biāo)偶聯(lián)物混合孵育后，可通過磁性分離的方法實(shí)現(xiàn)磁珠-靶物質(zhì)-核酸復(fù)合物與游離核酸的分離，將生物磁珠作為固相載體的方式簡(jiǎn)化了分離過程，磁性分離使得適配體篩選更簡(jiǎn)便、高效。

固定化靶標(biāo)的SELEX技術(shù)目前運(yùn)用已經(jīng)相當(dāng)廣泛，但是對(duì)于小分子化合物來說，固定靶標(biāo)的方式也存在著一些局限性：a.小分子表面可以偶聯(lián)的基團(tuán)少，固定化過程比較繁瑣，固定成功率較低［37］；b.基團(tuán)進(jìn)行偶聯(lián)后，小分子可能會(huì)形成比較特殊的空間結(jié)構(gòu)，阻礙官能團(tuán)與適配體相互識(shí)別、相互作用的過程，甚至可能無法篩選到候選適配體［41］；c.小分子經(jīng)過偶聯(lián)后也可能產(chǎn)生一些比較特殊的位點(diǎn)，篩選得到的適配體只對(duì)偶聯(lián)后的小分子存在親和力，這可能會(huì)對(duì)適配體的實(shí)際應(yīng)用產(chǎn)生不利影響［38］。

隨著研究的不斷深入，非固定化靶標(biāo)技術(shù)逐漸進(jìn)入人們的視野，非固定化靶標(biāo)技術(shù)分為固定文庫的SELEX技術(shù)和均相SELEX［42］。

Capture-SELEX技術(shù)就是一種固定文庫的篩選技術(shù)。2005年，Nutiu和Li［43］報(bào)道了一種通過固定文庫而不是固定靶標(biāo)的篩選方法（圖3），這種方法主要是在核酸文庫的序列中設(shè)計(jì)一段序列，這段序列與生物素化的互補(bǔ)序列進(jìn)行堿基配對(duì)，進(jìn)而將整個(gè)核酸文庫固定在標(biāo)記了鏈霉親和素的珠子上。當(dāng)加入靶標(biāo)后，靶標(biāo)與核酸適配體相互作用，與靶標(biāo)親和力強(qiáng)的核酸序列會(huì)“掙脫”互補(bǔ)序列，進(jìn)入到溶液中。而親和力較弱、無親和力的序列則會(huì)留在固體基質(zhì)珠子上，以此實(shí)現(xiàn)候選序列的分離與富集。Capture-SELEX可以針對(duì)“天然”狀態(tài)下的靶標(biāo)分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行篩選，避免了由于靶標(biāo)固定帶來的一系列不利影響，但可以看出，這種方法存在著繁瑣的文庫固定操作，固定效率難以控制，也可能出現(xiàn)文庫在洗脫時(shí)與互補(bǔ)序列自發(fā)分離進(jìn)而降低篩選效率、增加篩選輪數(shù)等問題［42］。

Fig.3 In vitro selection of aptamers by the Capture-SELEX圖3 使用Capture-SELEX技術(shù)篩選適配體

均相SELEX技術(shù)指的是核酸-靶標(biāo)復(fù)合物和游離核酸在溶液中進(jìn)行分離，文庫和靶標(biāo)均不進(jìn)行固定的技術(shù)。CE-SELEX是一種典型的均相SELEX技術(shù)，它利用靶標(biāo)-核酸混合物與游離寡核苷酸在電泳時(shí)的遷移率差異，實(shí)現(xiàn)對(duì)候選適配體的分離。在2005年，研究人員首次將CE技術(shù)用于一種小肽靶標(biāo)神經(jīng)肽Y的適配體篩選中，結(jié)果表明僅經(jīng)過4輪篩選獲得的ssDNA適配體的親和力可以與傳統(tǒng)SELEX的12輪篩選獲得的 RNA 適配體相媲美。但是CE-SELEX也存在著設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜的局限性，且對(duì)于小分子來說，寡核苷酸在結(jié)合小分子前后，在分子質(zhì)量、電荷等方面產(chǎn)生的差異較小，往往也存在著難以進(jìn)行分離二者的情況［44］。氧化石墨烯（graphene oxide，GO）具有通過π-π堆積吸附ssDNA/RNA的特性，因而受到廣泛關(guān)注。由于GO吸附游離單鏈核酸的作用力比與靶標(biāo)結(jié)合的折疊核酸結(jié)構(gòu)更為緊密，因此可用于分離篩選溶液中游離的單鏈核酸，有研究者利用此原理構(gòu)建了GO-SELEX篩選方法［45］。GO與核酸文庫、靶標(biāo)共孵育，當(dāng)候選核酸適配體與靶標(biāo)發(fā)生相互作用時(shí)，核酸的構(gòu)象產(chǎn)生變化，從而不能被GO吸附，通過離心的方式分離出核酸-靶標(biāo)復(fù)合物與游離核酸。近年來也有研究者指出，GO-SELEX存在著寡核苷酸自解離、靶標(biāo)可能同樣被GO吸附的問題［41］。幾種SELEX的常見策略見圖4。

Fig.4 Several common strategies for SELEX圖4 幾種SELEX的常見策略

另外，甾體激素含有疏水的甾體母核結(jié)構(gòu)，水溶性差，在篩選適配體方面也更具挑戰(zhàn)，因?yàn)橛H水的核酸適配體沒有多種疏水基團(tuán)來構(gòu)建和調(diào)整疏水的“口袋”與靶標(biāo)進(jìn)行對(duì)接，這也是一個(gè)值得探究的問題。Yang等［46］通過5種嚴(yán)格的篩選方式獲得了三類甾體激素的高親和力適配體，發(fā)現(xiàn)中等長(zhǎng)度的天然核苷酸鏈（<40個(gè)核苷酸）具有較廣的識(shí)別范圍，具有四向連接和4×GN的基序可形成疏水腔，易與甾體母核相互作用。關(guān)于疏水小分子的適配體篩選，也有研究者通過在結(jié)合緩沖液中加入甲醇、二甲亞砜或吐溫，盡可能溶解難溶的靶標(biāo)，在靠前的篩選輪次中增大靶標(biāo)濃度以富集候選適配體，最后的輪次中減少靶標(biāo)的濃度來提高選擇的嚴(yán)格程度，這樣也能成功得到難溶性小分子靶標(biāo)的高親和力、高特異性適配體［47］。下面對(duì)部分已報(bào)道的甾體激素適配體根據(jù)分子結(jié)構(gòu)和功能的不同分類進(jìn)行總結(jié)。

2.1 雌激素

雌激素的代表性激素是E2，是適配體研究最多的一類甾體激素。最早報(bào)導(dǎo)的E2適配體出現(xiàn)在2007年。Kim等［8］使用傳統(tǒng)SELEX技術(shù)，將E2固定化，經(jīng)過7輪選擇后分離出了E2的10條單鏈DNA適配體，并通過平衡過濾法測(cè)得適配體的KD在0.1～3 μmol/L之間，進(jìn)行電化學(xué)傳感器的特異性測(cè)試時(shí)，發(fā)現(xiàn)此適配體對(duì)1-氨基蒽醌和2-甲氧基萘這兩種結(jié)構(gòu)相似物質(zhì)幾乎無親和力，具有較好的特異性。Alsager等［48］在2014年同樣使用傳統(tǒng)SELEX技術(shù)將靶標(biāo)固定化，經(jīng)過18輪選擇后，得到了長(zhǎng)度為75 mer的適配體，將此適配體與納米顆粒進(jìn)行偶聯(lián)得適配體-納米顆粒，加入一系列濃度的E2與適配體-納米顆粒在2 mmol/L Tris-HCl緩沖液中共孵育、離心，通過熒光分光光度計(jì)檢測(cè)上清液的E2的濃度，計(jì)算、擬合得到此適配體的KD為50 nmol/L，特異性實(shí)驗(yàn)表明，此適配體不區(qū)分E2、P4和TES，由于都存在甾體母體結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)上只有細(xì)微差別，然而，對(duì)于不屬于類固醇激素家族的分子（例如雙酚A和雙酚F），可以實(shí)現(xiàn)極好的區(qū)分?？梢钥闯觯槍?duì)相同的靶標(biāo)，采用相同的篩選方法，不同的核酸庫、篩選輪次和親和力表征方法，最后得到的適配體序列、親和力和特異性也不同。

經(jīng)SELEX篩選得到的適配體序列中通常含有冗余堿基，這些堿基既不與靶標(biāo)分子相互結(jié)合，也不起接觸支撐作用［49］。在適配體傳感器設(shè)計(jì)中，這些冗余堿基可能并不利于適配體與靶標(biāo)結(jié)合時(shí)復(fù)雜空間結(jié)構(gòu)的形成［50］，還會(huì)干擾適配體與納米材料結(jié)合過程，影響材料復(fù)合效果［51-52］；Manimala等［53］也證實(shí)更短的適配體序列擁有更好的組織穿透力。因此，許多研究者將目光轉(zhuǎn)為將適配體截短，保留適配體核心作用部位來達(dá)到優(yōu)化的目的。Liu等［54］在原長(zhǎng)76 mer的E2適配體截分為兩個(gè)小片段（圖5），期望提高此適配體基于納米金比色法檢測(cè)E2的靈敏度，結(jié)果表明，分裂后的P1+P2建立的比色傳感器將檢測(cè)限（LOD）提高了10倍，可以檢測(cè)到低至0.1 μg/L的E2，分裂后的P1+P2對(duì)雌三醇、E1和19-去甲睪酮的分辨力雖較原長(zhǎng)適配體略有降低，卻仍保留著區(qū)分雌激素樣化合物雙酚A和己烯雌酚的能力。Alsager等［9］通過刪除核酸適配體序列中多余的側(cè)翼核苷酸，對(duì)E2適配體進(jìn)行了截短優(yōu)化，生成了長(zhǎng)度為35 mer和22 mer的適配體，利用紫外可見分光光度法測(cè)得KD分別為14 nmol/L和11 nmol/L，并發(fā)現(xiàn)截短后的適配體對(duì)E2的比色檢測(cè)靈敏度可以提高25倍，在特異性方面保持著對(duì)雌激素樣化合物雙酚A和雙酚F的分辨力。Qiao等［13］同樣對(duì)2007年報(bào)道的原始E2適配體進(jìn)行了截短，在不同的位點(diǎn)保留了發(fā)夾結(jié)構(gòu)、內(nèi)環(huán)和多環(huán)，并保留適當(dāng)?shù)碾p螺旋區(qū)域，這些特殊結(jié)構(gòu)通常被認(rèn)為是最小的結(jié)構(gòu)域，得到了具有不同序列的新型截短適配體，其中長(zhǎng)度為15 mer的E09適配體對(duì)E2有著較高的親和力，且保留著對(duì)雙酚A等物質(zhì)的分辨力，在E2的分析檢測(cè)中有著極大的應(yīng)用潛力。

Fig.5 Secondary structure of the E2 aptamer with length of 76 mer［54］圖5 原長(zhǎng)76 mer的E2適配體的二級(jí)結(jié)構(gòu)［54］

為了提高篩選適配體的特異性，Vanschoenbeek等［55］實(shí)現(xiàn)了結(jié)合E2結(jié)構(gòu)上環(huán)戊二氫菲環(huán)的不同結(jié)構(gòu)部分的兩組適配體篩選（圖6），他們將兩個(gè)核酸文庫分別建立了SELEX A和SELEX B篩選程序，兩個(gè)篩選程序均通過反復(fù)的正、反選擇進(jìn)行。在SELEX A中，以E2為正分子和結(jié)構(gòu)類似物地塞米松作為反分子選擇，產(chǎn)生了特異性結(jié)合E2環(huán)戊烷并多氫菲B、C、D環(huán)上端的適配體；在SELEX B中，以E2作為靶分子進(jìn)行正選擇，以結(jié)構(gòu)類似物去甲睪酮作為反分子選擇了針對(duì)E2的羥基化芳香A環(huán)的適配體。在兩種方法的正選擇步驟中，將E2用作靶標(biāo)分子，以確保兩組都能夠結(jié)合E2。在反選擇步驟中，使用地塞米松或去甲睪酮來將兩組適配體集引導(dǎo)至E2的不同官能團(tuán)，以此達(dá)到能篩選出能夠特異性結(jié)合E2某部分特定官能團(tuán)的適配體。利用表面等離子共振技術(shù)測(cè)得兩種適配體對(duì)E2的KD分別為36 μmol/L和0.9 μmol/L。在驗(yàn)證適配體的特異性時(shí)，選用了幾種甾體結(jié)構(gòu)物質(zhì)——EE、雄烯二酮、可的松、脫氧膽酸、E1、TES等6種類固醇激素。在SELEX A中得到的適配體對(duì) E2、EE和TES均有較強(qiáng)的親和作用，對(duì)其他激素有不同程度的結(jié)合。其中一條適配體對(duì)E2的親和力明顯高于EE和TES，且對(duì)雄烯二酮、可的松、脫氧膽酸、E1這幾種物質(zhì)無結(jié)合現(xiàn)象。在SELEX B中得到的適配體中對(duì)E2、EE和E1均有結(jié)合現(xiàn)象，其中，對(duì)EE的結(jié)合力強(qiáng)于E2，對(duì)E1的結(jié)合力弱于E2，但對(duì)其他激素?zé)o結(jié)合。這種針對(duì)E2的不同官能團(tuán)具有親和力的適配體可以應(yīng)用于開發(fā)交叉反應(yīng)性適配體傳感器，為未來廣泛甾體激素的現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)提供了研究基礎(chǔ)，但目前還未有學(xué)者將此類適配體應(yīng)用到傳感器設(shè)計(jì)中。

Fig.6 Schematic illustration of the chemical structure of E2 with the most crucial epitopes for binding of aptamers of SELEX A and SELEX B圖6 SELEX A 和SELEX B 中產(chǎn)生的適配體結(jié)合E2的最關(guān)鍵表位化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖

2.2 雄激素

TES是最常見的具有甾體結(jié)構(gòu)的雄性激素。Skouridou等［14］首次在2017年運(yùn)用磁珠-SELEX，對(duì)TES的適配體進(jìn)行了正、反選擇，以磁珠為載體，將TES固定在磁珠上進(jìn)行正選擇，使用牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）作為反選擇分子可除去對(duì)蛋白質(zhì)分子具有親和力的序列來增強(qiáng)適配體的特異性，使用P4、E2和達(dá)那唑作為反選擇分子去除可與TES類似結(jié)構(gòu)結(jié)合的適配體序列。最后得到了10個(gè)適配體候選物，使用微量熱泳動(dòng)法測(cè)得了其中的一個(gè)潛在G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)的適配體T5的KD為5.7 nmol/L，證實(shí)了對(duì)睪酮的高親和力，在特異性方面，此適配體與P4結(jié)合較弱，與E2沒有結(jié)合。

19-去甲睪酮（19-nortestosterone，19-NT）是一種將雄性激素經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾后得到的雄性作用減弱、同化作用增強(qiáng)的合成甾體激素。目前尚未有19-NT的特異性適配體篩選成功的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。白文薈［56］利用其結(jié)構(gòu)類似物——截短后的原始E2適配體進(jìn)行親和力驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)片段化后的原始E2適配體對(duì)19-NT具有很高的親和性，并設(shè)計(jì)了適配體夾心熒光猝滅法實(shí)現(xiàn)了對(duì)19-NT的快速檢測(cè)。

2.3 孕激素

Jimenez等［15］首次對(duì)P4適配體進(jìn)行了篩選，得到了命名為P4G13的最佳適配體，長(zhǎng)度為60 mer。通過電化學(xué)阻抗譜和熒光分析法計(jì)算得到適配體的KD為17 nmol/L，且適配體具有較好的特異性，與E2和炔諾酮有較弱結(jié)合。同樣，為了優(yōu)化此P4適配體，Alhadrami等［16］在2017年對(duì)其進(jìn)行了截短，通過在不同位點(diǎn)用熒光素標(biāo)記不同的截短適配體合成FDNA，以猝滅劑標(biāo)記DNA互補(bǔ)序列為QDNA，設(shè)計(jì)了截短的適配體/DNA雙鏈結(jié)構(gòu)。最初的雙鏈結(jié)構(gòu)中，熒光團(tuán)和猝滅劑密切接觸，熒光強(qiáng)度最小。然而，在P4存在的情況下，由于與靶標(biāo)結(jié)合后適配體的構(gòu)象發(fā)生變化，導(dǎo)致FDNA、QDNA解離，熒光強(qiáng)度增加。其中一個(gè)被截短的適配體顯示出對(duì)P4的高親和力，同時(shí)保留了特異性，與E2、雙酚A和維生素D有較弱結(jié)合，截短后長(zhǎng)度為25 mer，使用熒光檢測(cè)法測(cè)得KD為2.1 nmol/L，比原始適配體提高了16倍。截短的P4適配體被開發(fā)為新型的熒光適配體傳感器，已用于自來水和尿樣中孕酮的檢測(cè)。

2.4 皮質(zhì)激素

COR是典型的皮質(zhì)激素，張嶺等［18］在2011年通過靶標(biāo)誘導(dǎo)變構(gòu)解離SELEX技術(shù)對(duì)COR適配體進(jìn)行了篩選，以磁珠為介質(zhì)，氨基化的寡聚核苷酸序列（NH2-P3）在1,4-苯二異硫氰酸酯的作用下與氨基磁珠偶聯(lián)，NH2-P3與核酸文庫可通過堿基互補(bǔ)配對(duì)將文庫固定。加入靶標(biāo)孵育，當(dāng)COR存在時(shí)，與隨機(jī)序列相互作用導(dǎo)致核酸序列從磁珠上解離；收集解離的核酸序列，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制備次級(jí)文庫，再進(jìn)行第2輪的篩選，獲得與靶標(biāo)特異結(jié)合的核酸適配體。12輪篩選后，測(cè)序獲得10個(gè)適配體，組成上均為高G含量的序列。

Martin等［17］也在2014年使用Capture-SELEX對(duì)COR適體進(jìn)行了篩選，將生物素化DNA探針固定在鏈霉親和素包被的磁珠上，捕獲探針與DNA文庫的5'區(qū)域互補(bǔ)。當(dāng)COR被添加到含有DNA文庫的磁珠溶液中時(shí)，結(jié)合序列與靶標(biāo)相互作用時(shí)發(fā)生構(gòu)象變化，并從磁性珠子上分離、洗脫下來。從第3輪開始，進(jìn)行反選擇步驟，將P4添加到DNA文庫與磁珠的孵育池中，丟棄洗脫的序列，并將COR加入到文庫中，保持與cDNA/磁珠的結(jié)合。最后使用微量熱泳動(dòng)法測(cè)得其中一條適配體的KD為6.9 μmol/L。此適配體也具有較好特異性，可區(qū)分去甲腎上腺素、腎上腺素和膽酸。

Jauset-Rubio等［36］在 2019年利用 counter-SELEX、高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)等工具，在一鍋選擇中實(shí)現(xiàn)了對(duì)3個(gè)不同但結(jié)構(gòu)相似的甾體激素——E2、P4和TES的篩選。結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明，每種激素的適配體對(duì)各自的靶標(biāo)均具有高親和力，并且計(jì)算得到的KD類似于先前報(bào)道的使用傳統(tǒng)SELEX方法選擇的甾體激素適配體。最后，將篩選出的適配體應(yīng)用于微量滴定板分析中，還對(duì)每種靶標(biāo)的適配體與其他兩種非靶甾體進(jìn)行了檢測(cè)，證明了這些適配體的特異性［36］。已有報(bào)道的部分甾體激素適配體的篩選策略、序列及長(zhǎng)度、篩選體系、表征方法和親和性如表2所示。

Table 2 The isolation strategy,sequence and length,buffer,characterization method,affinity and specificity of some steroid hormone aptamers have been reported表2 已有報(bào)道的部分甾體激素核酸適配體的篩選策略、序列及長(zhǎng)度、篩選體系、表征方法、親和性和特異性

3 計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)應(yīng)用于甾體激素適配體的研究

目前已有大量的研究報(bào)道各種核酸適配體的先進(jìn)篩選方法，并開發(fā)了多樣的生物化學(xué)傳感器，但核酸適配體與靶標(biāo)的相互作用機(jī)制研究卻相對(duì)較少，適配體-靶標(biāo)作用體系的物理特征仍不明晰，如何進(jìn)行適配體序列的優(yōu)化還尚待解決，這也限制核酸適配體的廣泛應(yīng)用。近年來各種生物信息學(xué)工具開始在生物技術(shù)研究中大放異彩，已有多位研究者利用計(jì)算機(jī)輔助手段對(duì)適配體和靶標(biāo)進(jìn)行研究［57-60］，在借助計(jì)算機(jī)技術(shù)對(duì)核酸適配體建模及適配體的計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)中，使用到一系列的計(jì)算機(jī)方法，如分子對(duì)接、分子動(dòng)力學(xué)和統(tǒng)計(jì)分析［61］。常見的計(jì)算機(jī)輔助適配體篩選的經(jīng)典流程從結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)建模開始，需要對(duì)核酸適配體及靶標(biāo)進(jìn)行3D建模［62］；然后將適配體與靶標(biāo)進(jìn)行分子對(duì)接，接下來進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，這一步可以評(píng)估適配體-靶標(biāo)復(fù)合物的穩(wěn)定性，并以更高的精度確定結(jié)合能；接著，分析適配體與靶標(biāo)的相互作用，并對(duì)所研究的適配體進(jìn)行突變；隨后返回至建模、分子對(duì)接等步驟以找到與靶標(biāo)結(jié)合力更高的適配體［59，63-64］。

完整的計(jì)算機(jī)輔助適配體后優(yōu)化過程通常步驟較多、耗時(shí)較長(zhǎng)，也有部分研究者根據(jù)現(xiàn)有的研究基礎(chǔ)以及現(xiàn)實(shí)需要，通過分析適配體的結(jié)構(gòu)和分子對(duì)接等方式為適配體的開發(fā)、優(yōu)化和應(yīng)用提供理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

3.1 通過適配體的結(jié)構(gòu)輔助篩選

核酸適配體與靶標(biāo)的高度親和力來源于它多樣的空間結(jié)構(gòu)，這種豐富的空間結(jié)構(gòu)通常由一些小的結(jié)構(gòu)功能單元組成，如莖環(huán)、G-四聯(lián)體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)等。在甾體激素適配體的研究中，一種是小的結(jié)構(gòu)功能單元與適配體的功能探索研究。Vanschoenbeek等［55］在針對(duì)E2結(jié)構(gòu)中的環(huán)戊四氫菲和羥基芳香烴兩個(gè)官能團(tuán)分別進(jìn)行適配體篩選時(shí)，使用Mfold軟件模擬適配體，發(fā)現(xiàn)可識(shí)別環(huán)戊四氫菲位點(diǎn)的適配體序列中，68%的序列存在3個(gè)通過公共交叉點(diǎn)連接的雙螺旋臂組成的三通結(jié)構(gòu)。Kato等［65］也發(fā)現(xiàn)適配體的三通結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)在結(jié)合同樣含甾體結(jié)構(gòu)的膽酸適配體中，預(yù)測(cè)可能是三個(gè)莖連接的交叉點(diǎn)形成疏水腔與膽酸可以相互作用。后來，Yang等［66］利用一個(gè)定向生成三通結(jié)構(gòu)的DNA庫生成了一系列三向連接的適配體，這些適配體能以不同的親和力和選擇性與四種甾體物質(zhì)結(jié)合。在定向結(jié)合E2結(jié)構(gòu)的羥基芳香烴結(jié)構(gòu)的適配體中，Vanschoenbeek等［55］使用QGRS映射器預(yù)測(cè)適配體則存在G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)。G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)是將一個(gè)共同的支架與在目標(biāo)識(shí)別中起作用的不同環(huán)基元結(jié)合在一起，G-四聯(lián)結(jié)構(gòu)允許增強(qiáng)疏水性結(jié)合各種類型的目標(biāo)［5，67］。Skouridou等［14］在關(guān)于TES的適配體篩選結(jié)果中，使用Mfold軟件預(yù)測(cè)了10個(gè)適配體候選物可能的構(gòu)象，發(fā)現(xiàn)幾個(gè)適配體存在多個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，以及上述結(jié)合疏水分子中常見的三通結(jié)構(gòu)；其中也有一個(gè)特殊的適配體T5，其構(gòu)象更簡(jiǎn)單，G含量高達(dá)35%，使用QGRS映射器預(yù)測(cè)適配體中存在著G-四聯(lián)體的構(gòu)象。張嶺等［18］對(duì)皮質(zhì)醇的適配體篩選中，獲得10個(gè)皮質(zhì)醇的適配體候選物。序列分析顯示，特異核酸適配體為高G含量核酸序列，軟件預(yù)測(cè)其中8個(gè)序列主要以G-四聯(lián)體二級(jí)結(jié)構(gòu)為主。預(yù)測(cè)所有核酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)，存在著G-四聯(lián)體、發(fā)夾、莖環(huán)等特異性結(jié)構(gòu)。后來，Jauset-Rubio等［36］在對(duì)幾種甾體激素適配體的一鍋選擇中，也使用Mfold軟件在25℃，100 mmol/L NaCl和2 mmol/L MgCl2的條件下對(duì)E2、P4和TES適配體的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，也存在多個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)。

綜上，研究者們對(duì)甾體激素中E2、P4、TES和皮質(zhì)醇的適配體結(jié)構(gòu)的大量研究，可以找出一些共同點(diǎn)，適配體在與甾體結(jié)構(gòu)相互作用過程中，是通過豐富的空間結(jié)構(gòu)與靶標(biāo)產(chǎn)生各種力的作用，這種豐富的空間結(jié)構(gòu)由一些小的結(jié)構(gòu)功能單元組成，如莖環(huán)、G-四聯(lián)體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)等，其中G-四聯(lián)體、三通結(jié)構(gòu)在甾體激素的適配體中出現(xiàn)得最多。有研究者指出，在進(jìn)行對(duì)甾體激素的實(shí)地檢測(cè)分析時(shí)，待測(cè)的溶液可以加入Mg2+、K+和Na+等離子，有助于G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)的形成，從而穩(wěn)定測(cè)量的條件，實(shí)現(xiàn)對(duì)甾體激素的快速精準(zhǔn)分析［18］。

3.2 通過分子對(duì)接輔助篩選

另外一種常見的計(jì)算機(jī)輔助適配體篩選的方式就是分子對(duì)接，分子對(duì)接相比于結(jié)構(gòu)分析更加直觀，可以通過建模、對(duì)接和打分的流程來研究分子間相互作用并預(yù)測(cè)其結(jié)合模式和親和力。常見的可用于核酸適配體與靶標(biāo)的分子對(duì)接軟件有ZDOCK、NPDOCK、AutoDock和AutoDock Vina等［68］。但由于預(yù)測(cè)軟件無法考慮到體系中多種復(fù)雜因素，通過預(yù)測(cè)軟件獲得的三級(jí)結(jié)構(gòu)精確度不高，與實(shí)際情況的適配體結(jié)構(gòu)差距較大，往往需要通過GROMACS 等分子動(dòng)力學(xué)軟件重新計(jì)算出體系中適配體最合適的分子結(jié)構(gòu)。分子動(dòng)力學(xué)軟件主要是依靠牛頓力學(xué)的基本原理，模擬分子間的相互作用和運(yùn)動(dòng)變化，可以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)分子間的結(jié)合模式和結(jié)合能力，直觀地展現(xiàn)分子間發(fā)生相互作用的動(dòng)態(tài)過程［61］。

甾體激素中關(guān)于E2適配體的結(jié)構(gòu)與功能研究最多。Hilder等［11］運(yùn)用剛性分子對(duì)接、分子動(dòng)力學(xué)模擬了2017年之前報(bào)道的和自己設(shè)計(jì)的E2適配體與E2相互作用時(shí)的特異性空間結(jié)構(gòu)，并得出重要結(jié)論，E2與適配體相互作用時(shí)會(huì)結(jié)合到適配體共有的胸腺嘧啶環(huán)區(qū)域，且與E2有高親和力的適配體存在著四個(gè)重要特征：a.適配體存在由T或G堿基組成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)；b.環(huán)的大小和結(jié)構(gòu)會(huì)影響與E2的結(jié)合強(qiáng)度；c.G與E2的結(jié)合比T強(qiáng)；d.適配體與E2的結(jié)合力主要是E2分子中芳香環(huán)與胸腺嘧啶環(huán)區(qū)的核酸堿基之間的范德華力。該研究證明了分子動(dòng)力學(xué)模擬技術(shù)在適配體科學(xué)研究中的有效性。

Eisold等［69］使用分子對(duì)接、分子動(dòng)力學(xué)模擬研究了截短后的35 mer E2適配體在水溶液中與E2的相互作用特點(diǎn)，對(duì)E2適配體的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（圖7）分析了適配體與E2之間的氫鍵、水介導(dǎo)的氫鍵、π-π堆積和疏水作用力等。研究發(fā)現(xiàn)，與E2強(qiáng)烈相互作用的優(yōu)勢(shì)堿基是T12、T24和C26、E2與適配體的這幾個(gè)堿基形成非共價(jià)鍵，并貢獻(xiàn)了大部分的結(jié)合能。除上述的優(yōu)勢(shì)堿基外，還有與E2距離較小的堿基G11、T12、G23和T25，也參與了與E2的相互作用。由于E2是疏水小分子且為剛性骨架，疏水相互作用是評(píng)估E2結(jié)合的關(guān)鍵，該研究對(duì)非選擇性疏水作用和水介導(dǎo)的氫鍵也進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)它們也有助于E2在適配體結(jié)構(gòu)內(nèi)的結(jié)合；同時(shí)，作者也確定了適配體的5'和3'端不與E2產(chǎn)生任何相互作用，因此適配體可以自由地在兩端被固定。適配體與E2的相互作用時(shí)的空間構(gòu)象如圖8所示。此項(xiàng)研究對(duì)有針對(duì)性地設(shè)計(jì)適配體結(jié)構(gòu)提供了實(shí)踐基礎(chǔ)，有助于實(shí)現(xiàn)特異性結(jié)合E2的適配體優(yōu)化。

Fig.7 The secondary structure（a）and tertiary structure（b）of E2 aptamer with length of 35 mer［69］圖7 長(zhǎng)度為35 mer的E2適配體的二級(jí)結(jié)構(gòu)（a）及三級(jí)結(jié)構(gòu)（b）［69］

Fig.8 Schematic representation of the spatial conformation of the 35 mer aptamer interacting with E2［69］圖8 35 mer適配體與E2相互作用的空間構(gòu)象示意圖［69］

4 適配體傳感器在甾體激素檢測(cè)中的應(yīng)用

適配體傳感器，即基于適配體構(gòu)建的生物傳感器?，F(xiàn)階段，基于不同原理的適配體傳感器已被開發(fā)用于檢測(cè)甾體激素，包括熒光適配體傳感器、電化學(xué)適配體傳感器、比色適配體傳感器等。毫無疑問，基于適配體識(shí)別的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，可用于甾體激素的適配體傳感器真正進(jìn)入應(yīng)用市場(chǎng)已經(jīng)勝利在望。

4.1 電化學(xué)適配體傳感器

電化學(xué)適配體傳感器，是以適配體特異性識(shí)別靶標(biāo)為基礎(chǔ)，將適配體作為識(shí)別原件，通過分析目標(biāo)物結(jié)合前后電極表面的電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)變化來對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定量檢測(cè)。適配體可以通過吸附、自組裝和共價(jià)鍵結(jié)合等方式固定在電極表面。電化學(xué)檢測(cè)法具有靈敏度高、測(cè)量范圍寬、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)［70］。

根據(jù)是否有標(biāo)記物標(biāo)記，可分為標(biāo)記型和非標(biāo)記型的電化學(xué)適配體傳感器。非標(biāo)記型是指不在適配體標(biāo)記電活性信號(hào)分子，適配體固定到電極表面后直接與目標(biāo)物結(jié)合反應(yīng)，會(huì)產(chǎn)生電流、電壓或阻抗等變化，從而確定待測(cè)物質(zhì)的量。Jimenez等［15］構(gòu)建了用于快速檢測(cè)P4的阻抗型電化學(xué)傳感器。通過自組裝將核酸適配體固載在工作電極表面上，引入目標(biāo)物，適配體與目標(biāo)物特異性結(jié)合，使得適配體構(gòu)象發(fā)生改變，電子轉(zhuǎn)移阻抗增強(qiáng)，該傳感器對(duì)P4的線性檢測(cè)范圍為10～60 μg/L，檢出限可達(dá)0.90 μg/L。標(biāo)記型電化學(xué)適配體傳感器是將具有電活性或催化活性的標(biāo)記物通過物理吸附或化學(xué)修飾的方式標(biāo)記在適配體上，通過適配體結(jié)合靶標(biāo)物質(zhì)前后電活性物質(zhì)產(chǎn)生的電信號(hào)變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)的定量檢測(cè)。常見的功能性標(biāo)記物有亞甲基藍(lán)（MB）、辣根過氧化物酶（HRP）、二茂鐵（Fc）和生物酶等［71］。劉玉潔等［72］用制備的二硫化鈷納米片與金納米顆粒的復(fù)合物修飾玻碳電極，引入E2適配體及其部分互補(bǔ)的富G雜交鏈，以MB為電化學(xué)指示劑構(gòu)建電化學(xué)傳感器實(shí)現(xiàn)了對(duì)E2的測(cè)定，該傳感器具有一個(gè)較寬的線性檢測(cè)范圍（1.0×10-9～1.0×10-12mol/L），檢測(cè)限可達(dá)7.2×10-13mol/L。

與標(biāo)記型電化學(xué)傳感器相比，非標(biāo)記型操作簡(jiǎn)單、無需標(biāo)記、且對(duì)靶分子影響小，從實(shí)際應(yīng)用出發(fā)，非標(biāo)記性電化學(xué)傳感器的優(yōu)勢(shì)較大［73］。考慮到甾體激素的檢測(cè)環(huán)境多樣化，小型化、微型化的電化學(xué)傳感設(shè)備，是現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)較為理想的檢測(cè)裝置。隨著近年來納米技術(shù)的不斷成熟，適配體傳感器設(shè)計(jì)策略不斷得到優(yōu)化，這為開發(fā)檢測(cè)甾體激素的電化學(xué)適配體傳感器的發(fā)展起到了積極的推動(dòng)作用。

4.2 熒光適配體傳感器

熒光檢測(cè)法是基于熒光染料、熒光基團(tuán)、熒光納米材料等作為信號(hào)實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)的檢測(cè)，具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、易自動(dòng)化的優(yōu)點(diǎn)。有研究者根據(jù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）原理實(shí)現(xiàn)了對(duì)甾體激素的特異性檢測(cè)。劉曉等［74］以黑磷晶體為原料，利用超聲輔助液相剝離技術(shù)制備了黑磷納米片作為熒光受體，基于6-羧基熒光素標(biāo)記的適配體與黑磷納米片之間的FRET轉(zhuǎn)移機(jī)制，建立了熒光適配體傳感器，可對(duì)E2進(jìn)行快速定量檢測(cè)，檢測(cè)限為1.0 μg/L。史學(xué)麗等［75］基于FRET原理，采用水熱合成法制備了銪摻雜的鎵酸鋅長(zhǎng)余輝納米顆粒，建立了一種基于熒光適配體傳感器E2定量分析方法，檢測(cè)限為0.4 μg/L，該適配體傳感器在檢測(cè)目標(biāo)激素時(shí)靈敏度高、特異性強(qiáng)，并有效避免了牛奶基質(zhì)等因素產(chǎn)生的熒光干擾。

4.3 比色適配體傳感器

納米金（AuNPs）是直徑在1～100 nm的微小顆粒，制備簡(jiǎn)單且吸附力強(qiáng)，在分散狀態(tài)下呈紅色，發(fā)生凝聚后變?yōu)樗{(lán)色。適配體可以吸附到AuNPs表面，保護(hù)AuNPs免于在高鹽度下聚集變藍(lán)；當(dāng)加入靶標(biāo)后，適配體與靶標(biāo)高度親和，從AuNPs上解離下來與靶標(biāo)結(jié)合，使AuNPs粒子在高鹽度下聚集，溶液由紅變藍(lán)?；谶m配體的AuNPs比色法結(jié)果肉眼可見、操作簡(jiǎn)單快速、易于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

王欣等［76］建立了基于核酸適配體的AuNPs比色傳感器檢測(cè)E2，將E2特異性適配體作為傳感探針，實(shí)驗(yàn)得出，當(dāng)AuNPs與核酸適配體濃度比為1∶11 000時(shí)，在牛奶中E2的檢測(cè)限為0.183 nmol/L。陳愛亮課題組［77］基于AuNPs比色原理，構(gòu)建了快速檢測(cè)E2的AuNPs比色傳感器，可在20 min內(nèi)完成檢測(cè)，靈敏度可達(dá)10 μg/L，線性范圍為10～10 000 μg/L。由于長(zhǎng)鏈適配體與AuNPs親和力高于短鏈適配體的親和力，為了提高AuNPs比色法檢測(cè) E2 的靈敏度，陳愛亮等［54］又將76 mer 適配體剪切為P1+P2兩段，并建立了E2的比色檢測(cè)方法，結(jié)果顯示靈敏度提高了10倍，檢測(cè)限可達(dá)0.1 μg/L。2015年，Alsager等［9］利用圓二色譜測(cè)定到該課題組2014年篩選到的E2適配體上有3個(gè)莖環(huán)，結(jié)合AuNPs適配體比色法并根據(jù)3個(gè)環(huán)及與靶標(biāo)的結(jié)合位點(diǎn)，將該75 mer的適配體截短為35 mer和22 mer兩個(gè)短鏈適配體，并建立AuNPs比色傳感器檢測(cè)E2，該方法的檢測(cè)限為200 pmol/L，檢測(cè)靈敏度提高了25倍。在此基礎(chǔ)上，Martin等［17］在2014年使用Capture-SELEX技術(shù)篩選得到COR適配體后，基于AuNPs建立了比色傳感器，檢測(cè)范圍為150～600 nmol/L，可滿足人血清中游離皮質(zhì)醇的濃度變化范圍（100～500 nmol/L），此傳感器具有較好選擇性，對(duì)其他應(yīng)激生物標(biāo)志物如腎上腺素和其他結(jié)構(gòu)類似的分子無反應(yīng)?；诤怂徇m配體的AuNPs比色分析檢測(cè)方法具有較高的靈敏度和特異性，簡(jiǎn)單、快速，具有良好的應(yīng)用價(jià)值，可開發(fā)為現(xiàn)場(chǎng)及時(shí)檢測(cè)儀器。需要說明的是，由于比色法多采用溶液相均相體系進(jìn)行研究，在進(jìn)行實(shí)際樣品分析時(shí)，AuNPs的選擇性會(huì)受到金屬離子或其他雜質(zhì)的影響，部分雜質(zhì)和靶標(biāo)本身也會(huì)誘導(dǎo)AuNPs聚集［78］，這些因素會(huì)直接影響到結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，因此在實(shí)際操作過程中，要考慮各種因素干擾以及靶標(biāo)物質(zhì)是否會(huì)引起AuNPs聚集，聚焦抗干擾能力提升是比色法的重要研究方向［79］。

5 總結(jié)與展望

適配體在甾體激素的檢測(cè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用空間，利用適配體識(shí)別甾體靶標(biāo)，建立基于傳感技術(shù)的檢測(cè)方法，有望實(shí)現(xiàn)實(shí)際樣品中甾體激素的快速和靈敏檢測(cè)。目前，針對(duì)甾體激素的適配體篩選，如文中所述，已有雌激素、雄激素、孕激素和皮質(zhì)激素的報(bào)道，其中E2的研究最為廣泛，然而具有良好應(yīng)用效果的甾體激素的適配體數(shù)量遠(yuǎn)不能滿足實(shí)際需要。目前適配體在甾體激素檢測(cè)領(lǐng)域也還存在諸多限制：a.對(duì)于甾體激素的適配體研究還不夠透徹，適配體篩選仍是一個(gè)較大的工程，小分子靶標(biāo)或是文庫的固定化仍是一個(gè)挑戰(zhàn)，甾體激素適配體的高效篩選仍然有很大的發(fā)展空間；b.還需要深入分析適配體-靶標(biāo)構(gòu)象關(guān)系，深入理解甾體激素的適配體篩選的本質(zhì)問題和SELEX過程存在的不足，建立甾體激素適配體的親和力和特異性一致性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，這也是甾體激素適配體得以廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵；c.關(guān)于甾體激素的生物適配體傳感器已有大量實(shí)驗(yàn)室的研究報(bào)道，真正進(jìn)入市場(chǎng)的適配體傳感器還未有一例，如何把實(shí)驗(yàn)室的研究成果批量、集成生產(chǎn)，轉(zhuǎn)化為靈敏、穩(wěn)定、低成本的快速檢測(cè)設(shè)備（如試紙），還有很長(zhǎng)的路要走。相信在眾多學(xué)者的共同努力下，甾體激素等小分子靶標(biāo)的適配體篩選與應(yīng)用研究將會(huì)越來越成熟，越來越完善。