劉智俊，羅光華，周宏，蔣孝先，廖華之，伍海彪

（南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院 放射科，湖南 衡陽(yáng) 421001）

實(shí)體腫瘤壞死程度反映了腫瘤內(nèi)的缺氧水平，而缺氧與實(shí)體腫瘤放化療敏感性及臨床預(yù)后密切相關(guān)[1]。如何在術(shù)前精準(zhǔn)評(píng)價(jià)腫瘤壞死成為腫瘤研究一大挑戰(zhàn)之一。病理學(xué)檢查作為判斷腫瘤壞死程度的金標(biāo)準(zhǔn)，自身有較多不足，導(dǎo)致臨床應(yīng)用受限。而CT灌注成像特別是全臟器容積灌注成像具有相對(duì)無(wú)創(chuàng)性、覆蓋廣、可重復(fù)性高、可實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)進(jìn)行，以及與病理有較好相關(guān)性等多種優(yōu)勢(shì)，逐步成為研究活體肝腫瘤的血流灌注狀態(tài)的首選影像學(xué)評(píng)價(jià)方法。本研究通過(guò)復(fù)制兔肝VX2移植瘤動(dòng)物模型并采用全肝容積灌注CT成像（volume perfusion CT,VPCT），探討腫瘤的有效血流灌注、腫瘤體積（tumor volume,TV）與腫瘤壞死率（tumor necrosis rate,TNR）的關(guān)系，為研究人肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）腫瘤壞死程度的影像學(xué)檢測(cè)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 一般資料

55只不限雌雄的成年新西蘭大白兔，4～5個(gè)月齡，體重2.2～2.8 kg，購(gòu)自中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2020-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（湘）2020-0002]。采用隨機(jī)抽樣法選出5只進(jìn)行開(kāi)腹手術(shù)但不種瘤大白兔作為對(duì)照組（手術(shù)方法與實(shí)驗(yàn)組相同）。其余大白兔則按同一標(biāo)準(zhǔn)、同一開(kāi)腹直接種瘤法[2]（嚴(yán)格無(wú)菌手術(shù)開(kāi)腹，將小瘤塊直接種植于肝左葉深部并覆蓋，關(guān)腹）復(fù)制兔肝VX2移植瘤動(dòng)物模型作為實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組排除經(jīng)解剖和病理證實(shí)為未成功成瘤的、腫瘤種植于肝表面的、后處理圖像效果不佳的大白兔，最終共38只大白兔納入研究。

1.2 方法

1.2.1 VPCT檢查 麻醉藥物采用3%戊巴比妥鈉非揮發(fā)性麻醉劑，按1 mL/kg體重經(jīng)耳緣靜脈注射。動(dòng)物模型復(fù)制成功后的第14天采用雙源64層螺旋CT機(jī)（德國(guó)西門(mén)子公司）對(duì)兩組行全肝VPCT，具體掃描方法及掃描參數(shù)如下：掃描完定位圖像后，設(shè)計(jì)好掃描野以保證包含了全肝。采用CT機(jī)無(wú)縫連續(xù)動(dòng)態(tài)往復(fù)掃描模式來(lái)實(shí)現(xiàn)容積灌注成像檢查，采用雙筒高壓注射器（美國(guó)理博有限公司）注射非離子型對(duì)比劑碘佛醇（33.9 g/50 mL）（江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司），按1 mL/kg、1 mL/s經(jīng)留置針注入耳緣靜脈，隨即按同流率經(jīng)靜脈團(tuán)注5 mL生理鹽水沖洗。靜脈團(tuán)注完后延遲6 s，按80 kVp管電壓、50 mAs管電流、1.0 mm螺距、球管每0.33 s旋轉(zhuǎn)1周、48 mm探測(cè)器寬度的掃描參數(shù)連續(xù)掃描61 s，以1.5 mm層厚、1.5 mm層間距、512×512重建矩陣、B30f卷積核值進(jìn)行圖像重建，最終獲得30組容積數(shù)據(jù)（共包含930幅圖像）并全部傳輸至配套的圖像后處理工作站（Syngo MuliModality Workplace）。

1.2.2 TV、TNR及灌注后處理 TV、TNR及灌注后處理由2名高年資腹部影像診斷副主任醫(yī)師親自指導(dǎo)。同一只大白兔的TV重復(fù)處理、測(cè)量3次后取平均值，TNR及灌注參數(shù)亦按同法求平均值，如有不同意見(jiàn)則加入第三位高年資腹部影像診斷副主任醫(yī)師討論確定。選用在全肝VPCT動(dòng)脈期腫瘤實(shí)質(zhì)達(dá)強(qiáng)化峰值且對(duì)比最佳的腫瘤最大橫截面圖像作為目標(biāo)圖像（增強(qiáng)動(dòng)脈期第6組腫瘤圖像多呈顯著環(huán)形強(qiáng)化且對(duì)比度最佳，符合目標(biāo)圖像特點(diǎn)，故第6組最大橫截面圖像作為首選）。

TV計(jì)算公式為：V=1/2ab2。a為腫瘤最大徑，兩極定義為在目標(biāo)圖像上腫瘤最大橫截面上強(qiáng)化的最外緣；b為腫瘤最小徑，兩極定義為垂直于a的最外緣[3-4]。

TNR定義為在目標(biāo)圖像上無(wú)強(qiáng)化的壞死區(qū)橫截面積與腫瘤最大橫截面積的比值。在工作站目標(biāo)圖像上手繪出中央不強(qiáng)化的壞死區(qū)域獲得腫瘤壞死區(qū)橫截面積，按同法在同一目標(biāo)圖像上手繪出腫瘤最大橫截面上強(qiáng)化的最外緣得到腫瘤最大橫截面積。

選擇VPCT Body灌注軟件中的肝臟灌注應(yīng)用模塊進(jìn)行灌注后處理，獲得肝灌注血流量（blood flow,BF）、灌注血容量（blood volume,BV）、動(dòng)脈灌注量（arterial liver perfusion,ALP）、門(mén)靜脈灌注量（portal vein perfusion,PVP）、動(dòng)脈灌注指數(shù)（hepatic perfusion index,HPI）等全肝VPCT參數(shù)及彩圖。

1.2.3 病理學(xué)檢查 實(shí)驗(yàn)完后立即將實(shí)驗(yàn)組安樂(lè)死，取出腫瘤標(biāo)本進(jìn)行HE染色。染色后，置于低倍鏡下（×10）觀察切片整體壞死情況，再轉(zhuǎn)至高倍鏡（×40）下觀察腫瘤實(shí)質(zhì)與壞死的交界區(qū)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。比較用單因素方差分析，兩兩比較用Dunnett-t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析用Pearson法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)組癌組織、癌旁組織及對(duì)照組肝組織的全肝VPCT參數(shù)比較

實(shí)驗(yàn)組癌組織、癌旁組織及對(duì)照組肝組織BF、BV、ALP、PVP、HPI比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組癌組織與對(duì)照組肝組織BF、BV、ALP、PVP、HPI比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組癌旁組織與對(duì)照組肝組織BF、BV、ALP、PVP、HPI比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)組癌組織、癌旁組織及對(duì)照組肝組織的全肝VPCT參數(shù)比較 （±s）

表1 實(shí)驗(yàn)組癌組織、癌旁組織及對(duì)照組肝組織的全肝VPCT參數(shù)比較 （±s）

組別實(shí)驗(yàn)組癌組織實(shí)驗(yàn)組癌旁組織對(duì)照組肝組織F 值P 值n 38 38 5 BF/[mL/（100 mL·min）]248.15±74.17 200.89±71.44 204.54±2.74 4.403 0.015 BV/[mL/（100 mL·min）]23.72±7.17 20.02±7.08 19.62±2.03 2.943 0.049 ALP/[mL/（100 mL·min）]65.07±9.54 42.19±7.84 40.43±1.45 74.335 0.000 PVP/[mL/（100 mL·min）]14.49±2.40 121.84±9.38 119.39±5.39 2 515.780 0.000 HPI/%82.05±3.22 25.57±2.96 25.30±0.37 3 543.545 0.000

2.2 相關(guān)性分析

實(shí)驗(yàn)組平均TNR為（22.56±7.10）%。Pearson相關(guān)性分析顯示，TNR與ALP、HPI呈負(fù)相關(guān)（r=-0.410和-0.356，P=0.010和0.028），TNR與BF、BV、PVP無(wú)相關(guān)性（r=-0.016、-0.155和0.256，P=0.924、0.353和0.121）。見(jiàn)圖1、2。

圖1 TNR與ALP相關(guān)性散點(diǎn)圖

圖2 TNR與HPI相關(guān)性散點(diǎn)圖

實(shí)驗(yàn)組肝VX2移植瘤TV平均為（1.87±1.61）cm3。Pearson相關(guān)性分析顯示，TV與BF、BV、PVP、ALP、HPI無(wú)相關(guān)性（r=0.062、0.292、0.140、0.142和0.014，P=0.709、0.076、0.401、0.396和0.933）。

Pearson相關(guān)性分析顯示，肝VX2移植瘤TNR與TV無(wú)相關(guān)性（r=-0.098，P=0.559）。

2.3 CT與病理學(xué)檢查結(jié)果

在圖像工作站上發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組腫瘤位于腹中線肝內(nèi)種瘤位置，各兔腫瘤直徑不一，但可見(jiàn)數(shù)量均為1個(gè)，絕大部分呈類(lèi)圓形或類(lèi)橢圓形。與癌旁組織比較，平掃上腫瘤邊緣區(qū)呈等、稍低混雜密度而中心呈不均勻低密度，邊界不清，動(dòng)態(tài)增強(qiáng)上腫瘤邊緣區(qū)動(dòng)脈期快速顯著環(huán)形強(qiáng)化且接近腹主動(dòng)脈強(qiáng)化程度，接著強(qiáng)化快速減弱，在肝動(dòng)脈灌注彩圖上呈現(xiàn)邊緣環(huán)形高灌注，而中央一直無(wú)明顯強(qiáng)化或低灌注狀態(tài)。

將腫瘤標(biāo)本置于低倍鏡及高倍鏡下觀察，橫截面移植瘤邊緣區(qū)主要為環(huán)形異型性腫瘤細(xì)胞并夾雜較多粗細(xì)不均的腫瘤血管，中央主要為凝固性壞死。見(jiàn)圖3～5。

圖3 兔肝VX2移植瘤ALP、BF、BV、PVP、HPI的CT圖

圖4 全肝VPCT動(dòng)脈期腫瘤實(shí)質(zhì)達(dá)強(qiáng)化峰值且對(duì)比最佳的腫瘤最大橫截面CT圖

圖5 實(shí)驗(yàn)組肝VX2移植瘤病理切片 （HE染色×40）

3 討論

VX2腫瘤是應(yīng)用非常廣泛的惡性腫瘤動(dòng)物模型，涉及很多研究領(lǐng)域且根據(jù)成瘤的部位可分為如肝移植癌、骨移植癌、乳腺移植癌、肺移植癌、腦移植癌、腎移植癌、肌肉移植癌等[2，5-8]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組兔肝VX2移植瘤邊緣區(qū)癌組織的BF、BV、ALP、HPI高于癌旁組織及對(duì)照組肝組織，而PVP則低于癌旁組織及對(duì)照組肝組織。TONG等[2]通過(guò)對(duì)兔肝VX2移植瘤改良模型行對(duì)比增強(qiáng)CT檢查，YI等[9]通過(guò)超聲引導(dǎo)穿刺建立兔肝VX2移植瘤動(dòng)物模型并行對(duì)比增強(qiáng)超聲，均實(shí)驗(yàn)得出兔肝VX2移植瘤的肝血流灌注發(fā)生了顯著變化并于增強(qiáng)后腫瘤邊緣區(qū)實(shí)質(zhì)呈“快進(jìn)快出”強(qiáng)化模式，且血供主要來(lái)自于動(dòng)脈。梁長(zhǎng)華等[10]通過(guò)對(duì)HCC行CT全腫瘤灌注顯示HCC的血供是由門(mén)靜脈供血為主漸漸過(guò)渡到動(dòng)脈供血為主。這些結(jié)果表明，兔肝VX2移植瘤與人HCC之間的血供特征有很好的相似性，因而非常適合用于研究人HCC的動(dòng)物肝腫瘤模型。

劉曉等[11]研究發(fā)現(xiàn)全肝VPCT可替代微血管密度定量，評(píng)估兔VX2肝腫瘤經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞術(shù)治療前后的肝血流動(dòng)力學(xué)變化對(duì)腫瘤的預(yù)后有重要的指導(dǎo)價(jià)值。但該學(xué)者未提及對(duì)腫瘤預(yù)后有著重要影響的腫瘤壞死情況。本研究通過(guò)測(cè)量計(jì)算獲得實(shí)驗(yàn)組兔肝VX2移植瘤壞死的平均TNR值，并與灌注參數(shù)進(jìn)行相關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)TNR與ALP、HPI呈負(fù)相關(guān)，與BF、BV、PVP無(wú)相關(guān)性，因而提示腫瘤壞死與微血管密度有密切關(guān)系，進(jìn)而影響臨床預(yù)后。HUGHES等[12]及LUO等[13]指出腫瘤壞死是腫瘤代謝失平衡造成，并且與多種因素有關(guān)，但主要原因是由于供血、供氧不足。當(dāng)腫瘤血管不足可導(dǎo)致腫瘤代謝失平衡，相較于邊緣區(qū)的腫瘤細(xì)胞，中央?yún)^(qū)域比邊緣區(qū)的腫瘤細(xì)胞承受更為嚴(yán)重的代謝壓力，導(dǎo)致腫瘤中央?yún)^(qū)域出現(xiàn)壞死。而腫瘤邊緣區(qū)的腫瘤細(xì)胞代謝壓力較小，這就非常有益于腫瘤血管的生成和血管生成所需的誘導(dǎo)因子的趨化，另外還可以通過(guò)血管共擇、血供重塑等途徑得到供血，因而不難理解，與腫瘤中央?yún)^(qū)域相比，腫瘤邊緣區(qū)血管較為豐富[14]。本研究實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物種瘤方式、種瘤標(biāo)準(zhǔn)、從種瘤到檢查的天數(shù)均基本一致，但最終觀察到各個(gè)體的TV及腫瘤壞死范圍均不一致，這從側(cè)面揭示了腫瘤與個(gè)體宿主之間相互作用的不一致性。隨著反映腫瘤動(dòng)脈灌注的ALP、HPI越低，TNR就會(huì)相應(yīng)地越高，反之亦然，但反映門(mén)靜脈灌注的PVP則與TNR無(wú)明顯關(guān)系，說(shuō)明腫瘤壞死與否可能主要是由腫瘤的動(dòng)脈灌注多少來(lái)決定的，而可能與門(mén)靜脈灌注量無(wú)明顯關(guān)系。IPPOLITO等[15]在研究中揭示高動(dòng)脈灌注的腫瘤對(duì)抗血管治療有較好的反應(yīng)，因此可作為預(yù)后因素，而本研究中TNR與代表腫瘤動(dòng)脈灌注的ALP、HPI負(fù)相關(guān)，提示腫瘤壞死程度越高，預(yù)后可能會(huì)越差。

本研究通過(guò)分析兔肝VX2移植瘤TNR與TV之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)兩者之間無(wú)相關(guān)性，與其他研究的結(jié)論一致。如LI等[16]通過(guò)對(duì)兔VX2移植瘤行動(dòng)態(tài)MRI增強(qiáng)顯示，在種瘤后第1周開(kāi)始出現(xiàn)腫瘤壞死，并且壞死程度隨著TV增大而加大，但第2周后，兩者的這種線性變化關(guān)系就消失了，由此推斷出腫瘤的壞死程度與腫瘤快速增長(zhǎng)而腫瘤血管形成不足導(dǎo)致血供不足有關(guān)。眾所周知，腫瘤血管形成是腫瘤發(fā)展的標(biāo)志，SZASZ等[17]指出腫瘤血管形成不足是引起腫瘤壞死的主因，而腫瘤血管形成與多種因素有關(guān)，如缺氧、壓力、毒素、溫度、多種促血管生成因子、抑血管生成因子、pH值降低、腫瘤代謝物、腫瘤的淋巴引流等，這些因素相互作用、相互影響，故所導(dǎo)致的腫瘤壞死情況也錯(cuò)綜復(fù)雜，因而TNR與TV之間不一定一直會(huì)呈明顯的相關(guān)性。

本研究的不足之處在于，研究樣本量及病理學(xué)指標(biāo)相對(duì)較少，且未對(duì)種瘤后的全過(guò)程進(jìn)行動(dòng)態(tài)的檢測(cè)，如今后在研究中加大樣本量、檢測(cè)指標(biāo)并動(dòng)態(tài)檢查，可能更能進(jìn)一步證實(shí)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果或發(fā)現(xiàn)新的、尚未揭示的與血管生成、腫瘤壞死相關(guān)的影像學(xué)檢查指標(biāo)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明腫瘤壞死程度可能與全肝VPCT反映的腫瘤動(dòng)脈灌注不足有關(guān)，與TV無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。人HCC腫瘤壞死的全肝VPCT對(duì)臨床預(yù)后有指導(dǎo)價(jià)值，并可為靶向血管生成藥物治療的療效評(píng)估、介入栓塞治療的療效評(píng)估等治療反應(yīng)的影像學(xué)檢測(cè)提供思路。