涂媛，章培，陳瓊，李文琴

（成都市第二人民醫(yī)院 病理科，四川 成都 610017）

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）是一種惡性程度高、侵襲力強(qiáng)、病死率高的惡性腫瘤，主要表現(xiàn)為咳嗽、咳血等非特異性臨床癥狀[1]。盡管近年來(lái)影像學(xué)診斷技術(shù)的不斷革新，但是NSCLC早期診斷的難度系數(shù)仍然較高，大部分患者確診時(shí)病情較嚴(yán)重，療效不佳[2]。因此，尋找早期診斷NSCLC的潛在生物標(biāo)志物是目前臨床研究的熱點(diǎn)。范科尼貧血D2蛋白（Fanconi anemia D2 protein,FANCD2）是范科尼貧血（Fanconi anemia,FA）基因家族的成員之一，在DNA雙鏈斷裂后的重組修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3]，已有研究證實(shí)，F(xiàn)ANCD2可參與卵巢癌[4]、食管鱗狀細(xì)胞癌[5]等病情進(jìn)展。乳腺癌易感基因2定位協(xié)作蛋白（partner and localizer of BRCA2,PALB2）是乳腺癌易感基因（breast cancer susceptibility gene,BRCA）超家族成員，可協(xié)調(diào)BRCA1、BRCA2參與乳腺癌、前列腺癌等疾病的DNA同源重組修復(fù)[5]。有研究顯示，F(xiàn)ANCD2與PALB2基因同時(shí)缺失，協(xié)同導(dǎo)致乳腺癌化療耐藥性增加[6]。然而NSCLC癌組織中FANCD2、PALB2的表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后關(guān)系的前瞻性研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究擬探討NSCLC癌組織中FANCD2、PALB2表達(dá)水平與患者臨床特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年11月—2019年10月成都市第二人民醫(yī)院收治的194例NSCLC患者作為研究對(duì)象。其中男性116例，女性78例；年齡18～85歲，平均（60.59±9.43）歲。將手術(shù)過(guò)程中取得癌組織標(biāo)本作為NSCLC組，將對(duì)應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本作為癌旁組，各194例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理活檢確診為NSCLC，并符合《中華醫(yī)學(xué)會(huì)腫瘤學(xué)分會(huì)肺癌臨床診療指南（2021版）》[7]診斷標(biāo)準(zhǔn)；②入院前未接受過(guò)抗癌治療；③患者及監(jiān)護(hù)人知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位惡性腫瘤；②腦、心、腎等功能異常；③妊娠或產(chǎn)后女性；④精神異常、認(rèn)知異常、出院后失訪及拒絕參與本研究。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)已審核批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑和儀器

兔抗人FANCD2單克隆抗體、兔抗人PALB2單克隆抗體（天津塞爾生物技術(shù)有限公司）；羊抗兔二抗免疫球蛋白G（Immunoglobulin G,IgG）（艾美捷科技有限公司）；二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine,DAB）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；光學(xué)顯微鏡（深圳西派克光學(xué)儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)法FANCD2、PALB2檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)FANCD2、PALB2在NSCLC患者癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況。首先將手術(shù)取得的組織標(biāo)本進(jìn)行固定（4%多聚甲醛，4 h）、石蠟包埋、切片（厚度4 μm）、脫蠟（二甲苯，20 min），然后進(jìn)行孵育（5%過(guò)氧化氫溶液）、梯度乙醇脫水（100%、95%、85%、75%）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution,PBS）沖洗3次，3 min/次，加入山羊血清抗體封閉10 min；加入兔抗人FANCD2單克隆抗體（1∶100）、兔抗人PALB2單克隆抗體（1∶150），4 ℃孵育過(guò)夜；第2天取出后室溫下靜置30 min，加入PBS沖洗3次，3 min/次，加入羊抗兔二抗IgG，室溫孵育30 min，加入PBS沖洗3次，3 min/次，DAB染色試劑盒顯色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.3.2 結(jié)果判定 由2位病理專家采用雙盲法對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)定（取均值），陽(yáng)性細(xì)胞在光學(xué)顯微鏡下觀察到細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色或者黃色顆粒。染色指數(shù)=染色強(qiáng)度評(píng)分×陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分，染色指數(shù)≤ 4分即可判斷為陰性表達(dá)，5～12分可判斷為陽(yáng)性表達(dá)。染色強(qiáng)度評(píng)分：分為無(wú)色、淺黃色、黃色、棕黃色，分別計(jì)0、1、2、3分；陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞或陽(yáng)性細(xì)胞占比≤5%、＞ 5%～25%、＞ 25%～50%、＞ 50%～75%、＞ 75%，分別計(jì)0、1、2、3、4分[8]。

1.3.3 隨訪 NSCLC患者出院后通過(guò)電話溝通、門診復(fù)查等方式連續(xù)隨訪3年。術(shù)后第1年，間隔3個(gè)月復(fù)查1次；術(shù)后第2年起，間隔6個(gè)月復(fù)查1次。診斷為復(fù)發(fā)的患者根據(jù)個(gè)體情況選擇進(jìn)一步手術(shù)、保守治療等治療方式（支氣管鏡取腫瘤組織進(jìn)行病理檢查，或吸取支氣管分泌物作細(xì)胞學(xué)檢查出癌細(xì)胞為復(fù)發(fā)）。統(tǒng)計(jì)隨訪期間患者的總生存率，患者出現(xiàn)NSCLC導(dǎo)致死亡則終止，隨訪截止時(shí)間為2022年10月30日。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析用Spearman法；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，比較用Log-rank χ2檢驗(yàn)；影響因素的分析用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FANCD2、PALB2在NSCLC患者癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況比較

兩組FANCD2、PALB2陽(yáng)性率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），NSCLC組高于癌旁組。見(jiàn)表1和圖1、2。

圖1 兩組FANCD2陽(yáng)性表達(dá) （×400）

圖2 兩組PALB2陽(yáng)性表達(dá) （×400）

表1 FANCD2、PALB2在NSCLC患者癌組織及癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)比較 [n =194，例（%）]

2.2 NSCLC患者癌組織中FANCD2蛋白與PALB2蛋白的相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析顯示，NSCLC患者癌組織中FANCD2蛋白與PALB2蛋白呈正相關(guān)（rs=0.486，P=0.000）。

2.3 癌組織中FANCD2、PALB2陽(yáng)性表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系

不同年齡、性別、吸煙、組織學(xué)分型、腫瘤直徑患者FANCD2、PALB2陽(yáng)性率比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同TNM分期、分化程度和有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者FANCD2、PALB2陽(yáng)性率比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），TNM分期Ⅲ、Ⅳ期，低分化，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者分別高于TNM分期I、Ⅱ期，中、高分化，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者。見(jiàn)表2。

表2 不同臨床病理特征NSCLC患者FANCD2和PALB2陽(yáng)性表達(dá)率比較 例（%）

2.4 影響NSCLC患者復(fù)發(fā)的Cox回歸分析

單因素Cox回歸分析結(jié)果表明，不同TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FANCD2陽(yáng)性表達(dá)、PALB2陽(yáng)性表達(dá)是NSCLC患者復(fù)發(fā)的影響因素（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 NSCLC患者復(fù)發(fā)的單因素Cox回歸分析參數(shù)

將NSCLC患者復(fù)發(fā)（未復(fù)發(fā)= 0，復(fù)發(fā)= 1）作為因變量，將TNM分期（Ⅰ/Ⅱ期= 0，Ⅲ/Ⅳ期= 1）、分化程度（中/高分化= 0，低分化= 1）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（否=0，是= 1）、FANCD2表達(dá)（陰性= 0，陽(yáng)性= 1）和PALB2表達(dá)（陰性= 0，陽(yáng)性= 1）作為自變量，進(jìn)行多因素逐步Cox回歸分析（α入= 0.05，α出= 0.10），結(jié)果顯示：TNM分期Ⅲ、Ⅳ期[=4.125（95% CI：2.187，10.035）]、低分化[=3.146（95% CI：3.115，9.264）]、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[=4.124（95% CI：3.005，13.145）]、FANCD2陽(yáng)性[=5.146（95% CI：3.784，12.689）]、PALB2陽(yáng)性[=4.563（95% CI：2.845，7.398）]是NSCLC患者復(fù)發(fā)的影響因素（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 NSCLC患者復(fù)發(fā)的多因素逐步Cox回歸分析參數(shù)

2.5 影響NSCLC患者預(yù)后的Cox回歸分析

單因素Cox回歸分析結(jié)果表明，不同TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FANCD2陽(yáng)性表達(dá)、PALB2陽(yáng)性表達(dá)是NSCLC患者預(yù)后的影響因素（P＜0.05）。見(jiàn)表5。

表5 NSCLC患者預(yù)后的單因素Cox回歸模型分析參數(shù)

將NSCLC患者預(yù)后（生存= 0，死亡= 1）作為因變量，將單因素分析有意義TNM分期（Ⅰ/Ⅱ期= 0，Ⅲ/Ⅳ期= 1）、分化程度（中/高分化= 0，低分化= 1）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（否= 0，是= 1）、FANCD2表達(dá)（陰性= 0，陽(yáng)性= 1）和PALB2表達(dá)（陰性= 0，陽(yáng)性= 1）的指標(biāo)作為自變量，進(jìn)行多因素逐步Cox回歸分析（引入水準(zhǔn)=0.05，排除水準(zhǔn)=0.10），結(jié)果顯示：TNM分期Ⅲ、Ⅳ期[=3.689，（95% CI：2.963，11.254）]、低分化[=2.167，（95% CI：1.998，5.996）]、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[=5.648，（95% CI：3.552，12.953）]、FANCD2陽(yáng)性[=3.886，（95% CI：2.958，12.775）]、PALB2陽(yáng)性[=4.633，（95% CI：1.968，11.547）]是NSCLC患者預(yù)后的影響因素（P＜0.05）。見(jiàn)表6。

表6 NSCLC患者預(yù)后的多因素逐步Cox回歸分析參數(shù)

2.6 癌組織中不同F(xiàn)ANCD2、PALB2表達(dá)NSCLC患者的預(yù)后分析

截至隨訪結(jié)束，194例患者中102例（52.58%）生存。其中145例FANCD2陽(yáng)性患者生存64例（44.13%），49例FANCD2陰性患者生存38例（77.55%）；137例PALB2陽(yáng)性患者存活62例（45.26%），57例PALB2陰性患者存活40例（70.18%）。FANCD2陽(yáng)性患者與陰性患者生存率比較，經(jīng)Log-rank χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=35.132，P=0.000），PALB2陽(yáng)性患者與陰性患者的生存率比較，經(jīng)Log-rank χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=36.157，P=0.000）。見(jiàn)圖3、4。

圖3 FANCD2陰性和陽(yáng)性NSCLC患者的生存曲線

圖4 PALB2陰性和陽(yáng)性NSCLC患者的生存曲線

3 討論

NSCLC約占肺癌患者的80%～85%，因不易被早期診斷，多數(shù)患者確診時(shí)處于中晚期，預(yù)后較差[9]。據(jù)2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示，肺癌的新發(fā)病例數(shù)高達(dá)220萬(wàn)，位居惡性腫瘤的第2位[10]。因此，尋找與NSCLC病情進(jìn)展有關(guān)的標(biāo)志物，對(duì)提高臨床療效及延長(zhǎng)預(yù)后生存期非常關(guān)鍵。

FANCD2作為FA/BRCA通路的關(guān)鍵蛋白，其單泛素化后可參與惡性腫瘤患者DNA損傷后的同源重組修復(fù)過(guò)程[11]。朱嬌等[12]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ANCD2基因突變是卵巢上皮癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。FENG等[13]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ANCD2高表達(dá)與乳腺癌患者的低生存率有關(guān)，可作為預(yù)后評(píng)估的標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，NSCLC組FANCD2陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組，提示FANCD2與NSCLC可能存在明顯相關(guān)性。進(jìn)一步對(duì)FANCD2與NSCLC患者臨床特征的關(guān)系進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，TNM分期高、分化程度低、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NSCLC患者的FANCD2陽(yáng)性表達(dá)率更高，證實(shí)了FANCD2可能參與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展。惡性腫瘤患者普遍存在DNA雙鏈斷裂現(xiàn)象，DNA斷裂后可激活相關(guān)信號(hào)通路，刺激FANCD2表達(dá)并與相關(guān)修復(fù)蛋白共同移動(dòng)至DNA斷裂部位，協(xié)同發(fā)揮DNA修復(fù)作用[14]。既往相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ANCD2低表達(dá)可增加DNA損傷和減少S期細(xì)胞，進(jìn)而降低癌細(xì)胞的增殖能力[15]。推測(cè)FANCD2高表達(dá)可能是通過(guò)增強(qiáng)癌細(xì)胞增殖能力進(jìn)而參與NSCLC的進(jìn)展，當(dāng)然具體聯(lián)系及作用機(jī)制有待下一步進(jìn)行細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。多因素Cox回歸模型預(yù)后分析表明，TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FANCD2表達(dá)、PALB2表達(dá)是NSCLC患者復(fù)發(fā)的影響因素，TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FANCD2表達(dá)、PALB2表達(dá)是NSCLC患者預(yù)后的影響因素，提示癌組織中FANCD2表達(dá)是NSCLC患者復(fù)發(fā)和預(yù)后的影響因素，可作為預(yù)后評(píng)估的潛在標(biāo)志物。NSCLC患者癌組織中FANCD2陽(yáng)性可增加術(shù)后癌癥復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，減少生存收益。

PALB2是一種癌癥易感基因，其基因位于16p12.2，在DNA損傷重組修復(fù)、基因組的穩(wěn)定性維持、細(xì)胞周期調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用[16]。既往研究發(fā)現(xiàn)，PALB2可使重組酶51移動(dòng)至DNA損傷部位，從而修復(fù)化療引起的DNA損傷，進(jìn)而增加化療藥物的敏感性[17]。陸霞娟等[18]報(bào)道稱，PALB2在胃癌黏膜組織中呈高表達(dá)，可作為胃癌患者預(yù)后不良生物的標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，NSCLC組PALB2的陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組，提示PALB2可能在NSCLC發(fā)病及病情進(jìn)展中發(fā)揮重要的作用。本研究結(jié)果顯示，PALB2陽(yáng)性表達(dá)與NSCLC患者TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)PALB2可能與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。PALB2可通過(guò)末端特殊結(jié)構(gòu)域與BRCA1、BRCA2相互作用，參與癌癥患者DNA損傷后的同源性重組修復(fù)，并介導(dǎo)P53信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)癌細(xì)胞增殖與分化[19]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，PALB2與BRCA1相關(guān)作用后可阻礙環(huán)鳥苷酸-腺苷酸合成酶-干擾素基因刺激蛋白途徑，進(jìn)而誘導(dǎo)惡性腫瘤的免疫抑制和T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)[20]。因此，推測(cè)PALB2可參與NSCLC發(fā)病及進(jìn)展過(guò)程，但具體發(fā)病機(jī)制還需深入研究。

多因素逐步Cox回歸模型預(yù)后分析表明，TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FANCD2表達(dá)、PALB2表達(dá)是NSCLC患者復(fù)發(fā)的影響因素，TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FANCD2表達(dá)、PALB2表達(dá)是NSCLC患者預(yù)后的影響因素，提示癌組織中PALB2表達(dá)是NSCLC患者復(fù)發(fā)和預(yù)后的影響因素，PALB2陽(yáng)性與NSCLC患者生存率低有關(guān)，監(jiān)測(cè)其表達(dá)情況可指導(dǎo)臨床治療方案制定。

綜上所述，F(xiàn)ANCD2、PALB2在NSCLC患者癌組織中呈高表達(dá)，與TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)、可作為輔助評(píng)估患者生存和復(fù)發(fā)的潛在標(biāo)志物。