賈海靜 高亞菁 婁新徽*

（首都師范大學化學系，北京 100048）

核酸適配體是一類具有特異性分子識別能力的單鏈DNA或者RNA分子，通過指數富集的配體系統(tǒng)進化技術（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）經過體外篩選得到［1］。核酸適配體的靶標類型極為廣泛，包括小分子、蛋白質、離子、細胞、細菌、組織切片等。核酸適配體相比抗體具有熱穩(wěn)定性高、便于化學合成與修飾、免疫原性低等優(yōu)點，在生物分析、生物醫(yī)學、生物技術、傳感技術等眾多領域引起廣泛關注。

1990年美國的Gold課題組［2］和Szostak課題組［3］通過基本相同的體外篩選技術，分別獲得了能夠與T4 DNA聚合酶和小分子有機染料特異性結合的RNA序列。Gold將該技術命名為“SELEX”，Szostak將這種對靶標具有特異性結合能力的核酸命名為“aptamer（適配體）”。1992年，Bock等［4］利用SELEX技術篩選獲得首個單鏈DNA適配體。自上述開創(chuàng)性工作報道以來，30多年來核酸適配體研究領域已經發(fā)展成為多學科交叉的研究領域［5］。目前已經報道了數千種靶標的適配體，在生物標志物發(fā)現、藥物靶向遞送、生物成像、疾病診斷、食品和環(huán)境安全檢測等領域展示了廣闊的應用前景，然而核酸適配體的產業(yè)化應用還寥寥無幾。如何獲得具有高親和力、高特異性、高體內穩(wěn)定性的核酸適配體依然是亟待解決的核心問題。另外，核酸適配體的性能評價缺乏標準化，不同表征技術的結果存在不一致性的問題，極大地制約了核酸適配體的推廣應用［6］。核酸適配體評價技術的標準化是加快核酸適配體推廣應用的另一個亟待解決的重要問題。

由于核酸適配體篩選與親和力評價技術的重要性，近年來國內外期刊報道了大量綜述類論文，從不同的角度歸納總結技術進展，本文將在相關部分進行推薦閱讀。絕大多數綜述都側重于對各種篩選和親和力評價技術原理和應用的介紹，普遍缺乏對技術細節(jié)和問題的深入評述。基于上述情況，本文采用簡單歸納與詳細評述相結合的撰寫方式，對30多年來核酸適配體篩選技術的進展進行表格式分類歸納，按照篩選技術的主要研究方向，分別介紹快速篩選方法、適用于小分子靶標核酸適配體篩選的方法，以及提高核酸適配體親和力、特異性和穩(wěn)定性的篩選方法的研究現狀與發(fā)展趨勢，對十多種常用親和力評價技術的主要技術參數進行列表對比，突出各種技術的優(yōu)劣?？紤]到近幾年小分子靶標核酸適配體篩選技術備受關注，本綜述詳細評述捕獲-SELEX技術（Capture-SELEX）的實驗條件選擇、小分子靶標核酸適配體親和力鑒定常用的納米金（gold nanoparticle，AuNP）比色法和等溫熱滴定法（isothermal titration calorimetry，ITC）的技術進步和存在的問題，以期為本領域的工作人員提供較為具體的技術指導。本文最后對核酸適配體篩選與親和力評價技術的標準化和未來發(fā)展趨勢進行了展望。

1 SELEX技術的原理與關鍵步驟

SELEX技術基于親和富集的原理，從含有大約1014～1015個隨機序列的化學合成單鏈DNA或RNA庫中篩選與靶標具有高親和力、高特異性的序列。當篩選RNA適配體時，包括：（1）單鏈DNA隨機寡核酸文庫的設計與化學合成；（2）單鏈RNA文庫的制備（通過轉錄過程）；（3）核酸庫與靶標的孵育；（4）靶標一核酸復合物的分離；（5）由單鏈RNA到單鏈DNA的轉化（通過反轉錄過程）；（6）聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增；（7）單鏈DNA次級文庫的制備，共7個步驟，重復以上篩選步驟1～25輪。最后對富集后的文庫進行測序，利用各種親和力評價技術進行解離常數（dissociation constant，KD）和特異性的測定，獲得核酸適配體。當篩選DNA適配體時，不包括步驟（2）和（5），其他步驟均相同。獲取關于SELEX技術的基本知識，推薦閱讀Sharma等［7］的綜述；獲取各個技術步驟進行更為詳實的介紹，可以參閱Kohlberger等［8］2022年的綜述。下面僅對SELEX技術的部分步驟進行簡單介紹，著重介紹各步驟所面臨的問題或者局限性。

1.1 核酸庫的設計

1.1.1 核酸庫類型

自SELEX技術提出以來的十幾年里RNA適配體篩選占主導地位。2008年開始，DNA適配體的數量超過RNA適配體，且逐年快速增加［1］。DNA適配體或RNA適配體都容易被細胞或生物樣品中核酸酶的降解。對適配體進行化學修飾不但大幅提高其抗酶降解能力，還可以提高適配體的親和力、特異性和功能［9］。多種不同化學修飾的核酸文庫已被用于核酸適配體的篩選［9］。由于化學修飾文庫尚未實現廉價的商業(yè)化合成，而且存在知識產權問題，目前這類方法基本上局限于實驗室應用。最近剛剛報道了使用環(huán)狀DNA文庫進行適配體篩選的工作［10］，制備簡單，易于推廣。

1.1.2 固定區(qū)域和隨機區(qū)域的設計

起始文庫的設計對篩選結果具有顯著影響［11-12］。固定區(qū)域的設計直接影響文庫PCR擴增效率。引物區(qū)平均長度為18～21個核苷酸（nt），在設計時要保證其在擴增過程中不形成自身二聚體化，避免擴增時產生非特異性PCR產物。研究表明，較短的引物區(qū)對后續(xù)篩選的影響更小，而且有利于篩選出更加多樣性的序列［13］。兩端的固定序列部分互補的文庫設計有利于獲得二級結構穩(wěn)定的核酸適配體［14-15］，但同時存在篩選出的序列多樣性相對低的問題，可能不利于篩選高特異性的核酸適配體。

隨機區(qū)域長度絕大多數為30～60 nt，其中40 nt隨機區(qū)最常用。短隨機區(qū)域的設計有利于后續(xù)截短和應用，但更依賴于引物區(qū)結合位點的結構和功能，而較長的隨機區(qū)域在篩選中有機會找到尺寸較大、結構較復雜的適配體，有利于獲得特異性高的適配體［1］。研究表明，富鳥嘌呤（guanine，G）的文庫更容易篩選獲得具有G四聚體結構（G-quardruplex，G4）的適配體。目前報道了大量具有G4結構的核酸適配體，G4結構可以與多種多樣的靶標結合，因此需要注意這類核酸適配體的特異性是否能夠滿足特定場合的需要。

1.2 篩選過程監(jiān)控

在篩選過程中對每一輪的文庫富集情況進行監(jiān)控至關重要。最常用的監(jiān)控方法包括凝膠電泳、熒光定量PCR（fluorescent quantitative PCR，qPCR）、文庫KD測定、高通量測序、解鏈溫度（melting temperature，Tm）測定等［16-17］。其中凝膠電泳法對每輪文庫正、負篩選以及背景洗脫量進行半定量評價，結果直觀。由于洗脫量較低，需要對樣品進行PCR擴增（一般7～10輪）。需要注意擴增輪數的選擇，擴增輪數太少時達不到凝膠電泳的檢出限，擴增輪數太高無法真實反映出各樣品中DNA的含量。qPCR與凝膠電泳類似，根據核酸庫擴增曲線的Ct值推算出單鏈DNA的物質的量［16］。但需要注意的是，該方法不能確保文庫定量的準確性。在篩選過程中，隨著每輪的富集，核酸庫的多樣性會有所下降，傾向于篩選出富G和富C堿基的核酸庫。研究表明，SYBR Green I對G、胞嘧啶（cytosine，C）豐富的DNA比腺嘌呤（adenine，A）、胸腺嘧啶（thymine，T）豐富的DNA親和力低，從而導致更低的熒光信號，因此會對低估Ct值［18］。雖然換一種熒光染料可能會改善這種情況，但普通qPCR技術不能保證絕對定量的準確性。當篩選進行到一定輪數之后，可以對文庫進行KD測定來判斷文庫的富集程度。文庫Tm測定是監(jiān)控文庫富集程度的一種輔助性便捷方法，不少文庫在富集過程中由于互補序列或者富G序列的富集，其Tm會隨著富集程度的提高而逐漸升高。另外，高通量測序被越來越多的用來監(jiān)控文庫的富集程度。

1.3 PCR擴增與單鏈DNA制備

PCR擴增與單鏈DNA制備是制備次級文庫的兩個關鍵步驟。PCR擴增對序列的偏好性直接影響文庫的多樣性和適配體的篩選效率。為了減小PCR的偏好性，數字微液滴PCR（droplet digital PCR，ddPCR）技術被用來代替?zhèn)鹘y(tǒng)PCR進行文庫的擴增。Takahashi等［12］利用高通量測序技術系統(tǒng)對比研究了ddPCR與傳統(tǒng)PCR對核酸適配體篩選的影響，結果表明，基于ddPCR的文庫在篩選過程中的確具有更高的文庫多樣性，但是文庫的富集速率顯著低于基于傳統(tǒng)PCR的篩選過程，而且所獲得的適配體性能并沒有超越基于傳統(tǒng)PCR篩選所獲得的適配體。

目前將PCR雙鏈產物制備為單鏈DNA次級文庫的常用方法包括生物素-鏈霉親和素磁珠（瓊脂糖球）法、長短鏈法、λ核酸外切酶法、不對稱PCR法。這些方法的實驗細節(jié)已經有綜述詳細闡述［19］，本文不再贅述。國內外團隊也先后對這些制備方法的效率和純度開展了對比性研究［20-21］。本團隊曾經分別使用上述方法進行過單鏈DNA的制備，對這幾種方法的對比研究結果與文獻報道基本一致。生物素-鏈霉親和素磁珠（瓊脂糖球）法快捷，但價格貴，少量雙鏈DNA和鏈霉親和素也會在堿洗脫步驟被洗脫下來，但通常不影響適配體篩選。長短鏈法利用凝膠電泳來分離純化單鏈DNA產品，所獲得的單鏈文庫最純凈，價格最低，但耗時長，收率相對較低。不對稱PCR法需要較為繁瑣的實驗條件優(yōu)化。λ核酸外切酶法利用核酸酶將雙鏈DNA中5'磷酸化修飾的反義鏈降解掉，然后利用乙醇沉淀法進行DNA純化，該方法操作簡便，成本低，收率高，但高鹽濃度抑制λ核酸外切酶的活性，剪切反應是否完全需要利用凝膠電泳進行驗證。近期也報道了一些新的制備單鏈DNA文庫的方法［22］，相比現有技術的優(yōu)劣有待實踐的驗證。

1.4 富集文庫的測序與候選適配體篩選

富集文庫的測序可以通過傳統(tǒng)克隆測序的方法獲得，一般測序數量20～100條。隨著二代測序技術的快速發(fā)展，近幾年來文庫的測序成本快速下降，近5年二代測序已經成為適配體篩選文庫測序的主要技術手段，獲得的序列數量高于10 000條。文庫無需高度富集就可以通過二代測序的數據分析篩選出候選的核酸適配體。同時人工智能、分子對接等計算機輔助技術的興起，也為高質量核酸適配體的篩選提供了新的策略。

2 SELEX篩選技術的研究進展

核酸適配體領域發(fā)展迅速。從科學引文數據庫（Web of Science）以“aptamer”為主題進行文獻檢索，研究文獻逐年快速增加，從2000年96篇左右，2011年5 250篇，截至2023年6月核酸適配體相關文獻已達25 400篇。這些文獻80%～90%是基于核酸適配體的應用類文章，以篩選技術為主要研究內容的文獻每年不足百篇。造成這種局面的主要原因是核酸適配體篩選費時費力、失敗率高、成本高、發(fā)表高水平文章困難等等。盡管如此，30年來研究人員圍繞SELEX技術的各個關鍵技術步驟不斷進行優(yōu)化和創(chuàng)新；SELEX技術的靶標范圍從最初的純化蛋白質和有機小分子已經拓展到細胞、病毒、組織切片、離子等幾乎所有類型的靶標［5］。

目前核酸適配體的應用可以粗略地劃分為兩大領域，一是環(huán)境與食品安全領域，二是生物醫(yī)學領域。前者最主要的應用場景是基于核酸適配體的快速檢測技術，靶標主要是抗生素、真菌毒素、激素、農藥等各類有機小分子和重金屬離子。后者的應用場景更為多樣化，包括疾病標志物快速檢測技術、生物成像、藥物遞送等體外和體內的應用，靶標主要是蛋白質。蛋白質靶標核酸適配體的篩選和親和力評價方法相比小分子靶標更為簡單。篩選技術研究早期主要圍繞蛋白質靶標核酸適配體篩選展開，近十年對小分子靶標核酸適配體的篩選方法研究得到越來越多的重視。為滿足不同領域的需求，國內外篩選技術研究主要圍繞建立提高核酸適配體的特異性、穩(wěn)定性、親和力的篩選方法、快速篩選方法、適用于復雜靶標和小分子靶標核酸適配體的篩選方法展開。其中快速篩選技術研究是最受關注的研究領域（表1、2）。

Table 1 Popularly applied SELEX variants表1 推廣應用較廣的SELEX篩選技術

30年來報道了60多種改良的SELEX技術，目前應用較廣的SELEX技術大約10種（表1）。其中Negative-SELEX、Counter-SELEX、Subtractive-SELEX已經是目前篩選技術中提高核酸適配體特異性的常規(guī)技術步驟。隨著二代測序價格的大幅下降，High-throughput-SELEX的二代測序技術已經是目前核酸適配體篩選進程研究、候選適配體篩選的常規(guī)技術步驟。MB-SELEX和Cell-SELEX在蛋白質靶標和腫瘤細胞特異性的核酸適配體篩選中應用極為廣泛。瓊脂糖凝膠微球-SELEX和MBSELEX是小分子靶標核酸適配體篩選常用的篩選方法。近年來Capture-SELEX和GO-SELEX的應用越來越廣泛，特別是優(yōu)化的Capture-SELEX［35，37-38］。SOMAmer-SELEX 需要使用化學修飾的文庫；M-SELEX和Particle Display-SELEX需要非商業(yè)化的微流控裝置；CE-SELEX需要復雜的分離條件優(yōu)化和裝置。這些局限性使這些方法相比上述其他方法的推廣應用較少。近些年來，MSELEX技術的發(fā)展趨勢是面向集成化、微型化，但是篩選效率還有待提高［39］。CE-SELEX在2004年首次報道以來，陸續(xù)報道了一系列改良的方法，詳細的進展可以閱讀相關綜述［40-41］。

近5年來，對SELEX篩選方法的研究性論文的數量呈現穩(wěn)定增長的趨勢（表2）。快速篩選技術依然是SELEX篩選技術研究最受關注的研究方向。近三年，對高特異性、高體內穩(wěn)定性、高親和力的核酸適配體的篩選方法研究關注度顯著提高。

Table 2 Advances of SELEX in recent five years表2 近5年的SELEX篩選技術研究進展

關于核酸適配體篩選技術的綜述通常按照SELEX流程中分離結合序列與未結合序列的方法進行分類，比如基于磁珠的SELEX、基于文庫固定的SELEX、基于微流控技術的SELEX，或者基于毛細管電泳（CE）的SELEX等。這樣的分類方法突出了分離技術上的差異?？v觀核酸適配體篩選技術30年來的研究進展（表1，2），提高篩選效率、獲得高特異性、高體內穩(wěn)定性、高親和力的核酸適配體是核心技術難題。特別是近三年來，小分子靶標核酸適配體的篩選備受關注。因此下面對快速篩選方法、適合小分子靶標適配體篩選的方法、提高核酸適配體性能的篩選方法的研究進展進行較為詳細的評述，以突出目前核酸適配體篩選技術的重點研究方向。

2.1 快速篩選方法

提高篩選效率是核酸適配體篩選技術領域長期以來持續(xù)關注的研究領域?？焖俸Y選方法不局限于能夠提高復合物快速分離或者降低篩選輪數的方法，還包括能夠加快核酸適配體發(fā)現的其他技術步驟，比如快速的次級文庫制備方法、高通量的候選適配體鑒定方法、適配體關鍵結合域快速鑒定方法等等。30多年來，快速篩選技術的研究重點集中在“降低篩選輪數”（表1，2）。下面圍繞這一研究方向闡述。

1998年提出自動化篩選技術［72］，但是目前并沒有被廣泛推廣。SELEX的篩選循環(huán)中靶標一核酸復合物的分離步驟對文庫富集效率具有極大影響，是建立快速篩選方法的核心優(yōu)化步驟。截至目前，幾乎所有用于生物分子分離的技術手段都已經用于SELEX，來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的基于醋酸纖維素膜或者瓊脂糖親和柱的低效分離手段。其中最具影響力的快速篩選方法是基于CE、微流控芯片和磁珠的SELEX技術。CE-SELEX將篩選效率大幅提高，僅需要1～3個循環(huán)就可以獲得KD在納摩爾每升（nmol/L）水平的適配體［40-41］。由于CE分離的實驗條件選擇依賴較復雜的專業(yè)技術，一般生化實驗室難以推廣。另一方面，由于CE分離基于核酸適配體與靶標結合所引起的滯留時間的變化，小分子靶標通常難以引起足夠大的滯留時間變化，因此CE-SELEX目前主要用于蛋白質靶標核酸適配體的篩選。2009年以來報道的各種基于微流控技術（M-SELEX）的快速核酸適配體篩選方法，為技術的微型化、自動化和集成化奠定基礎［73］。但由于微流控芯片加工的技術門檻高，基于微流控芯片的篩選技術基本停留在實驗室應用。

不依賴特殊設備和裝置的便捷篩選方法更利于推廣應用。1997年磁分離技術被首次應用于SELEX，將靶標化學固定在官能團化的磁球上，極為便捷地將結合序列和未結合序列分離開來［26］?；诖胖榈腟ELEX（MB-SELEX）在各類靶標核酸適配體篩選中應用極為廣泛。但MB-SELEX篩選效率不高，需要的篩選輪數較多，這與核酸在磁珠界面上的非特異性吸附密切相關［42］。另外靶標的固相固定有可能改變或者封閉靶標的結合位點，批次間界面化學也會存在難以控制的差異，這些都會導致低的篩選效率。

為了克服上述問題，近年來報道了一系列基于高效化學反應的均相篩選技術，不但提高了篩選效率，而且所篩選的核酸適配體可以便捷地轉化為傳感器。2019年我們團隊報道了一種將磁性分離與化學偶聯(lián)反應相結合的SELEX方法，簡稱MCPSELEX［42］。先將蛋白質靶標與文庫均相孵育，使兩者在自然狀態(tài)下結合，然后利用蛋白質上一級胺基與磁珠上活化羧基之間的高效偶聯(lián)，通過捕獲蛋白質靶標來捕獲與靶標結合的核酸序列。該方法在5輪之內快速獲得多種蛋白質靶標的核酸適配體。通過與Capture-SELEX聯(lián)用，快速篩選獲得了人血清白蛋白的結構開關型核酸適配體（structureswitching aptamer，SSA）。2022年華僑大學的團隊巧妙地將脫氧核酶（I-R3）識別序列設計在Capture-SELEX文庫引物區(qū)內，利用I-R3的DNA剪切反應實現了對小分子靶標的適配體酶（aptazyme）的快速篩選［58］。此外，2023年譚蔚泓院士團隊［64］報道了基于甲醛交聯(lián)反應（formaldehyde cross-linking-assisted phase separation，FCPS）的均相篩選方法，利用甲醛將靶蛋白與胺基修飾的DNA交聯(lián)，利用有機溶劑萃取，實現對蛋白質靶標核酸適配體的快速篩選，僅需1～3輪?？梢灶A見，快速篩選方法的研究還將持續(xù)成為研究熱點。由于目前的快速篩選方法多數都是僅適用于蛋白質靶標，期待未來開展更多面向小分子靶標快速篩選方法的研究。

2.2 適合小分子靶標核酸適配體篩選的方法

近十年來，核酸適配體在環(huán)境和食品污染物快速檢測領域展現出很好的應用前景。小分子污染物是這類應用中數量最大的一類靶標，包括毒素、抗生素、內分泌干擾物、農藥等。小分子靶標的核酸適配體篩選技術研究受到越來越多的關注。由于小分子靶標的結合位點少、結構類似物多，相比蛋白質靶標，篩選獲得高親和力、高特異性的小分子靶標結合核酸適配體的難度更大。另外，由于很多小分子靶標缺乏可以進行固相固定的官能團，基于靶標固定的適配體篩選方法需要進行復雜的化學修飾。為了避免小分子靶標的固定，先后報道了基于文庫固定的Capture-SELEX技術和均相的GO-SELEX［74］。鑒于屈鋒教授課題組［37-38］已經綜述了2019年以來的小分子靶標核酸適配體的篩選進展，歸納了約120種小分子靶標的核酸適配體的序列和KD，較為詳細地介紹了基于靶標固定的SELEX技術（包括瓊脂糖凝膠微球-SELEX和MBSELEX）和GO-SELEX，但未對Capture-SELEX進行介紹。本文著重介紹Capture-SELEX的技術原理、技術進展、應用情況和局限性。

2.2.1 基于靶標固定的篩選技術

1990年Szostak課題組［3］建立了基于靶標固定的核酸適配體篩選技術，解決了小分子靶標結合序列和未結合序列的分離難題。但是該技術存在以下4個問題［5］。a.文庫在固相界面上存在非特異結合。為了解決這個問題，Szostak課題組［23］于1992年提出負篩策略（negative-SELEX），將文庫先與固相孵育，以除去文庫中對固相界面具有高非特異性吸附的序列。Jenison等［24］于1994年引入反向篩選（counter-SELEX），使用靶標結構類似物修飾的固相，不僅消除了與固相載體結合的非特異序列，還提高了核酸適配體的特異性，減小與靶標結構類似物的交叉反應。為了簡化描述，本文中統(tǒng)一使用“負篩選”來描述從文庫中去除非特異性序列的實驗步驟。然而，需要注意的是，非特異結合受固相界面狀態(tài)（比如靶標密度、界面帶電量等）的影響很大，篩選過程中界面狀態(tài)發(fā)生變化時（比如使用不同批次制備的靶標-固相載體復合物）負篩選難以消除非特異性序列。此外，非特異性吸附常常不具有序列特異性，比如靜電吸附，因此利用負篩選消除固相非特異性吸附時，有可能造成序列的大量丟失，負篩選的強度不能過高。b.靶標的固相固定不僅有可能占據重要的結合位點，而且存在空間位阻，兩者均阻礙適配體與靶標的結合，對小分子靶標來說這一點尤為重要。因此，在小分子靶標固定時建議增加間隔鏈（spacer）以降低空間位阻。c.固定的靶標可能與天然狀態(tài)的結構存在顯著差異，造成適配體在檢測自由態(tài)靶標時親和力差的問題。d.小分子靶標不具備便于固相固定的官能團時需要進行化學修飾，不但需要復雜的多步化學合成，在小分子中添加官能團還可能會改變其構型，進而影響與文庫的特征結合，篩選得到的核酸適配體與未修飾靶標的親和力差。盡管存在上述問題，由于篩選過程簡單，基于靶標固定的方法仍然應用廣泛。屈鋒課題組［37］對2015―2019年的小分子毒素的核酸適配體篩選方法進行了列表總結，17種毒素中有12種毒素的核酸適配體利用基于靶標固定的方法篩選獲得。

有趣的是，目前報道的特異性最好的幾條小分子靶標和金屬離子的適配體都是通過靶標固定的方法獲得的［1］。適配體領域的國際著名專家LI Ying-Fu教授課題組［1］最近的綜述中列出了目前報道的特異性最高（非靶標-適配體與靶標-適配體的KD比值大于1 000）的6個靶標的核酸適配體，其中3條為小分子和離子的適配體，分別為L-精氨酸的RNA適配體Ag.06、雙酚A的DNA適配體3#和銅離子的DNA適配體Cu-A2。這3條適配體全部是通過基于靶標固定的SELEX獲得的。我們認為這可能是由于靶標的界面固定提高了篩選壓力，適配體與靶標只有滿足更高的結構匹配，才能克服空間位阻的壓力。

該方法的關鍵是靶標的固定和選擇文庫非特異性吸附最小化的實驗條件。我們團隊曾經以凝血酶和鏈霉親和素的適配體為例，系統(tǒng)研究了實驗條件對文庫富集效率的影響，發(fā)現高靶標密度、活化后未封閉的羧基界面、低文庫濃度、文庫進行淬冷熱處理、使用單鏈文庫而非雙鏈變性文庫、將結合序列進行熱洗脫均有利于特異性文庫富集［75］。盡管我們的研究以蛋白質靶標為例，可以預見基于小分子靶標固定的篩選方法的篩選效率受到界面化學等因素的影響更大，甚至導致篩選失敗。

2.2.2 基于文庫固定的篩選技術——Capture-SELEX

為了避免靶標固定所帶來的各種問題，2005年加拿大的LI Ying-Fu課題組［29］首次報道了將文庫固定在磁珠上的篩選方法。2012年該方法正式被Stoltenburg課題組命名為Capture-SELEX［76］。同年Stojanovic課題組［35］建立了優(yōu)化的Capture-SELEX流程，目前已成為小分子靶標適配體篩選應用最廣的方法之一。Capture-SELEX與傳統(tǒng)SELEX篩選過程大致相同。主要區(qū)別是前者將文庫固定在固相上，而后者是將靶標固定在固相上。Capture-SELEX將生物素標記的與文庫中固定序列互補的短鏈核酸作為捕獲鏈，通過與隨機文庫雜交，將文庫固定在鏈霉親和素修飾的固相載體上。固定的文庫與游離的靶標結合，誘導文庫發(fā)生構象變化，使文庫被釋放到溶液中，較弱或未結合的序列仍被保留在固相載體上。Capture-SELEX篩選得到的適配體常常屬于SSA，即核酸適配體與靶標結合前后的二級結構變化較大。目前報道的大量核酸適配體傳感器均基于SSA的構象變化，因此Capture-SELEX技術在篩選SSA時具有獨特優(yōu)勢。影響Capture-SELEX效率的因素主要包括文庫設計、正篩靶標濃度、負篩選靶標及其濃度、文庫的自解離。Stojanovic等［15］在2016年報道了優(yōu)化的Capture-SELEX的篩選流程。下面將結合近年來報道的利用Capture-SELEX技術篩選的36個靶標的實驗條件和結果（表3），評述Capture-SELEX的實驗細節(jié)對篩選結果的影響。

Table 3 Experimental conditions and results for the isolation of small molecule and ion-binding aptamers via Capture-SELEX表3 Capture-SELEX篩選小分子靶標和離子的核酸適配體的實驗條件和結果

a.三種文庫設計及其靶標適用性

Capture-SELEX中使用的文庫由隨機序列、對接序列和引物序列3部分組成。捕獲鏈與對接序列互補（（15±2）個堿基）。適當的互補長度不僅保證了隨機文庫的固定效率和穩(wěn)定性，還確保了親和序列的洗脫率。與捕獲鏈相互補的對接序列的最佳Tm在36～40°C之間［77］。

文庫中的對接序列有3種設計方式。第一種設計中對接序列位于等長［42，78］或者不等長［29］兩段隨機區(qū)域之間。第二種設計中對接序列位于隨機序列一側的PCR引物區(qū)，兩端的引物區(qū)不存在穩(wěn)定的互補序列［79］。第三種設計與第二種設計基本相同，差異在于文庫的兩端引物區(qū)存在8～10個堿基的互補序列［15，35］。目前小分子靶標核酸適配體篩選時多采用第三種文庫設計。在這種設計中當文庫與小分子靶標結合時，更利于莖環(huán)結構的形成，便于文庫脫離固定相。

我們利用第一種文庫設計進行多種蛋白質靶標核酸適配體的篩選時均獲得成功［42，78］，但是利用相同的文庫設計進行三磷酸腺苷（ATP）適配體篩選時失?。ㄎ磮蟮溃?。有趣的是，第三種文庫設計在篩選蛋白質靶標核酸適配體時失?。?5］。不同文庫設計在靶標適用性上的差異，應該與核酸適配體與不同類型靶標的結合模式的差異密切相關。

b.正篩靶標濃度對適配體親和力的影響

提高篩選壓力是提高核酸適配體親和力的常用策略。根據表3的數據，在進行小分子靶標（或者離子）的適配體第一輪篩選時，正篩靶標濃度在50 μmol/L～5 mmol/L之間。36例篩選中14例的正篩靶標濃度為100 μmol/L，7例的正篩靶標濃度為1 mmol/L。隨著篩選的進行，或者保持正篩靶標濃度不變（14例），或者逐步降低（22例）。正篩靶標濃度降低的幅度差異很大，2例金屬離子適配體篩選的例子中正篩靶標濃度均降低至原來的1/10 000，小分子靶標適配體篩選的例子中正篩靶標濃度降低到原來的1/1.67～1/5 000，絕大多數降低至原來的1/100或稍高。36例篩選所獲得的最佳適配體的KD差距很大，從0.1 nmol/L到71.94 μmol/L。其中KD大于1 μmol/L的有7例，小于100 nmol/L的20例。在這些篩選工作中使用了不同的KD測試方法，盡管不同方法的測試結果會存在不一致性，但5個數量級的差異足以說明Capture-SELEX篩選得到的適配體的親和力差異很大。

最近美國和加拿大的兩個課題組分別開展系統(tǒng)研究，研究結果均顯示低的正篩靶標濃度更有利于高親和力適配體的富集。第一個工作中正篩靶標氟尼辛的濃度從第一輪的100 μmol/L逐步降低到第15輪的10 μmol/L［69］；第二個工作中正篩靶標腺苷的濃度從第一輪的5 mmol/L逐步降低到第12輪的1 μmol/L［70］。第一個工作中氟尼辛的濃度從第一輪的600 μmol/L逐步降低到10 μmol/L時，文庫富集效率并不高［69］。然而從表3中的數據看，使用高濃度的正篩靶標進行篩選，比如1 mmol/L的氟喹諾酮類藥物［80］或者玉米赤霉烯酮［81］，也可以得到高親和力的核酸適配體，KD分別為0.1～56.9 nmol/L和（15.2±3.4）nmol/L。使用低濃度的正篩靶標進行篩選，比如100 μmol/L的有機磷農藥［82］或者皮質醇［83］，所得到的核酸適配體的親和力也不高，KD分別為0.8～2.5 μmol/L和16.1 μmol/L。因此，對于不同靶標，正篩靶標濃度和KD值之間不存在明確的相關性，關鍵取決于靶標本身的結構。

c.負篩靶標種類和濃度對適配體特異性的影響

和其他SELEX技術一樣，負篩選是Capture-SELEX提高適配體特異性的主流方法［38］。小分子靶標的核酸適配體按照特異性可以劃分為靶標特異和大類特異兩大類，在分析測試中分別用于對特定靶標的高特異性檢測和大類特異性檢測。通常同時采用化學結構差異大的靶標和結構類似物兩大類分子進行負篩選，來獲得靶標特異性核酸適配體；采用化學結構差異大的進行負篩選，采用結構類似物進行正篩選，來獲得大類特異性核酸適配體。

在已報道的篩選工作中，負篩選的實驗條件選擇差異很大。表3所列的36個例子中，有20例沒有進行負篩選，其他的2～7輪開始第一次負篩選，最常見的從4～6輪開始。由于小分子的結構簡單，結構類似物數量多，篩選靶標特異的核酸適配體通常更具有挑戰(zhàn)性。引入結構類似物進行負篩選時，如果濃度過高，有可能造成篩選失敗［69］。負篩靶標的濃度多數與正篩靶標濃度相當，隨著篩選輪數的增加，保持不變，或者逐步增加或者降低。比如鹽酸克倫特羅［84］和精胺［85］的高特異性核酸適配體的篩選，用于負篩的結構類似混合液的濃度隨著篩選輪數增加逐步下降。值得指出的是，20例沒有進行負篩選的篩選過程也獲得了特異性較好的核酸適配體。隨著高通量測序和高通量表征技術的發(fā)展，具有高靶標特異性或者大類特異性的適配體可以通過高通量表征測試獲得。

理論上來講，目前依靠負篩選來獲得高靶標特異性核酸適配體的策略存在明顯的局限性。一方面由于負篩靶標的數量是有限的，常常僅是實際樣品中可能存在的結構類似物的一小部分，因此通過負篩選獲得僅對正篩靶標高特異性的核酸適配體存在很大隨機性。比如上述利用降低正篩靶標濃度獲得高親和力的氟尼辛的核酸適配體的例子中，當負篩選靶標包含結構類似物時，正篩的洗脫比甚至小于負篩選的洗脫比，文庫富集不理想，當負篩選時去掉結構類似物時，文庫對正篩靶標產生了較理想的富集，但是最終富集程度最高的適配體雖然具有高的親和力，但對結構類似物的特異性不理想（40%的交叉反應）［69］。此外，Capture-SELEX的第三種文庫設計方法盡管目前應用廣泛，但是這種末端互補的文庫設計有利于具有三向結構（three-way junction）的序列的富集，而這類結構的靶標特異性差［8，35］。

d.文庫的自解離

Capture-SELEX的一個固有問題是固定文庫的自解離［77］。文庫的自解離導致文庫的富集效率低，所需要的篩選輪數通常較多（8～18輪，絕大多數12～16輪，表3）。為了盡可能地減小文庫的自解離，通常使用高離子強度的緩沖液，可能對某些弱相互作用是不利的，比如靜電吸引作用。另外，為了減小自解離的背景信號，通常需要在正篩選之前進行多次的清洗（一般10～40次），不但操作繁瑣，而且會造成文庫多樣性的丟失。

2.2.3 均相篩選技術

均相篩選方法中靶標與適配體均不被固相固定，處于自然狀態(tài)，這種條件下的分子互作不受界面因素的影響。1990年Gold課題組［2］篩選T4 DNA聚合酶時采用均相孵育文庫和靶標，隨后利用醋酸纖維素膜分離與靶標蛋白結合的適配體，這一篩選技術本質上屬于均相篩選技術。由于該項技術基于蛋白質在醋酸纖維素膜上的強非特異性吸附，小分子靶標不具有這種吸附能力，因此該技術不能用于小分子靶標核酸適配體的篩選。為了克服醋酸纖維素膜分離效率低的不足，2004年Mendonsa和Bowser［28］首次將CE和SELEX技術進行結合，利用復合物和游離適配體在電場中遷移率的差異分離與靶標結合的適配體。由于CE極高的分離效率，CE-SELEX可以高效篩選蛋白質靶標的核酸適配體。但小分子靶標與適配體復合物的遷移率與游離的適配體非常相似，因此該項技術很少應用于小分子靶標核酸適配體的篩選。

韓國的Man Bock Gu課題組［34］于2012年建立了一種適用于均相核酸適配體篩選技術（GOSELEX），該方法基于氧化石墨烯（GO）對單鏈DNA（ssDNA）的吸附作用比對雙鏈 DNA（dsDNA）或靶標-核酸分子復合物的吸附力強的特點。利用該方法成功篩選到了脂肪因子煙酰胺磷酸核糖轉移酶（nicotinamide phosphoribosyl transferase，Nampt）蛋白的適配體。先將文庫和靶標孵育形成文庫-靶標復合物，然后加入GO，未與靶標結合的ssDNA被吸附到GO上，通過離心除去，而結合的文庫仍被保留在上清液中，用于下一輪篩選。2014年該課題組進一步建立了多重GOSELEX（multiple GO-SELEX）技術，成功獲得了3種小分子農藥的適配體［86］。其方法類似于Capture-SELEX，先將文庫和GO孵育，使文庫吸附在GO上，然后加入靶標，與靶標發(fā)生強結合的文庫從GO上解離下來，回到溶液中用于下一輪篩選。在GO-SELEX中文庫通過物理吸附固定在GO上，無需在文庫中設計對接序列，更為簡單。2018年王周平團隊［87］報道了用磁性還原氧化石墨烯代替GO用于3種小分子海洋生物毒素適配體的篩選，進一步簡化了分離步驟，提高分離效率。近三年利用GO-SELEX篩選小分子靶標核酸適配體篩選的論文數量與Capture-SELEX相當（表4）。總體上GO-SELEX篩選輪數比Capture-SELEX少，所獲得的適配體的親和力也多在nmol/L水平。

2.3 提高核酸適配體性能的篩選方法

隨著篩選技術的成熟、篩選成功率的提高，具有更好實際應用價值的體內高穩(wěn)定性、高特異性、高親和力的適配體篩選方法研究成為近幾年的研究熱點。

2.3.1 體內高穩(wěn)定性核酸適配體的篩選

a.化學修飾核酸適配體的篩選

化學修飾是目前提高適配體體內穩(wěn)定性最常用的方法。30年來，核酸的化學修飾從最初的磷酸骨架和戊糖的修飾，拓展到堿基修飾，甚至引入人工堿基［9］。提高核酸抗酶降解能力的主要化學修飾包括：硫取代磷酸骨架上的非橋接氧；戊糖2'位的氟（—F）、氨基（—NH2）、疊氮基（azido，—N3）或甲氧基/OMe（—OCH3）修飾；鎖核酸（LNA）。多種多樣的堿基修飾，包括萘基（Nap—）、芐基（Bn—）、色胺基（Trp—）等疏水性官能團，用來增強與蛋白質間疏水相互作用，提高適配體的親和力。

可以直接對化學修飾的文庫進行適配體的篩選，也可以對含天然堿基的文庫篩選所獲得的適配體進行化學修飾。后者需要大量的優(yōu)化，直接篩選化學修飾的適配體更為直接。美國Somalogics公司研發(fā)的SOMAmers篩選技術，利用在2′-脫氧尿苷的堿基C5位置上進行各種各樣的化學修飾，獲得了3 000多種蛋白質的核酸適配體，性能可以媲美抗體。2013年Hirao課題組［88］首次開發(fā)了將高疏水的Ds與Px人工堿基引入文庫進行篩選的方法，所獲適配體的親和力比僅含天然堿基的適配體高100倍以上。2015年Benner課題組［89］合成了新的基于氫鍵配對的堿基對P和Z，該堿基對表現出了比G-C堿基對更高的穩(wěn)定性。但這類方法需要特殊的化學合成技術、DNA擴增酶和測序技術，因此未得到廣泛使用［9］。

b.鏡像核酸適配體的篩選

傳統(tǒng)的核酸適配體篩選方法，篩選出的核酸適配體為D型核酸，在人體血清中極易被迅速降解，而鏡像核酸適配體（mirror-image aptamer）為L型核酸，無法被天然核酸酶降解，具有高穩(wěn)定性。鏡像篩選技術（mirror-image selection）利用手性分子具有旋光性的特點，從D-核酸適配體文庫中篩選出與L-靶標分子結合的核酸適配體，再將其合成為L-核酸適配體，即篩選出對D-靶標分子有高親和力的L-核酸適配體。1996年，Klu?mann等［25］利用該技術從D-核酸適配體文庫中篩選出58 nt的L-RNA核酸適配體，其能在溶液中與天然D-腺苷結合，KD為1.7 μmol/L。且L-RNA核酸適配體對D-腺苷的結合親和力是其對L-腺苷的親和力的9 000倍。此外，Maasch等［90］采用此方法篩選出與高遷移率族蛋白A1（HMGA1）特異性結合的鏡像適配體NOX-A50，其KD為7 nmol/L。然而，鏡像靶分子不易合成，特別是對于具有大尺寸、存在大量翻譯后修飾（PTM）和低體外折疊效率的蛋白質。在實踐中，大多數生物學上重要的靶分子都不能根據目前的技術進行化學合成［56］。因此，2022年朱聽等［56］進一步改進該篩選技術，直接從L-DNA核酸適配體文庫中篩選L-DNA核酸適配體，避免了合成L-靶標分子。成功選擇并評價出數種對天然人凝血酶有高親和力的L-DNA適配體，其中KD最好的為22 nmol/L。

c.環(huán)狀核酸適配體的篩選

環(huán)狀核酸（CNA）相比于開鏈適配體具有更高的穩(wěn)定性，可有效抵御核酸外切酶的降解［91］，廣泛用于基于滾輪擴增（rolling cycle amplification，RCA）的生物傳感器［92］。將適配體設計成環(huán)形結構時可能導致適配體親和力降低。2019年，LI Ying-Fu課題組［10］首次使用了環(huán)狀DNA文庫進行篩選，獲得了谷氨酸脫氫酶（glutamic dehydrogenase，GDH）的環(huán)狀核酸適配體。所獲得兩條環(huán)狀DNA適配體以高親和力與GDH不同位點結合，展現出了結合位點多樣性和高親和力的優(yōu)勢。環(huán)狀DNA適配體可使用基于固定靶標于磁珠上，后加入文庫進行孵育的方法進行篩選，也可使用基于均相孵育，后加入磁珠捕獲的方法進行篩選［93］。在篩選過程中的PCR及文庫制備步驟包括滾輪擴增反應和酶切等，要注意優(yōu)化反應條件［94］。

2.3.2 提高核酸適配體特異性的篩選方法

核酸適配體的特異性是核酸適配體極為重要的性能指標，然而大約1/3的SELEX文獻中沒有進行核酸適配體的特異性測試。而且特異性測試缺乏標準，絕大多數僅僅是測試1～2個濃度下靶標與其他測試物信號響應的差異，定量比較核酸適配體與靶標和測試物KD的報道極少。此外，特異性測試中測試對象的選擇比較隨意，有些選擇與靶標結構差異大的進行測試，有些選擇常見的蛋白質或者小分子進行測試，有些甚至選擇完全不相關的分子進行測試。急需建立核酸適配體特異性測試的規(guī)范。

提高核酸適配體的特異性目前主要依靠負篩選。用核酸適配體與靶標和測試物KD的比值來衡量核酸適配體的特異性，絕大多數適配體的特異性位于1～10之間，少量位于10～100之間，有6個適配體（1個RNA適配體和5個DNA適配體）的特異性大于1 000［1］。然而實踐證明目前報道的核酸適配體的特異性常常不能滿足實際需要，在實際應用中存在高交叉反應和背景干擾。

提高核酸適配體的特異性的一個常用方法是2～3種SELEX技術的聯(lián)用，以消除一種SELEX技術可能引入的非特異性序列。2021年我們團隊報道了modular-SELEX，將MCP-SELEX、Capture-SELEX、tissue-SELEX 3種方法聯(lián)合篩選PD-L1的核酸適配體［51］。2021 年許丹科團隊［54］報道了precision-SELEX，先后以純蛋白質靶標KPC-2和細菌為正篩靶標，篩選KPC-2表達的細菌的高特異性核酸適配體。2023年Citartan等［65］報道了tripartite-hybrid SELEX，聯(lián)合使用基于硝化纖維濾膜、微量滴定板和非變性 PAGE 3種分離技術的SELEX，篩選LipL32的RNA適配體。此外，在實際應用環(huán)境中進行適配體篩選是提高適配體特異性的一種有效手段。2023年Park團隊［67］報道了微生理系統(tǒng)SELEX（MPS-SELEX），以雙通道人腦微血管內皮細胞/星形膠質細胞/周細胞界面為篩選平臺，篩選具有高血腦穿透性和特異性的適配體。

核酸適配體的高特異性主要決定于核酸適配體與靶標的結構互補性。提高篩選文庫的序列多樣性有利于篩選到具有更優(yōu)結構互補性的核酸適配體。突變是自然界推動生物進化的原動力。與自然界中的進化過程不同，傳統(tǒng)的SELEX方法中，只有PCR擴增步驟可以引起低頻率的突變，即SELEX篩選技術本質上是對初始文庫中已經存在的序列進行富集，而不是進化出新的功能性序列。為了解決文庫多樣性不足的問題，報道了利用低保真的PCR擴增酶來提高點突變頻率的方法，但最后得到的新序列與初始文庫序列相差不大［95-97］。非均相隨機DNA重組技術也被用來提高序列多樣性［98］。然而上述兩種技術所引入的突變都是隨機不可控的，與靶標親和力進化無關。2021年我們團隊將II型限制性內切酶-Alu I作為工具運用于核酸適配體篩選過程中，誘導產生與親和力相關的文庫突變（REase-SELEX），成功獲得了高特異性PD-L1的核酸適配體，實現了對臨床多種癌組織切片的PD-L1表達水平的熒光成像，與免疫組化的結果一致［50］。

獲得對小分子靶標具有高特異性的適配體尤其困難。如上所述，盡管目前報道了少數幾種具有很高特異性的小分子和金屬離子的適配體，但只是個例，具有隨機性。我們團隊最近與軍事醫(yī)學科學院的邵寧生研究員合作，將MCP-SELEX技術用于高特異性同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）適配體的篩選［71］。該方法基于適配體與靶標結合會阻礙靶標上官能團發(fā)生化學反應效率的現象［99］。當適配體與Hcy的氨基（氨基酸的共有官能團）結合力強時，該氨基不能與磁球上活化羧基發(fā)生化學偶聯(lián)；反之，當適配體與Hcy的側鏈（氨基酸的特有官能團）結合力強時，Hcy上的氨基能夠與磁球上活化羧基發(fā)生化學偶聯(lián)。利用上述效應，從Hcy與文庫的混合物中，通過氨基和活化羧基之間的化學偶聯(lián)磁性富集出對Hcy的巰基側鏈具有高特異的適配體。所獲得的Hcy適配體對還原態(tài)Hcy的親和力遠高于氧化態(tài)Hcy，且對含巰基其他氨基酸（甲硫氨酸、胱氨酸）、其他含硫小分子（谷胱甘肽、二硫蘇糖醇）和氨基酸均無顯著交叉反應。利用該適配體構建的光纖傳感器實現了對臨床樣本中Hcy總量的快速檢測，與臨床經典的酶循環(huán)法的測試結果一致。這是利用上述獨特“適配體保護基團效應”進行高特異性小分子適配體的初次嘗試，其是否具有通用性還有待檢驗。

2.3.3 提高核酸適配體親和力的篩選方法

核酸適配體的親和力是其實現分子識別的最重要的性能。提高篩選壓力來提高核酸適配體的親和力是目前最常規(guī)的方法。通過SELEX技術獲得的核酸適配體的蛋白質靶標的KD通常在0.1～100 nmol/L范圍，少數兩價的核酸適配體的KD達到1～100 pmol/L范圍。小分子靶標的核酸適配體的KD通常在1 nmol/L～100 μmol/L范圍。除了上述降低正篩靶標濃度、使用化學修飾文庫進行篩選的方法之外，還有一些提高適配體親和力的方法，但應該并不廣泛。2000年Koch等［100］建立了photo-SELEX技術，用5-溴-2'-脫氧尿苷代替胸腺嘧啶，當蛋白質靶標與適配體結合時發(fā)生光交聯(lián)反應，將蛋白質與適配體共價偶聯(lián)，然后使用嚴苛的清洗條件進行清洗，從而獲得人堿性成纖維細胞生長因子（bbFGF（155））的高親和力適配體。通過工程化設計或者體外篩選高價的核酸適配體是大幅提高核酸適配體的一種技術手段。2008年譚蔚泓院士團隊［101］率先展示了凝血酶的二價核酸適配體比單價適配體具有更好的抗凝血功能和1/50的解離速率常數。2017年該團隊報道了二價的環(huán)狀DNA比單價適配體具有更很高的親和力、熱穩(wěn)定性和抗酶降解能力［102］。工程化設計通常需要大量的優(yōu)化，為了克服這一問題，2012年Soh課題組［103］建立了直接篩選凝血酶的二價適配體的SELEX方法，文庫兩端固定序列分別包含凝血酶適配體TBA15和TBA29，兩者之間通過隨機序列連接。二價適配體的設計需要一對能夠結合在蛋白質不同位點的核酸適配體，為了篩選結合不同位點的適配體對，該課題組先后建立了幾種SELEX方法，但方法較為繁瑣［104-105］。小分子靶標多價核酸適配體的設計更為有限。蛋白質靶標的二價核酸適配體與靶標的兩個區(qū)域協(xié)同結合，因此親和力很高，KD可以比單價的適配體低1～3個數量級。小分子靶標的多價核酸適配體與多個小分子結合，通常結合位點的增多僅能夠小幅提高親和力。比如我們課題組2022年報道了真菌毒素交鏈孢酚（AOH）的單價、二價和三價核酸適配體，KD分別為701 nmol/L、445 nmol/L和274 nmol/L［106］。小分子靶標的多價核酸適配體更適合于用于親和柱來提高柱容量。

按照傳統(tǒng)的篩選方法進行篩選時，不少小分子靶標由于結合位點少、結構擁擠、空間結構多樣等各種原因，難以獲得高親和力的適配體。哥倫比亞大學的Stojanovic課題組［107］利用將小分子與有機配體或者金屬配合物形成復合物的方法，結合優(yōu)化的Capture-SELEX技術，成功獲得了多種低表位（low-epitope）小分子靶標的高親和力和高特異性的適配體。該課題組近期在《科學》（Science）發(fā)表了一篇篩選小分子靶標核酸適配體的新方［108］。該方法根據小分子靶標中官能團和結構開展不同的篩選路徑，最終獲得了以前篩選失敗的幾種小分子靶標的高親和力的適配體。比如在對亮氨酸（leucine）的適配體篩選中，先篩選獲得能夠特異性結合氨基-羰基-環(huán)戊二烯基合銠（III）復合物結構的適配體，再將該適配體的序列設計到隨機文庫中，對能夠結合亮氨酸側鏈異丁基的適配體進行篩選，然后再將亮氨酸側鏈的結合適配體序列設計到隨機文庫中，在加入銅離子的條件下，篩選對亮氨酸-銅離子復合物具有高親和力的適配體。但是根據文章中報道的數據，所獲得的適配體的特異性有限，對結構類似物存在強的交叉反應。比如，篩選獲得的亮氨酸的適配體對別異亮氨酸（alloisoleucine）具有強交叉反應。另外，篩選得到的小分子藥物伏立康唑（voriconazole）的核酸適配體對其結構類似物2a也具有高交叉反應。

3 核酸適配體親和力評價技術的研究進展

3.1 常用核酸適配體親和力評價技術概覽

目前幾乎所有蛋白質-蛋白質互作研究使用的常用生物物理表征技術都已用于核酸適配體的親和力和特異性評價（表5）。這些技術大體上可以劃分為均相表征技術和基于固相固定的表征技術。這些表征技術的基本原理在多篇綜述中都進行了詳細介紹［109-110］，在本綜述中不再介紹。

對于特定的核酸適配體-靶標體系，在表征方法選擇時需要綜合考慮多種因素。表5對這些因素進行了總結，具體包括表征技術是否需要對核酸適配體或者靶標進行固定、標記、是否需要分離核酸適配體-靶標復合物、是否適用于小分子靶標、能否進行高通量測試、樣品用量、測試時間、操作的復雜程度和測試費用等參數。由于其標準化的測試流程，表面等離子體共振（SPR）和ITC被普遍認為是蛋白質靶標和小分子靶標核酸適配體親和力評價的經典方法。但是，值得注意的是，標準化的測試流程并不能完全排除假陽性或者假陰性結果的出現。此外，由于影響各種表征技術測試結果的因素存在巨大差異，應使用至少兩種表征手段來測定適配體-靶標的親和力。特別是由于核酸適配體的尺寸相對抗體小很多，結構穩(wěn)定性相對抗體差很多，空間位阻和界面非特異性吸附對核酸適配體親和力的影響往往很大，因此在進行核酸適配體親和力評價時至少應使用一種均相的評價技術。目前報道的核酸適配體篩選文章中對核酸適配體進行親和力評價時，普遍存在表征方法單一（表3，4）、實驗條件選擇隨意性強，特別是特異性測試時測試靶標的選擇極不充分、KD測試數據點不充分等種種問題，亟需建立相對標準化規(guī)范。

基于固相固定的親和力評價技術受到界面化學、靶標或者適配體固定方式等因素的影響很大，篇幅原因不在本文中進行深入評述。均相評價技術的影響因素相對簡單，在小分子核酸適配體親和力評價中應用廣泛。近年來不斷報道，使用不同表征技術進行小分子靶標適配體親和力評價時測試結果不一致性的問題，亟需澄清問題所在。下面將圍繞這一問題，評述均相親和力評價技術的局限性和研究進展。

3.2 常用的均相核酸適配體親和力評價技術局限性及其研究進展

均相親和力評價技術無需對靶標或者適配體進行固相固定，因此能夠更準確地反映出核酸適配體與靶標的相互作用強弱，避免了空間位阻的問題和界面固定的不確定性。這種情況下獲得的親和力數值通常被稱為本征親和力（native affinity）。由于排除了上述潛在的干擾，均相表征技術相比非均相的技術重現性更好。此外均相表征技術實驗操作更為簡單，測試成本也較低。由于這些優(yōu)勢，建議在核酸適配體親和力評價時盡可能采用至少一種均相表征技術。常用的均相表征技術包括凝膠阻滯（EMSA）、納米金（AuNP）比色法、圓二色譜（CD）法、ITC、熒光光譜/熒光極化和微量熱涌動法（MST）（表5）。其中熒光法是小分子靶標核酸適配體KD測試時應用最廣泛的方法（表3，4），其次是AuNP比色法和ITC法。熒光法的測試原理多種多樣，可以基于熒光共振能量轉移、熒光極化［111］、熒光增強等，體系比較簡單，本文不再一一介紹，可以參見相關綜述類或研究性論文［109-110］。AuNP比色法和ITC法的測試原理單一，但其測試結果受靶標和適配體的性質影響大，下面就這兩種表征技術進行較為詳細的評述。

3.2.1 AuNP比色法

分散狀態(tài)的10～30 nm直徑的AuNP由于特征等離子共振吸收，呈現酒紅色。當納米金聚集時，特征等離子共振吸收消失，呈現灰藍色。AuNP比色法測定核酸適配體親和力的原理基于分散態(tài)和聚集態(tài)AuNP紫外可見吸收的差異。當AuNP表面吸附核酸適配體時，核酸適配體對AuNP起到保護作用，增強AuNP抵制鹽離子誘導聚集的能力，此時體系呈現紅色。當溶液中游離的靶標與AuNP表面的核酸適配體特異性結合時，核酸適配體離開AuNP表面，AuNP發(fā)生鹽離子誘導的聚集，此時體系由紅色變?yōu)樽仙踔粱疑?。靶標的濃度越高，AuNP的聚集越嚴重。對含不同濃度靶標的樣品進行特征吸收峰處吸光度的測定。以靶標濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制結合曲線，就可以實現對KD的測試。以不同的潛在干擾物代替靶標，就可以實現對核酸適配體的靶標特異性的測定。交叉反應性越高，AuNP的聚集越嚴重。此外，AuNP便于合成、成本低、檢測快捷、結果可視化，可以轉化為比色傳感器，因而AuNP法是應用廣泛的一種核酸適配體均相表征技術［6，112］。

盡管AuNP比色法具有多重優(yōu)點，但是存在假陽性的風險。這是由于AuNP界面可以非特異性吸附多種多樣的物質，當AuNP對靶標的吸附力比較強時，靶標在AuNP上的非特異性吸附會直接取代AuNP上吸附的核酸適配體，而非由于核酸適配體與靶標結合，使得核酸適配體與AuNP的吸附解離。加拿大滑鐵盧大學的劉玨文課題組對文獻中基于AuNP評價的砷和卡那霉素A的核酸適配體的實驗數據提出質疑，通過系統(tǒng)的對比實驗證實了亞砷酸根和卡那霉素A與AuNP存在強的吸附力，含負控制鏈體系在不同濃度亞砷酸根存在時所引起的AuNP的聚集程度，與核酸適配體所引起的沒有差異［113-114］。此外，在高濃度鹽溶液中DNA提高AuNP的能力與DNA的組成、二級結構和長度密切相關，比如腺嘌呤（A）堿基在AuNP上的吸附力最強，對AuNP的保護性也最強，充分吸附的情況下，較長的DNA能夠更好地防御AuNP的聚集。因此在利用AuNP比色法進行核酸適配體的截短和工程化設計的序列的親和力對比時，需要考慮到這些因素的可能影響。建議在使用AuNP比色法時，首先對靶標及其特異性測試中所使用的分子是否顯著影響AuNP在高濃度鹽溶液中的穩(wěn)定性進行測試。另外，采用其他親和力評價方法進行進一步驗證。

由于蛋白質具有多個能夠與AuNP吸附的官能團，微量的蛋白質能夠引起AuNP的聚集，因此上述基于DNA防御AuNP聚集的比色方法不能用于蛋白質靶標的核酸適配體的親和力和特異性評價。我們團隊2020年報道了一種反向顯色的AuNP方法用于蛋白質靶標的核酸適配體KD的測定，稱為Nano-Affi［115］。該方法基于吸附質的帶電狀態(tài)顯著影響AuNP聚集程度的現象：帶正電或接近電中性的靶標（蛋白質）由于靜電吸引或疏水相互作用，非特異性吸附在帶負電的AuNP的表面，顯著降低AuNP之間的電荷排斥作用，從而引起AuNP的快速聚集；靶標（蛋白質）-核酸適配體復合物具有比靶標更多的負電荷，因而復合物在AuNP上非特異性吸附后沒有顯著降低納米金的負電量，因此AuNP聚集程度較小或不發(fā)生聚集，由此利用AuNP的顏色變化或粒徑變化進行蛋白質靶標的核酸適配體KD測定。此外，AuNP具有超高的消光系數，比有機染料至少高出1 000倍以上，例如13 nm AuNP 為 2.7×108L·mol-1·cm-1。納摩爾每升濃度的AuNP發(fā)生聚集時就可以肉眼觀察到從粉色（酒紅色）到藍色/灰色的顏色變化，因此AuNP法進行蛋白質靶標的核酸適配體評價時所需要蛋白質的濃度低，每個測試僅需要0.2～4 pmol的蛋白質，當蛋白質樣品量小或者價格昂貴時尤其具有吸引力。此外，我們也成功地利用該方法評價了卡那霉素A的核酸適配體（未報道），克服了上述靶標誘導AuNP聚集方法的假陽性問題。

3.2.2 ITC法

ITC被普遍認為的測試核酸適配體親和力的“金標準”方法［116］。ITC基于測定分子互作過程的熱量變化的準確測定，實現對核酸適配體KD以及熱力學函數的測定。ITC在工作時需要兩個工作單元，分別是樣品檢測單元和標準參考單元。樣品池中盛有大分子或核酸適配體等受體，進樣針中裝載配體，參比池中盛有水。工作時利用進樣針將配體溶液注入樣品池中，這一過程會伴隨熱量變化直至達到結合平衡。由于滴定過程是逐滴進行的，所以結合帶來的溫度變化可以被實時監(jiān)測并通過外部的加熱器保證兩池間的溫差為零。通過實時采集加熱器功率從而得到時間和功率的關系圖，經過擬合可以得到結合過程的焓變數值和KD。進而根據等溫等壓條件下的熱力學方程（?G=?H-T?S，?G=RTlnKD），獲得吉布斯自由能（ΔG）和熵變（ΔS）［117］。該方法可對100 μmol/L～1 nmol/L范圍內的結合親和力進行測定。

ITC法的優(yōu)點是一次滴定不僅可以獲得KD，還可以獲得熱力學函數值，為結合模式研究提供依據，這是其他表征技術都不具備的。主要缺點是樣品的用量大、檢測通量低。近些年來，我們以及文獻都報道了ITC失敗的多個案例，包括亞砷酸根［118］、氨芐西林［119］、氯霉素［120］、乙醇胺［121］、交鏈孢酚［106］的核酸適配體等。然而這些核酸適配體的親和力被多種其他方法所證實，說明ITC方法存在局限性，未必適用于某些核酸適配體的KD的測定。

ITC是基于結合熱測定的表征技術。核酸適配體與靶標的結合可以是焓驅動、熵驅動、焓和熵共同驅動的三種結合過程。對于焓變小的結合過程，以及稀釋熱過大的過程，均可能導致ITC測試的失敗。在ITC數據解析過程中需要更為嚴謹和慎重。

4 展望

30多年來，核酸適配體篩選技術和親和力評價技術不斷發(fā)展。然而目前走向實際應用的適配體數量仍然非常有限。核酸適配體篩選與評價技術還需進一步完善，至少應包含以下幾個研究方向。

a.如何獲得高特異性的核酸適配體是未來篩選技術應該關注的重點。如何獲得高特異性的小分子靶標的核酸適配體依然富有極大地挑戰(zhàn)性。由于核酸適配體可以與多種多樣信號放大技術兼容的特點，具有nmol/L范圍KD的核酸適配體已經能夠滿足絕大多數應用場景檢測靈敏度的需求。由于體外篩選壓力的復雜程度遠小于體內抗體的產生過程，相比抗體，核酸適配體的識別能力更容易受到樣品基質、傳感界面的影響。對高特異性核酸適配體的需求因此高于進一步提高核酸適配體的親和力。理論上不可能獲得絕對特異性的核酸適配體，只能篩選獲得在特定應用場景下滿足特異性需求的核酸適配體，因此在篩選過程的實驗條件選擇時應密切結合實際應用場景。

b.人工智能大數據分析技術將助力高性能核酸適配體的發(fā)現。高通量測序的數據利用率極低，缺少快速、準確分析序列二級結構的工具。候選序列的篩選還主要依賴豐度排序和一級結構中的保守序列出現的頻次。不少的研究數據均已表明，更有性能的核酸適配體未必在豐度上占據優(yōu)勢。隨著人工智能和技術輔助技術的快速發(fā)展，將極大地助力高通量序列分析和高性能核酸適配體的識別與序列優(yōu)化設計。

c.核酸適配體評價技術體系亟需完善。2019年和2021年國家市場監(jiān)督管理總局、中國國家標準化管理委員會先后發(fā)布了《核酸適配體體外篩選技術導則》（GB/T 38137-2019）和《核酸適配體親和力和特異性評價技術導則》（GB/T 40187-2021）。但是上述兩個導則，內容不夠具體，對實際核酸適配體的篩選和評價的指導性極為有限。近些年來核酸適配體篩選技術和評價技術快速進展，涌現出大量新方法新技術。特別是對核酸適配體的親和力（KD）和特異性評價，亟需建立相對標準化的具體實驗規(guī)范和定量方法。

建議廣大從事核酸適配體篩選領域研發(fā)的技術人員在KD評價時至少使用兩種不同的表征技術，其中至少一種為均相表征技術。在進行蛋白質靶標適配體KD評價時，不但要以膜蛋白高表達的細胞為靶標進行KD測試，還應該盡可能地以純化蛋白質為靶標進行測試。鑒于動力學測試KD的方法受界面探針密度、界面電荷、靶標濃度等因素影響較大，盡可能地基于熱力學平衡的方法進行KD的測定。在進行特異性評價時，應選擇盡可能多的結構類似物和實際應用場景相關的可能干擾物進行測試?？紤]到交叉反應性與測試物的濃度密切相關，應該在實際應用場景中的常見濃度下進行測試，結構類似物和可能干擾物的濃度可以比實際應用場景的濃度更高。建議分別測試核酸適配體對正篩靶標、最相關的結構類似物或者可能干擾物的KD，而不僅僅是定性比較。

盡管高通量的蛋白質芯片技術、微液滴（微球）展示技術為核酸適配體的高通量評價提供了策略。但由于其價格昂貴，適用范圍的局限性，并未得到廣泛推廣應用。研發(fā)低成本、高通量的核酸適配體評價技術對于闡明文庫進化規(guī)律，推動高性能核酸適配體的識別與序列優(yōu)化設計的人工智能化均具有重要意義。