吳彩虹 韓冬梅 金 昊
(天津市腫瘤醫(yī)院空港醫(yī)院腫瘤精準(zhǔn)檢測與轉(zhuǎn)化中心,天津 300308)
在世界各國,癌癥是死亡的主要原因,也是延長預(yù)期壽命的一個重要障礙。隨著全球人口老齡化,以及癌癥主要危險因素的流行和分布的變化,全球癌癥發(fā)病率和死亡率的負(fù)擔(dān)正在迅速增長。腎癌占全球新發(fā)腫瘤病例的2.2%,占死亡病例的1.8%[1],其全球發(fā)病率正逐步上升,其發(fā)病率僅次于前列腺癌及膀胱癌,占泌尿系統(tǒng)腫瘤第三位。腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是腎臟腫瘤的主要類型,約占腎臟腫瘤的90%~95%[2]。RCC具有較高的局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的頻率,約33%~50%的RCC患者在發(fā)現(xiàn)時已發(fā)生轉(zhuǎn)移[3],從而加重了RCC患者的死亡率。RCC的主要治療手段是手術(shù)切除,對放化療不敏感,放射治療主要用于緩解腫瘤轉(zhuǎn)移或抑制局部腫瘤生長。盡管在腎癌的診斷和治療方面取得了諸多進(jìn)展,但絕大多數(shù)轉(zhuǎn)移性腎癌患者仍然無法治愈。RCC的早期診斷能夠大大提高RCC有效治療的機(jī)會,對于腎癌的有效治療具有十分重要的意義。由于核酸適配體能特異性地識別腎癌細(xì)胞,因此在腎癌診療中的應(yīng)用前景非常廣闊。
核酸適配體是一種具有獨(dú)特三維構(gòu)象的短的單鏈DNA或RNA寡核苷酸,通常由20~60個核苷酸組成。核酸適配體是通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX),從核酸分子文庫中得到的寡核苷酸片段,能夠選擇性地與小分子配體或高親和力的蛋白質(zhì)靶標(biāo)結(jié)合,對靶分子或細(xì)胞具有較高的親和力和特異性,是一類重要的分子靶向配體。SELEX過程最早于1990年實(shí)現(xiàn),由Ellington等[4]和Tuerk等[5]分別在兩篇報道中提出,他們利用SELEX技術(shù)篩選分離出3種與噬菌體T4 DNA及有機(jī)染料特異性結(jié)合的RNA適配體。SELEX技術(shù)是從大量隨機(jī)寡核苷酸庫中選擇目標(biāo)結(jié)合序列的迭代過程。即通過隨機(jī)核酸文庫與目標(biāo)分子/靶分子孵育,以促進(jìn)目標(biāo)與顯示目標(biāo)親和力的寡核苷酸之間形成絡(luò)合物,然后將目標(biāo)結(jié)合的序列從未結(jié)合的文庫池中分離出來,進(jìn)行PCR擴(kuò)增;新的核酸序列(ssDNA/RNA)文庫富含目標(biāo)結(jié)合寡核苷酸,然后與對照靶標(biāo)孵育,將未與對照靶標(biāo)結(jié)合的序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增參與新的選擇循環(huán);繼續(xù)選擇,直到篩選文庫被充分富集,最后將經(jīng)過8~20輪篩選得到的文庫進(jìn)行測序鑒定(圖1)。自核酸適配體的概念誕生以來,經(jīng)過優(yōu)化篩選和技術(shù)改良,目標(biāo)范圍不斷擴(kuò)大,篩選效率和速度得到了很大提升。
Fig.1 Schematic presentation of the aptamer selection圖1 核酸適配體的篩選進(jìn)程模式圖
由于核酸適配體與靶標(biāo)的識別模式和抗原抗體的識別模式十分類似,因此也被稱為“化學(xué)抗體”。核酸適配體憑借自身的種種優(yōu)勢,包括高度特異性、無免疫原性、體積相對較小、可以很容易地通過化學(xué)修飾來穩(wěn)定等,已迅速應(yīng)用于臨床研究中,后來又不斷提高其診斷和治療能力。迄今為止,適配體已被用于治療黃斑變性、腫瘤、糖尿病、炎癥和凝血等。2004年,美國食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)了NeXstar開發(fā)的首個治療性核酸適配體藥物——Macugen,用于治療新血管性老年性黃斑變性(AMD)。后來已有多個核酸適配體成功進(jìn)入了各種治療適應(yīng)癥的臨床試驗(yàn)[6]。
近年來,核酸適配體在癌癥診療領(lǐng)域的應(yīng)用研究受到越來越多的關(guān)注,現(xiàn)已篩選得到一些靶向腎癌的核酸適配體,然后利用核酸適配體與納米材料偶聯(lián)制備成復(fù)合物,進(jìn)行腎癌影像學(xué)診斷及靶向藥物遞送的應(yīng)用研究。本文主要對篩選得到的適配體(表1)及其在腎癌中的應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,希望可以為腎癌的診斷和治療提供新的視角和思路。
Table 1 Aptamers used in renal cell carcinoma表1 RCC相關(guān)核酸適配體
2.1.1 核仁素(nuleolin)
核仁素(nuleolin,NCL)是核仁中含量最多的非核糖體磷酸化蛋白之一,參與包括細(xì)胞黏附、分裂、遷移以及調(diào)控rRNA轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞生長等多種生物進(jìn)程。與正常細(xì)胞或癌前細(xì)胞相比,癌細(xì)胞的表達(dá)水平升高[7]。AS1411是第一個被廣泛用于靶向NCL進(jìn)入癌細(xì)胞的DNA核酸適配體。它是采用非SELEX的方法篩選得到,是一種富含鳥嘌呤堿基的寡核苷酸GROs,被發(fā)現(xiàn)對多種癌細(xì)胞有抗增殖活性[8-9]。AS1411具有從細(xì)胞表面穿梭到大多數(shù)腫瘤細(xì)胞細(xì)胞核的特性,已被證明可選擇性地結(jié)合多種腫瘤細(xì)胞系高表達(dá)的NCL并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡,包括腎癌、乳腺癌和其他腺癌細(xì)胞系[10-11]。在2003年開始的一項(xiàng)針對實(shí)體瘤患者的I期臨床試驗(yàn)中,AS1411在轉(zhuǎn)移性RCC患者中顯示出抗腫瘤活性,在12例轉(zhuǎn)移性RCC患者中產(chǎn)生了一個完全緩解(CR)和一個部分緩解(PR)[12-14]。但在RCC的II期臨床試驗(yàn)中[15],只有一名患者(既往使用≥1種酪氨酸激酶抑制劑治療失敗的轉(zhuǎn)移性腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinomas,ccRCC)患者達(dá)到了PR(總緩解率(overall response rate,ORR)2.9%),治療效果顯著,靶腫瘤病變的總直徑減少了84%。且該患者在研究治療結(jié)束后24個月仍處于PR期,沒有疾病進(jìn)展的證據(jù),也不需要額外的治療[15]?;诤怂徇m配體具有修飾和結(jié)合多種分子的能力,可以偶聯(lián)不同的納米載體,比如脂質(zhì)體、膠束、聚合物納米粒子和量子點(diǎn)等,AS1411核酸適配體已經(jīng)通過負(fù)載納米顆粒靶向腎癌細(xì)胞應(yīng)用于腎癌影像學(xué)診斷或作為靶向配體遞送抗癌藥物研究。
Li等[16]研制了一種 T1-T2雙模造影劑 Fe3O4@mSiO2/PDDA/BSA-Gd2O3納米復(fù)合物,其中BSAGd2O3NPs和Fe3O4NPs分別作為T1和T2核磁共振成像造影劑(MRI CAs),通過與AS1411適配體進(jìn)一步偶聯(lián)后,能在體外靶向腎癌細(xì)胞和小鼠腎臟增強(qiáng)核磁共振成像(MRI)。MRI作為一種無創(chuàng)影像學(xué)診斷技術(shù),具有高三維空間分辨率和深度穿透圖像的能力。通過MRI CAs,正常和病理部位之間的影像對比可以在皮下增強(qiáng)。應(yīng)用比較多的造影劑包括氧化鐵納米顆粒、釓螯合物等。相比傳統(tǒng)的多肽或蛋白質(zhì)配體,核酸適配體具有較強(qiáng)的靶親和力、化學(xué)通用性和較低的成本效益,可以與金屬離子、放射性元素等偶聯(lián)發(fā)揮功能,這使它們成為分子成像的獨(dú)特選擇,通過將核酸適配體探針修飾耦合到適合各種成像技術(shù)的造影劑,可以提供優(yōu)越的體內(nèi)性能,并顯著降低生產(chǎn)成本。由于含釓(Gd)造影劑可能導(dǎo)致一種罕見但極其嚴(yán)重的疾病,即腎源性纖維化。而錳元素(Mn),作為生理代謝的必要元素,既可以有效調(diào)節(jié)機(jī)體生物系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài),又可以在T1加權(quán)成像中跟Gd產(chǎn)生類似的對比度增強(qiáng),使其在MRI中具有潛在的應(yīng)用價值。但有研究表明,錳元素的自由形式可能導(dǎo)致明顯的神經(jīng)毒性[17]。因此,現(xiàn)在通過制備螯合錳、雜化錳劑、大分子錳劑和納米顆粒錳掩蓋劑來解決游離錳的問題。Li等[18]提出了一種用聚乙二醇(PEG)作為溶劑和表面活性劑的一鍋法制備親水性氧化錳納米載體(MnO NPs)的方法,通過引入氨基修飾的AS1411適配體作為靶向分子,與PEG-MnO NPs共價偶聯(lián)探索制備納米探針AS1411-PEG-MnO NPs,發(fā)現(xiàn)其在體外人腎癌細(xì)胞系786-O MRI上可以清晰地顯示人腎癌細(xì)胞。與PEG-MnO NPs相比,AS1411-PEG-MnONPs在786-O中的滯留時間更長。表明PEG-MnO NPs在MRI掃描中作為一種替代造影劑的潛在價值。二硫化鉬量子點(diǎn)(MoS2QDs)作為一種很有前途的量子點(diǎn)納米材料的候選材料,具有高穩(wěn)定性,低毒,以及獨(dú)特的光學(xué)和電子性質(zhì),在催化熒光成像和熒光傳感及生物成像等方面具有潛在的應(yīng)用前景。Zheng等[19]提出了一種新的錳摻雜二硫化鉬量子點(diǎn),即Mn-MoS2QDs,通過“自下而上”的一步水熱技術(shù)用于RCC的MRI成像和細(xì)胞熒光標(biāo)記。利用AS1411適配體提高M(jìn)oS2QDs對RCC的靶向能力,與核酸適配體AS1411結(jié)合后,制備成AS1411-Mn-MoS2QDs,能特異性熒光標(biāo)記腎癌細(xì)胞,并在小鼠的腫瘤區(qū)表現(xiàn)出特異性MRI信號增強(qiáng)。此外,通過血液學(xué)和組織學(xué)分析,核酸適配體AS1411修飾的Mn-MoS2QDs對小鼠的毒性較低??傊珹S1411-Mn-MoS2QDs的開發(fā)為腎透明細(xì)胞癌的精確診斷提供了一種新型的熒光/MRI雙模態(tài)成像探針。
在AS1411作為靶向配體傳遞藥物方面,Li等[20]報道,利用AS1411適配體作為特異性靶向分子,以氧化石墨烯納米板(GO NPs)作為造影劑和藥物納米載體,阿霉素(DOX)作為抗癌藥物,用攜帶氧化釓的牛血清白蛋白氧化釓納米載體(BSA-Gd2O3NPs)制備 GO/BSA-Gd2O3/AS1411-DOX治療納米復(fù)合物,用于腎癌細(xì)胞體外和體內(nèi)的特異性給藥和MRI。該治療性納米復(fù)合物不僅提供了更強(qiáng)的MRI對比增強(qiáng),而且在AS1411核酸適配體的幫助下,抑制了786-O的生長,同時使正常細(xì)胞免受傷害,顯示了特異性的給藥能力。此外,利用GO/BSAGd2O3/AS1411-DOX納米復(fù)合物對786-O在體外和體內(nèi)MRI成像的特異性識別能力進(jìn)一步證明了它們作為腫瘤靶向MRI的治療性納米探針的潛力。將來可以增加組織活體實(shí)驗(yàn)檢測在活體中的治療效果,從而推動適配體偶聯(lián)復(fù)合物在腎癌診療中的臨床應(yīng)用。
2.1.2 程序性死亡蛋白配體1(PD-L1)
程序性死亡蛋白1(programmed death-1,PD-1)與程序性死亡蛋白配體1(programmed death-ligand 1,PD-L1)是一對負(fù)性免疫共刺激分子,靶向免疫檢查點(diǎn)免疫療法已經(jīng)徹底改變了某些癌癥的治療,因此確定免疫檢查點(diǎn)在特定癌癥中的表達(dá)狀態(tài)有助于癌癥診療的臨床決策。大多數(shù)RCC表達(dá)PD-L1,多個涉及ccRCC患者和非透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌患者的系列研究表明,腫瘤細(xì)胞膜中PD-L1的表達(dá)與腫瘤患者更高的Fuhrman分級或TNM分期等侵襲性特征相關(guān)[21-22]。目前,酪氨酸酶抑制劑(TKI)聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑(ICI)或者雙ICI聯(lián)合治療方案已經(jīng)成為晚期腎癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方案。基于核酸適配體的高親和力和特異性,專門識別PD-L1的核酸適配體分子探針開始快速發(fā)展。Malicki等[23]通過SELEX程序鑒定了一個針對PD-L1的單鏈核酸適配體探針2c2s,它是一個特異性識別人類PD-L1細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的DNA核酸適配體,能夠在體外和體內(nèi)特異性檢測腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的PD-L1。以PD-L1生理表達(dá)為特征的腎腺癌細(xì)胞系786-O評估2c2s在細(xì)胞表面檢測PD-L1的能力,786-O細(xì)胞被均勻標(biāo)記,尤其通過腹腔注射Cy5.5-2c2s給藥小鼠(在腎包膜下接種了PD-L1陽性的ccRCC細(xì)胞),用全身成像追蹤標(biāo)記物發(fā)現(xiàn),腫瘤位置與PD-L1特異性適配體的信號之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性,表明2c2s適配體能夠檢測體內(nèi)表達(dá)PD-L1的腫瘤。這更加驗(yàn)證了,適配體與抗體相比,其小尺寸和易標(biāo)記的多功能性為成像響應(yīng)靈活提供了廣泛的機(jī)會。后續(xù)可以進(jìn)一步優(yōu)化評估長期效果,并測試適配體的安全性,有望實(shí)現(xiàn)適配體探針的體內(nèi)腫瘤靶向成像,能夠?qū)⑵鋺?yīng)用到腫瘤的非侵入性診斷中。
除了NCL、PD-L1,在ccRCC中,von Hippel-Lindau(VHL)基因經(jīng)常失活,導(dǎo)致缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)的積累和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的過度表達(dá),而且研究表明,VHL基因失活和VEGF高表達(dá)與腫瘤侵襲性和低生存率相關(guān)[24]。因此,VEGF成為高度血管表型的ccRCC抗血管生成治療的有力靶點(diǎn)。其中一種策略就是通過單克隆抗體或者核酸適配體直接靶向VEGF進(jìn)行抗血管生成治療。利用臨床批準(zhǔn)的VEGF靶向藥物制定的治療方案為ccRCC的治療取得了顯著成果,但患者最終產(chǎn)生的耐藥性影響了長期的效果。有研究表明,將適配體與抗體偶聯(lián)可以增強(qiáng)藥物的腫瘤浸潤性,具有良好的抗腫瘤能力[25]。目前,通過SELEX技術(shù)已經(jīng)鑒定出多種抗VEGF的核酸適配體[26],將適配體與抗體偶聯(lián)的思路應(yīng)用于腎癌的相關(guān)研究中,有望輔助腎癌治療策略的探索。
核酸適配體不僅可以使用純化蛋白質(zhì)作為靶點(diǎn)進(jìn)行篩選,還可以通過細(xì)胞-配體指數(shù)富集系統(tǒng)進(jìn)化(cell-SELEX)的方法在事先不了解靶細(xì)胞分子特征的情況下,生成能夠以其天然構(gòu)象特異性結(jié)合細(xì)胞表面靶分子/生物標(biāo)志物的核酸適配體,尤其對于目前缺少有效的生物標(biāo)志物及明晰的分子異常機(jī)制的RCC意義非凡[27],適配體可以有助于獲得RCC的特異分子譜及新型特異分子探針來促進(jìn)早期診斷和治療。Wang等[28]利用cell-SELEX以ccRCC細(xì)胞系786-O為靶細(xì)胞,胚胎腎細(xì)胞系293T為對照細(xì)胞,開發(fā)了RCC核酸適配體探針W786-1(平衡解離常數(shù)Kd值為(9.4±2.0)nmol/L),結(jié)構(gòu)優(yōu)化產(chǎn)生一個截短的序列W786-1S,只有48個核苷酸,與W786-1對目標(biāo)786-O細(xì)胞的識別能力相似,并初步確定了W786-1的靶標(biāo)為細(xì)胞表面的膜蛋白,即適配體通過膜蛋白識別目標(biāo)786-O細(xì)胞,并在生理溫度下保持良好的結(jié)合親和力和優(yōu)異的選擇性?;谄鋬?yōu)異的靶向性和特異性,W786-1具有作為靶向分子探針用于RCC診斷和治療的巨大潛力。
葉茂等[29]利用已發(fā)表的能夠結(jié)合腫瘤細(xì)胞的核酸適配體,進(jìn)行同源性建模分析,設(shè)計(jì)出全新的核酸序列,將所有篩選獲得的這些序列明確,但功能不明確的核酸序列構(gòu)建成新的文庫Swan Library,然后在新文庫中篩選獲得一條與人腎癌細(xì)胞系786-O結(jié)合,不與人腎成纖維細(xì)胞系KFB細(xì)胞結(jié)合的核酸適配體RCC-H1,其特異性和穩(wěn)定性都較強(qiáng)。序列優(yōu)化獲得的RCC-H1b在荷瘤小鼠腫瘤部位富集明顯,對臨床腎癌組織切片具有良好的識別檢測能力,而與腎正常組織基本不結(jié)合。Zhang等[30]從Swan Library中鑒定出對人RCC細(xì)胞786-O具有高結(jié)合親和力和特異性的核酸適配體SW-4(平衡解離常數(shù)Kd值約為(45.92±5.58)nmol/L),它與人RCC細(xì)胞786-O具有高親和力,但不與上皮細(xì)胞HEK293T或人近端小管上皮細(xì)胞HK-2結(jié)合。序列優(yōu)化的SW-4b具有更好的結(jié)合親和力,且通過小泡介導(dǎo)的內(nèi)吞作用內(nèi)化到靶細(xì)胞中,使該適配體成為基于適配體的藥物遞送系統(tǒng)開發(fā)的理想候選體。體內(nèi)和臨床樣品的熒光成像證實(shí)了SW-4b具有良好的識別能力。最重要的是,SW-4b對786-O細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的抗增殖活性,其作用是在細(xì)胞周期S期阻止進(jìn)展。將來可以進(jìn)一步在荷瘤小鼠身上驗(yàn)證該適配體的腫瘤抑制功能,推動其成為RCC診斷和靶向治療的新工具。
由于腎癌早期無特異性體征和癥狀,主要治療手段是手術(shù)切除,對放化療不敏感,目前RCC的5年生存率總體為74%,局部(III期)患者的5年生存率降至53%,而伴有轉(zhuǎn)移性的腎癌患者5年生存率僅8%[31],因此腎癌的早期診斷能夠大大提高腎癌患者有效治療的機(jī)會。胡小曉等[32]利用tissue-SELEX技術(shù),以臨床腎癌組織為正篩樣本,腎癌癌旁組織為負(fù)篩樣本,篩選獲得一種檢測人腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞的核酸適配體wcq-5,為42個堿基的短鏈核酸序列,通過熒光檢測其與人ccRCC細(xì)胞的結(jié)合親和力較高,解離平衡常數(shù)在納摩爾級別。此外還可連接放射性物質(zhì)、治療性物質(zhì)、生物素或者酶標(biāo)記基團(tuán),發(fā)展為檢測腎癌的新型分子探針,為腎癌的準(zhǔn)確診斷、快速定位、靶向治療和預(yù)后提供有效的工具,推進(jìn)該適配體在腎癌診斷與治療中的應(yīng)用。
核酸適配體憑借自身優(yōu)勢,被證明是多種分子強(qiáng)有力的靶向載體,已有效應(yīng)用于腫瘤相關(guān)領(lǐng)域,包括腫瘤靶向成像、納米級機(jī)械集成、親和純化、生物傳感以及診斷治療等[33],但其開發(fā)和臨床轉(zhuǎn)化正處于起步階段,有許多挑戰(zhàn)還待解決。首先,天然核酸在適配體介導(dǎo)的體內(nèi)治療中生物穩(wěn)定性有限,半衰期也較短。再加上適配體固有的小體積,容易被腎臟系統(tǒng)清除,限制了功能的發(fā)揮,這可能也是適配體在腎癌的應(yīng)用研究進(jìn)展較為緩慢的原因之一。雖然可以通過對適配體加以化學(xué)修飾來增加其半衰期或改變其藥代動力學(xué)特征,但以往利用聚乙二醇修飾的適配體會受到體內(nèi)聚乙二醇抗體的干擾,從而抑制適配體結(jié)合影響療效,還有使用硫代磷酸修飾的核苷酸時,可能存在肝毒性等[34]。其次,可用的適配體數(shù)量仍然非常有限,能夠高效地選擇性能良好的適配體的新策略是未來亟需的。第三,許多適配體-藥物偶聯(lián)物在臨床研究中還未能發(fā)揮其潛力,在合理設(shè)計(jì)偶聯(lián)物方面需要繼續(xù)優(yōu)化,包括提高針對既定癌基因的藥物遞送能力和效率等。
綜上所述,目前已經(jīng)篩選得到一些靶向腎癌的核酸適配體,而且在腎癌診療方面也顯現(xiàn)了良好的研究價值和臨床應(yīng)用前景。尤其晚期腎癌患者轉(zhuǎn)移是其死亡的主要原因,適配體對于抵抗癌癥轉(zhuǎn)移的策略具有先天的優(yōu)勢,它可以通過與癌細(xì)胞內(nèi)部信號通路的分子結(jié)合或者與腫瘤微環(huán)境的多種基質(zhì)細(xì)胞直接相互作用來發(fā)揮其藥理功能[35]。由于細(xì)胞毒性小藥物、TKI或miRNA替代療法等多種抗癌藥物的療效和安全性受到周圍健康細(xì)胞和組織脫靶效應(yīng)的影響,因此,有選擇地將抗癌藥物輸送到目標(biāo)細(xì)胞,既能減少健康組織中嚴(yán)重的不良反應(yīng),又能提高治療效果和癌癥患者的生活質(zhì)量。利用核酸適配體在腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境中較高的組織穿透和細(xì)胞內(nèi)攝取能力,核酸適配體-藥物偶聯(lián)物(ApDC)選擇性地與靶標(biāo)結(jié)合來推動腫瘤特異性藥物更好地發(fā)揮療效。譚蔚泓院士團(tuán)隊(duì)[36]利用全景正電子發(fā)射型計(jì)算機(jī)斷層顯像(TB-PET)連續(xù)獲取的數(shù)據(jù),建立了接近現(xiàn)實(shí)的核酸適配體藥代動力學(xué)PBPK模型,有望用于未來ApDC治療響應(yīng)的預(yù)測。隨著更多針對腎癌的核酸適配體以及適配體偶聯(lián)物的開發(fā)及應(yīng)用研究,將大大有助于腎癌相關(guān)發(fā)病機(jī)制的探究,為腎癌的精準(zhǔn)診療提供一種新的策略。