曹天然，劉青芳，潘美民，陳勇

（長沙市第一醫(yī)院 1.臨床試驗研究中心，2.神經(jīng)醫(yī)學(xué)中心，3.皮膚科，湖南 長沙 410005）

缺血性腦卒中（ischemic stroke,ICH）是臨床多發(fā)病，具有發(fā)病率、病死率、致殘率和復(fù)發(fā)率高等特點，給家庭和社會帶來了沉重負擔(dān)[1]。對于ICH的干預(yù)，目前國際研究金標準是溶解血栓以恢復(fù)血流[2]，實現(xiàn)再灌注是治療這類疾病的必要條件。然而，再灌注可能會進一步加重缺血性腦損傷，即腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI）[3-4]。CIRI涉及多種病理、生理過程，包括氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)元死亡和細胞凋亡等，在CIRI的發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[5-6]。目前的干預(yù)手段是針對CIRI進行多靶點干預(yù)，即對神經(jīng)損傷的多個途徑進行阻斷。但該病尚缺乏有效的治療藥物，故研究CIRI的病因及尋找藥物新靶點具有重要意義。

小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的固有免疫細胞，在維持中樞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定、防止病原的入侵、調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)病理生理過程中起著重要作用[7]。研究表明，腦部駐留的小膠質(zhì)細胞在腦梗死后被募集到病變部位后再激活，激活后的小膠質(zhì)細胞可以極化為“經(jīng)典激活”的巨噬細胞M1和“交替激活”的巨噬細胞M2兩種表型[8]。其中，巨噬細胞M1產(chǎn)生促炎細胞因子，例如CD16、CD32、CD86和誘導(dǎo)性一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS），被認為對腦梗死組織恢復(fù)有害。相比之下，巨噬細胞M2合成抗炎介質(zhì)，包括白細胞介素-4（Interleutin-4,IL-4）、IL-10、IL-13和轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）被認為是有益的[9]?；谛∧z質(zhì)細胞的激活和極化在腦缺血再灌注恢復(fù)過程中的動態(tài)變化，調(diào)整M1/M2細胞比率可能有助于CIRI后腦炎癥反應(yīng)。因此，探索在急性缺血性半影區(qū)平衡小膠質(zhì)細胞表型的新型免疫調(diào)節(jié)可能為預(yù)防或減少CIRI提供可行的策略。

環(huán)形交叉軸突導(dǎo)向受體同源物4（Robo4）蛋白環(huán)是一種跨膜受體，在調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞功能和炎癥中起著至關(guān)重要的作用[10]。但其是否在腦缺血再灌注小膠質(zhì)細胞極化中發(fā)揮調(diào)控作用暫不清楚。因此本研究觀察了Robo4在腦缺血后小膠質(zhì)細胞極化過程中的作用，以期為CIRI的治療探索新靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

60只健康雄性成年Sprague-Dawley大鼠[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2021-0006，實驗動物使用許可證號：SYXK（京）2022-0052]，體重250～280 g，購買于北京維通利華有限公司。動物實驗通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會科學(xué)研究項目審批[No：（2021）倫理(臨研)第61號]。BCA試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）凝膠和聚偏二氟乙烯膜購自美國Millipore公司。RIPA緩沖液和BCA蛋白測定試劑盒購自中國Beyotime公司。IL-1β和IL-10、TNF-α、TGF-β酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）試劑盒購自上海酶聯(lián)生物生物科技有限公司。TRIzol試劑購自美國Invitroge公司。Prime ScriptTMRT試劑盒購自日本TaKaRa株式會社。Robo4、iNOS、CD86、Arg-1、CD206、Notch-1、Hes1和Hes5抗體購自美國Abcam公司。慢病毒載體及其陰性對照購自上海漢恒生物科技有限公司。

1.2 動物分組與模型復(fù)制

所有大鼠被隨機分為假手術(shù)（Sham）組、大腦中動脈短暫性閉塞/再灌注（tMCAO/R）組、tMCAO/R聯(lián)合過表達Robo4慢病毒陰性載體（tMCAO/R+Lvscramble）組、tMCAO/R聯(lián)合過表達Robo4慢病毒載體（tMCAO/R + Lv-Robo4）組，每組15只。將5 μL Robo4過表達慢病毒載體（1×109TU/mL）或Robo4過表達慢病毒陰性載體（4×108TU/mL）于tMACO前7 d注入大鼠左側(cè)腦室，24 h后取腦組織待測。

小心分離出大鼠左側(cè)頸總動脈、頸外動脈（external carotid artery,ECA）和頸內(nèi)動脈（internalcarotid artery,ICA）并將其完全暴露。在結(jié)扎ECA及其分支的遠端后，將硅膠涂層尼龍單絲通過ECA插入ICA并輕輕推進到大腦中動脈。大腦中動脈短暫性閉塞（transient middle cerebral artery occlusion,tMCAO） 1.5 h后，恢復(fù)腦灌注（再灌注24 h）。在整個手術(shù)和閉塞期間，用加熱燈將體溫保持在（37.0±0.5）℃。Sham組大鼠除置入尼龍單絲外，其余操作同上。大鼠清醒后，如果出現(xiàn)站立不穩(wěn)，左側(cè)肢體癱瘓，提尾時向一側(cè)轉(zhuǎn)圈則說明tMCAO模型復(fù)制成功[8]。

1.3 神經(jīng)功能檢測

再灌注后24 h后根據(jù)Longa評分法評估神經(jīng)功能缺損[11]。無神經(jīng)功能缺陷計0分；右前爪不能完全伸展計1分；爬行時癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈計2分；爬行時向癱瘓側(cè)傾倒計3分；不能自發(fā)行走，意識水平低下或死亡計4分。得分為1～3分、無癲癇發(fā)作或腦出血的大鼠視為模型復(fù)制成功。共有Sham組（15只）、tMCAO/R組（13只）、tMCAO/R + Lv-scramble組（12只）、tMCAO/R + Lv-Robo4組（13只）納入后續(xù)研究。同時，每組隨機選取6只大鼠檢測腦梗死面積，其余大鼠腦組織用于實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRTPCR）、Western blotting、ELISA檢測。

1.4 2，3，5-三苯基氯化四氮唑法檢測大鼠腦梗死面積

取出大鼠大腦，切除嗅球、小腦和腦干，并以2 mm的間隔進行冠狀切片。然后將切片浸入1% 2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）溶液20 min，在4 ℃下用4%多聚甲醛固定24 h。腦組織未梗死部分呈紅色，梗死部分呈白色。使用Image-Pro Plus 6.0軟件計算腦切片的梗死面積和總面積。

1.5 qRT-PCR檢測大鼠腦組織中Robo4 mRNA表達

使用TRIzol試劑提取總RNA。然后將各組大鼠RNA用PrimeScriptTM RT試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。qRT-PCR使用iQ SYBR Green Supermix試劑盒在Light Cycler熱循環(huán)儀系統(tǒng)下進行。Robo4正向引物：5'-GGCCCCACCTCCTGCTGAAAAC-3'，反向引物：5'-G GACGGCACCACTGGCAATGACT-3'，均329 bp；GAPDH正向引物：5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3'，反向引物：5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'，均70 bp。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性3 s，60 ℃延伸20 s，共40個循環(huán)。根據(jù)2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

1.6 Western blotting檢測大鼠腦組織中Robo4、iNOS、CD86、Arg-1、CD206、Notch-1、Hes1和Hes5蛋白表達

腦組織在RIPA緩沖液中裂解后，通過BCA蛋白測定試劑盒測定上清液中的總蛋白濃度。8% SDSPAGE電泳后轉(zhuǎn)移到聚乙烯二氟胺膜上。在室溫下于5%脫脂牛奶中封閉2 h后，將膜與一抗孵育過夜。用吐溫-20羥甲基氨甲烷緩沖溶液洗滌3次后，將印跡與偶聯(lián)辣根過氧化物酶的抗兔或抗大鼠免疫球蛋白G在室溫下孵育1.5 h，條帶曝光，最后凝膠成像系統(tǒng)分析圖像并計算光密度值，以β-actin為內(nèi)參。

1.7 ELISA檢測腦組織炎癥因子表達

將腦組織在磷酸鹽緩沖鹽溶液（pH 7.4）中研磨成勻漿。將勻漿液放置離心管中以3 000 r/min離心20 min，收集上清液。根據(jù)制造商的方案，使用ELISA試劑盒檢測TNF-α、IL-1β、IL-10和TGF-β水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均值±標準差（±s）表示，比較用方差分析或H檢驗，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠Longa評分比較

Sham組、tMCAO/R組、tMCAO/R + Lv-scramble組、tMCAO/R + Lv-Robo4組大鼠Longa評分分別為（0.00±0.00）、（2.86±0.58）、（2.98±0.49）、（1.32±0.38）分，經(jīng)H檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（H=45.740，P=0.000），tMCAO/R組Longa評分較Sham組高。tMCAO/R + Lv-Robo4組較tMCAO/R + Lv-scramble組Longa評分低。

2.2 各組大鼠腦梗死面積比較

Sham組、tMCAO/R組、tMCAO/R + Lv-scramble組、tMCAO/R + Lv-Robo4組大鼠腦梗死面積分別為（0.00±0.00）%、（35.64±1.58）%、（37.18±1.35）%、（12.12±1.31）%，經(jīng)H檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（H=20.291，P=0.000），tMACO/R組較Sham組腦梗死面積大，tMCAO/R + Lv-Robo4組較tMCAO/R + Lvscramble組腦梗死面積小。見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織橫切面圖 （TTC染色）

2.3 各組大鼠腦組織Robo4 mRNA和蛋白相對表達量比較

各組大鼠腦組織Robo4 mRNA和蛋白相對表達量比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），進一步兩兩比較，tMACO/R組大鼠腦組織Robo4 mRNA和蛋白相對表達量較Sham組低，tMCAO/R + Lv-Robo4組Robo4 mRNA和蛋白相對表達量較tMCAO/R + Lvscramble組高。見表1和圖2。

表1 各組大鼠Robo4 mRNA和蛋白相對表達量比較 （±s）

表1 各組大鼠Robo4 mRNA和蛋白相對表達量比較 （±s）

注：①與Sham組比較，P ＜0.05；②與tMCAO/R + Lv-scramble組比較，P ＜0.05。

n 9 7 6 7組別Sham組tMCAO/R組tMCAO/R + Lv-scramble組tMCAO/R + Lv-Robo4組F 值P 值Robo4 mRNA 1.00±0.13 0.27±0.12①0.22±0.09 0.67±0.15②64.941 0.000 Robo4蛋白0.51±0.07 0.15±0.04①0.12±0.03 0.34±0.05②92.723 0.000

圖2 各組大鼠腦組織Robo4蛋白條帶圖

2.4 各組大鼠腦組織iNOS、CD86、Arg-1和CD206蛋白相對表達量比較

各組大鼠腦組織iNOS、CD86、Arg-1和CD206蛋白相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），tMACO/R組大鼠腦組織iNOS、CD86、Arg-1和CD206蛋白相對表達量較Sham組高，tMCAO/R + Lv-Robo4組大鼠腦組織iNOS、CD86較tMCAO/R + Lv-scramble組低，Arg-1、CD206較tMCAO/R + Lv-scramble組高。見圖3和表2。

表2 各組大鼠iNOS、CD86、Arg-1和CD206蛋白相對表達量比較 （±s）

表2 各組大鼠iNOS、CD86、Arg-1和CD206蛋白相對表達量比較 （±s）

注：①與Sham組比較，P ＜0.05；②與tMCAO/R+Lv-scramble組比較，P ＜0.05。

組別Sham組tMCAO/R組tMCAO/R+Lv-scramble組tMCAO/R+Lv-Robo4組F 值P 值CD206 0.21±0.08 0.36±0.03①0.39±0.08 0.54±0.09②26.390 0.000 n9 7 6 7 iNOS 0.16±0.06 0.50±0.09①0.46±0.08 0.32±0.06②35.612 0.000 CD86 0.34±0.04 0.74±0.14①0.73±0.14 0.47±0.09②26.742 0.000 Arg-1 0.16±0.04 0.39±0.11①0.29±0.09 0.56±0.08②33.621 0.000

圖3 各組大鼠iNOS、CD86、Arg-1和CD206蛋白條帶圖

2.5 各組大鼠腦組織Notch-1、Hes1和Hes5蛋白相對表達量比較

各組大鼠腦組織Notch-1、Hes1和Hes5相對表達量比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），tMACO/R組較Sham組高，tMCAO/R + Lv-Robo4組較tMCAO/R +Lv-scramble組低。見圖4和表3。

表3 各組大鼠-1、Hes1和Hes5蛋白相對表達量比較 （±s）

表3 各組大鼠-1、Hes1和Hes5蛋白相對表達量比較 （±s）

注：①與Sham組比較，P ＜0.05；②與tMCAO/R + Lv-scramble組比較，P ＜0.05。

Notch-1 0.31±0.12 0.93±0.04①0.94±0.13 Hes1 0.08±0.03 0.32±0.05①0.38±0.07 Hes5 0.05±0.02 0.37±0.08①0.38±0.06 n9 7 6 7組別Sham組tMCAO/R組tMCAO/R + Lvscramble組tMCAO/R + Lv-Robo4組F 值P 值0.17±0.08②50.012 0.000 0.73±0.11②61.751 0.000 0.24±0.03②62.823 0.000

圖4 各組大鼠Notch-1、Hes1和Hes5蛋白條帶圖

2.6 各組大鼠腦組織TNF-α、IL-1β、IL-10、TGFβ水平比較

各組大鼠腦組織TNF-α、IL-1β、IL-10、TGF-β水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），tMACO/R組較Sham組高，tMCAO/R + Lv-Robo4組大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β水平較tMCAO/R + Lv-scramble組低，IL-10、TGF-β水平較tMCAO/R + Lv-scramble組高。見表4。

表4 各組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-10、TGF-β相對表達量比較 （pg/mL，±s）

表4 各組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-10、TGF-β相對表達量比較 （pg/mL，±s）

注：①與Sham組比較，P ＜0.05；②與tMCAO/R + Lv-scramble組比較，P ＜0.05。

組別Sham組tMCAO/R組tMCAO/R + Lv-scramble組tMCAO/R + Lv-Robo4組F 值P 值TGF-β 26.18±4.19 62.85±8.62①53.66±4.25 80.15±5.20②122.201 0.000 n9 7 6 7 TNF-α 56.29±17.12 152.28±19.76①141.51±22.61 101.22±21.59②37.220 0.000 IL-1β 36.17±16.91 82.41±17.28①92.16±16.37 48.49±17.29②18.094 0.000 IL-10 52.38±16.11 123.72±20.38①118.32±18.42 192.13±28.11②58.622 0.000

3 討論

CIRI是一個復(fù)雜的病理、生理過程，涉及到自由基的過度積累、鈣超載、興奮氨基酸的毒性作用、炎癥反應(yīng)和細胞炎癥因子的大量釋放，以及細胞凋亡的加劇等[12]。目前，普遍認為炎癥在CIRI中起著關(guān)鍵作用，其在腦缺血急性期會促進炎癥級聯(lián)反應(yīng)，進而引起腦水腫出血，增加血腦屏障損傷，促進更多神經(jīng)元死亡[13-14]，而在腦缺血晚期，神經(jīng)炎癥通路對組織修復(fù)和功能恢復(fù)有益[15-16]。而小膠質(zhì)細胞作為腦內(nèi)的常駐免疫細胞被認為在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[17]。當接觸到內(nèi)源性信號（如神經(jīng)元死亡）或外源性刺激信號（如感染）時，腦損傷組織的小膠質(zhì)細胞會激活和遷移，且伴隨有炎癥因子水平升高的跡象[18]。激活的小膠質(zhì)細胞有M1和M2兩種極化表型：M1型促炎小膠質(zhì)細胞的吞噬作用減少，促炎介質(zhì)分泌增加，而M2型抗炎小膠質(zhì)細胞能清除缺血組織，并顯著抑制腦損傷[19]。與之一致，本研究結(jié)果中的tMACO/R組大鼠腦組織M1小膠質(zhì)細胞標志物（iNOS和CD86）及M2小膠質(zhì)細胞標志物（Arg-1和CD206）的蛋白相對表達量顯著上升，說明小膠質(zhì)細胞遷移至腦損傷組織并被激活。此外，tMACO/R組大鼠腦組織炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-10、TGF-β水平升高。在各種腦損傷發(fā)展過程中，免疫系統(tǒng)被激活，免疫細胞產(chǎn)生細胞因子參與協(xié)調(diào)腦損傷免疫反應(yīng)。細胞因子通常分為促炎癥因子，如TNF-α和IL-1β，或抗炎癥因子，如IL-10和TGF-β。急性腦損傷后引起細胞因子發(fā)生動態(tài)變化，這些變化部分依賴于激活的小膠質(zhì)細胞和巨噬細胞，其釋放促炎因子和抗炎因子，促進或解決腦損傷后的炎癥反應(yīng)[20]。因此，本課題組認為，在治療腦缺血早期，通過改變小膠質(zhì)細胞的極化狀態(tài)，可能是一種有前景的腦缺血腦卒中的治療策略，小膠質(zhì)細胞也成為一個重要靶點。

Robo4蛋白環(huán)作為一種跨膜受體，在一些血管疾病進展及炎癥反應(yīng)中起著重要作用[21-22]，參與多個生物學(xué)過程，如內(nèi)皮細胞遷移、增殖和血管生成以及維持脈管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)[23-26]。但其在缺血性中風(fēng)病理過程中的作用知之甚少。有研究表明，激活Robo4-Paxillin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，將會減弱外科腦損傷誘導(dǎo)的血腦屏障破壞，并改善大鼠結(jié)局[27]。而且Robo4作為炎癥性疾病的潛在治療靶點，被發(fā)現(xiàn)過表達Robo4可能抑制血管通透性改善敗血癥或傳染病[28]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在CIRI 24 h后Robo4表達減少，說明Robo4可能在CIRI中發(fā)揮了重要作用。通過外源性于腦室內(nèi)注入過表達Robo4慢病毒載體后，大鼠神經(jīng)功能障礙得到明顯改善，腦梗死面積顯著變小。此外，筆者還發(fā)現(xiàn)，過表達Robo4抑制了M1小膠質(zhì)細胞標志物表達及IL-10、TGF-β的表達，卻促進了M2小膠質(zhì)細胞標志物表達及TNF-α、IL-1β的表達。這表明Robo4抑制M1表型極化小膠質(zhì)細胞，促進M2表型以限制炎癥反應(yīng)。筆者推測，Robo4可能通過影響CIRI后小膠質(zhì)細胞活化后表型的動態(tài)變化，進一步影響血腦屏障的完整性，從而對CIRI具有神經(jīng)保護作用。在后續(xù)研究中，本課題組將會特異性過表達大鼠腦組織小膠質(zhì)細胞Robo4，觀察其對CIRI后血腦屏障破壞的作用，深入研究Robo4對CIRI神經(jīng)保護作用的具體機制。

Notch信號通路是與炎癥反應(yīng)相關(guān)的信號通路，與多種炎癥性疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、心肌炎發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Robo4可以抑制Notch信號通路的異常激活。據(jù)報道，Notch信號通路在CIRI后被激活，人脂氧素A4通過Notch信號通路發(fā)揮其抗炎作用[29]。且Notch信號通路抑制劑DAPT在模型建立前3 h對局灶性腦缺血/再灌注具有神經(jīng)保護作用[30]。與其一致的是，筆者發(fā)現(xiàn)，與Sham組相比，tMACO/R組大鼠腦組織Notch-1、Hes1和Hes5蛋白表達水平顯著升高，Notch信號通路在CIRI后被異常激活。

綜上所述，Robo4可調(diào)控CIRI后小膠質(zhì)細胞極化向M2表型轉(zhuǎn)移，進而發(fā)揮小膠質(zhì)細胞抗炎的神經(jīng)保護作用，且可以調(diào)控Notch信號通路。