劉智俊，羅光華，周宏，蔣孝先，廖華之，伍海彪

（南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院 放射科，湖南 衡陽 421001）

實體腫瘤壞死程度反映了腫瘤內(nèi)的缺氧水平，而缺氧與實體腫瘤放化療敏感性及臨床預(yù)后密切相關(guān)[1]。如何在術(shù)前精準評價腫瘤壞死成為腫瘤研究一大挑戰(zhàn)之一。病理學(xué)檢查作為判斷腫瘤壞死程度的金標準，自身有較多不足，導(dǎo)致臨床應(yīng)用受限。而CT灌注成像特別是全臟器容積灌注成像具有相對無創(chuàng)性、覆蓋廣、可重復(fù)性高、可實時動態(tài)進行，以及與病理有較好相關(guān)性等多種優(yōu)勢，逐步成為研究活體肝腫瘤的血流灌注狀態(tài)的首選影像學(xué)評價方法。本研究通過復(fù)制兔肝VX2移植瘤動物模型并采用全肝容積灌注CT成像（volume perfusion CT,VPCT），探討腫瘤的有效血流灌注、腫瘤體積（tumor volume,TV）與腫瘤壞死率（tumor necrosis rate,TNR）的關(guān)系，為研究人肝細胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）腫瘤壞死程度的影像學(xué)檢測提供新思路。

1 材料與方法

1.1 一般資料

55只不限雌雄的成年新西蘭大白兔，4～5個月齡，體重2.2～2.8 kg，購自中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院動物實驗中心[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2020-0002，實驗動物使用許可證號：SYXK（湘）2020-0002]。采用隨機抽樣法選出5只進行開腹手術(shù)但不種瘤大白兔作為對照組（手術(shù)方法與實驗組相同）。其余大白兔則按同一標準、同一開腹直接種瘤法[2]（嚴格無菌手術(shù)開腹，將小瘤塊直接種植于肝左葉深部并覆蓋，關(guān)腹）復(fù)制兔肝VX2移植瘤動物模型作為實驗組。實驗組排除經(jīng)解剖和病理證實為未成功成瘤的、腫瘤種植于肝表面的、后處理圖像效果不佳的大白兔，最終共38只大白兔納入研究。

1.2 方法

1.2.1 VPCT檢查 麻醉藥物采用3%戊巴比妥鈉非揮發(fā)性麻醉劑，按1 mL/kg體重經(jīng)耳緣靜脈注射。動物模型復(fù)制成功后的第14天采用雙源64層螺旋CT機（德國西門子公司）對兩組行全肝VPCT，具體掃描方法及掃描參數(shù)如下：掃描完定位圖像后，設(shè)計好掃描野以保證包含了全肝。采用CT機無縫連續(xù)動態(tài)往復(fù)掃描模式來實現(xiàn)容積灌注成像檢查，采用雙筒高壓注射器（美國理博有限公司）注射非離子型對比劑碘佛醇（33.9 g/50 mL）（江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司），按1 mL/kg、1 mL/s經(jīng)留置針注入耳緣靜脈，隨即按同流率經(jīng)靜脈團注5 mL生理鹽水沖洗。靜脈團注完后延遲6 s，按80 kVp管電壓、50 mAs管電流、1.0 mm螺距、球管每0.33 s旋轉(zhuǎn)1周、48 mm探測器寬度的掃描參數(shù)連續(xù)掃描61 s，以1.5 mm層厚、1.5 mm層間距、512×512重建矩陣、B30f卷積核值進行圖像重建，最終獲得30組容積數(shù)據(jù)（共包含930幅圖像）并全部傳輸至配套的圖像后處理工作站（Syngo MuliModality Workplace）。

1.2.2 TV、TNR及灌注后處理 TV、TNR及灌注后處理由2名高年資腹部影像診斷副主任醫(yī)師親自指導(dǎo)。同一只大白兔的TV重復(fù)處理、測量3次后取平均值，TNR及灌注參數(shù)亦按同法求平均值，如有不同意見則加入第三位高年資腹部影像診斷副主任醫(yī)師討論確定。選用在全肝VPCT動脈期腫瘤實質(zhì)達強化峰值且對比最佳的腫瘤最大橫截面圖像作為目標圖像（增強動脈期第6組腫瘤圖像多呈顯著環(huán)形強化且對比度最佳，符合目標圖像特點，故第6組最大橫截面圖像作為首選）。

TV計算公式為：V=1/2ab2。a為腫瘤最大徑，兩極定義為在目標圖像上腫瘤最大橫截面上強化的最外緣；b為腫瘤最小徑，兩極定義為垂直于a的最外緣[3-4]。

TNR定義為在目標圖像上無強化的壞死區(qū)橫截面積與腫瘤最大橫截面積的比值。在工作站目標圖像上手繪出中央不強化的壞死區(qū)域獲得腫瘤壞死區(qū)橫截面積，按同法在同一目標圖像上手繪出腫瘤最大橫截面上強化的最外緣得到腫瘤最大橫截面積。

選擇VPCT Body灌注軟件中的肝臟灌注應(yīng)用模塊進行灌注后處理，獲得肝灌注血流量（blood flow,BF）、灌注血容量（blood volume,BV）、動脈灌注量（arterial liver perfusion,ALP）、門靜脈灌注量（portal vein perfusion,PVP）、動脈灌注指數(shù)（hepatic perfusion index,HPI）等全肝VPCT參數(shù)及彩圖。

1.2.3 病理學(xué)檢查 實驗完后立即將實驗組安樂死，取出腫瘤標本進行HE染色。染色后，置于低倍鏡下（×10）觀察切片整體壞死情況，再轉(zhuǎn)至高倍鏡（×40）下觀察腫瘤實質(zhì)與壞死的交界區(qū)情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示。比較用單因素方差分析，兩兩比較用Dunnett-t檢驗；相關(guān)性分析用Pearson法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗組癌組織、癌旁組織及對照組肝組織的全肝VPCT參數(shù)比較

實驗組癌組織、癌旁組織及對照組肝組織BF、BV、ALP、PVP、HPI比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。實驗組癌組織與對照組肝組織BF、BV、ALP、PVP、HPI比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），實驗組癌旁組織與對照組肝組織BF、BV、ALP、PVP、HPI比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 實驗組癌組織、癌旁組織及對照組肝組織的全肝VPCT參數(shù)比較 （±s）

表1 實驗組癌組織、癌旁組織及對照組肝組織的全肝VPCT參數(shù)比較 （±s）

組別實驗組癌組織實驗組癌旁組織對照組肝組織F 值P 值n 38 38 5 BF/[mL/（100 mL·min）]248.15±74.17 200.89±71.44 204.54±2.74 4.403 0.015 BV/[mL/（100 mL·min）]23.72±7.17 20.02±7.08 19.62±2.03 2.943 0.049 ALP/[mL/（100 mL·min）]65.07±9.54 42.19±7.84 40.43±1.45 74.335 0.000 PVP/[mL/（100 mL·min）]14.49±2.40 121.84±9.38 119.39±5.39 2 515.780 0.000 HPI/%82.05±3.22 25.57±2.96 25.30±0.37 3 543.545 0.000

2.2 相關(guān)性分析

實驗組平均TNR為（22.56±7.10）%。Pearson相關(guān)性分析顯示，TNR與ALP、HPI呈負相關(guān)（r=-0.410和-0.356，P=0.010和0.028），TNR與BF、BV、PVP無相關(guān)性（r=-0.016、-0.155和0.256，P=0.924、0.353和0.121）。見圖1、2。

圖1 TNR與ALP相關(guān)性散點圖

圖2 TNR與HPI相關(guān)性散點圖

實驗組肝VX2移植瘤TV平均為（1.87±1.61）cm3。Pearson相關(guān)性分析顯示，TV與BF、BV、PVP、ALP、HPI無相關(guān)性（r=0.062、0.292、0.140、0.142和0.014，P=0.709、0.076、0.401、0.396和0.933）。

Pearson相關(guān)性分析顯示，肝VX2移植瘤TNR與TV無相關(guān)性（r=-0.098，P=0.559）。

2.3 CT與病理學(xué)檢查結(jié)果

在圖像工作站上發(fā)現(xiàn)，實驗組腫瘤位于腹中線肝內(nèi)種瘤位置，各兔腫瘤直徑不一，但可見數(shù)量均為1個，絕大部分呈類圓形或類橢圓形。與癌旁組織比較，平掃上腫瘤邊緣區(qū)呈等、稍低混雜密度而中心呈不均勻低密度，邊界不清，動態(tài)增強上腫瘤邊緣區(qū)動脈期快速顯著環(huán)形強化且接近腹主動脈強化程度，接著強化快速減弱，在肝動脈灌注彩圖上呈現(xiàn)邊緣環(huán)形高灌注，而中央一直無明顯強化或低灌注狀態(tài)。

將腫瘤標本置于低倍鏡及高倍鏡下觀察，橫截面移植瘤邊緣區(qū)主要為環(huán)形異型性腫瘤細胞并夾雜較多粗細不均的腫瘤血管，中央主要為凝固性壞死。見圖3～5。

圖3 兔肝VX2移植瘤ALP、BF、BV、PVP、HPI的CT圖

圖4 全肝VPCT動脈期腫瘤實質(zhì)達強化峰值且對比最佳的腫瘤最大橫截面CT圖

圖5 實驗組肝VX2移植瘤病理切片 （HE染色×40）

3 討論

VX2腫瘤是應(yīng)用非常廣泛的惡性腫瘤動物模型，涉及很多研究領(lǐng)域且根據(jù)成瘤的部位可分為如肝移植癌、骨移植癌、乳腺移植癌、肺移植癌、腦移植癌、腎移植癌、肌肉移植癌等[2，5-8]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實驗組兔肝VX2移植瘤邊緣區(qū)癌組織的BF、BV、ALP、HPI高于癌旁組織及對照組肝組織，而PVP則低于癌旁組織及對照組肝組織。TONG等[2]通過對兔肝VX2移植瘤改良模型行對比增強CT檢查，YI等[9]通過超聲引導(dǎo)穿刺建立兔肝VX2移植瘤動物模型并行對比增強超聲，均實驗得出兔肝VX2移植瘤的肝血流灌注發(fā)生了顯著變化并于增強后腫瘤邊緣區(qū)實質(zhì)呈“快進快出”強化模式，且血供主要來自于動脈。梁長華等[10]通過對HCC行CT全腫瘤灌注顯示HCC的血供是由門靜脈供血為主漸漸過渡到動脈供血為主。這些結(jié)果表明，兔肝VX2移植瘤與人HCC之間的血供特征有很好的相似性，因而非常適合用于研究人HCC的動物肝腫瘤模型。

劉曉等[11]研究發(fā)現(xiàn)全肝VPCT可替代微血管密度定量，評估兔VX2肝腫瘤經(jīng)導(dǎo)管動脈化療栓塞術(shù)治療前后的肝血流動力學(xué)變化對腫瘤的預(yù)后有重要的指導(dǎo)價值。但該學(xué)者未提及對腫瘤預(yù)后有著重要影響的腫瘤壞死情況。本研究通過測量計算獲得實驗組兔肝VX2移植瘤壞死的平均TNR值，并與灌注參數(shù)進行相關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)TNR與ALP、HPI呈負相關(guān)，與BF、BV、PVP無相關(guān)性，因而提示腫瘤壞死與微血管密度有密切關(guān)系，進而影響臨床預(yù)后。HUGHES等[12]及LUO等[13]指出腫瘤壞死是腫瘤代謝失平衡造成，并且與多種因素有關(guān)，但主要原因是由于供血、供氧不足。當腫瘤血管不足可導(dǎo)致腫瘤代謝失平衡，相較于邊緣區(qū)的腫瘤細胞，中央?yún)^(qū)域比邊緣區(qū)的腫瘤細胞承受更為嚴重的代謝壓力，導(dǎo)致腫瘤中央?yún)^(qū)域出現(xiàn)壞死。而腫瘤邊緣區(qū)的腫瘤細胞代謝壓力較小，這就非常有益于腫瘤血管的生成和血管生成所需的誘導(dǎo)因子的趨化，另外還可以通過血管共擇、血供重塑等途徑得到供血，因而不難理解，與腫瘤中央?yún)^(qū)域相比，腫瘤邊緣區(qū)血管較為豐富[14]。本研究實驗組動物種瘤方式、種瘤標準、從種瘤到檢查的天數(shù)均基本一致，但最終觀察到各個體的TV及腫瘤壞死范圍均不一致，這從側(cè)面揭示了腫瘤與個體宿主之間相互作用的不一致性。隨著反映腫瘤動脈灌注的ALP、HPI越低，TNR就會相應(yīng)地越高，反之亦然，但反映門靜脈灌注的PVP則與TNR無明顯關(guān)系，說明腫瘤壞死與否可能主要是由腫瘤的動脈灌注多少來決定的，而可能與門靜脈灌注量無明顯關(guān)系。IPPOLITO等[15]在研究中揭示高動脈灌注的腫瘤對抗血管治療有較好的反應(yīng)，因此可作為預(yù)后因素，而本研究中TNR與代表腫瘤動脈灌注的ALP、HPI負相關(guān)，提示腫瘤壞死程度越高，預(yù)后可能會越差。

本研究通過分析兔肝VX2移植瘤TNR與TV之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)兩者之間無相關(guān)性，與其他研究的結(jié)論一致。如LI等[16]通過對兔VX2移植瘤行動態(tài)MRI增強顯示，在種瘤后第1周開始出現(xiàn)腫瘤壞死，并且壞死程度隨著TV增大而加大，但第2周后，兩者的這種線性變化關(guān)系就消失了，由此推斷出腫瘤的壞死程度與腫瘤快速增長而腫瘤血管形成不足導(dǎo)致血供不足有關(guān)。眾所周知，腫瘤血管形成是腫瘤發(fā)展的標志，SZASZ等[17]指出腫瘤血管形成不足是引起腫瘤壞死的主因，而腫瘤血管形成與多種因素有關(guān)，如缺氧、壓力、毒素、溫度、多種促血管生成因子、抑血管生成因子、pH值降低、腫瘤代謝物、腫瘤的淋巴引流等，這些因素相互作用、相互影響，故所導(dǎo)致的腫瘤壞死情況也錯綜復(fù)雜，因而TNR與TV之間不一定一直會呈明顯的相關(guān)性。

本研究的不足之處在于，研究樣本量及病理學(xué)指標相對較少，且未對種瘤后的全過程進行動態(tài)的檢測，如今后在研究中加大樣本量、檢測指標并動態(tài)檢查，可能更能進一步證實本實驗結(jié)果或發(fā)現(xiàn)新的、尚未揭示的與血管生成、腫瘤壞死相關(guān)的影像學(xué)檢查指標。

綜上所述，本研究結(jié)果表明腫瘤壞死程度可能與全肝VPCT反映的腫瘤動脈灌注不足有關(guān)，與TV無明顯關(guān)聯(lián)。人HCC腫瘤壞死的全肝VPCT對臨床預(yù)后有指導(dǎo)價值，并可為靶向血管生成藥物治療的療效評估、介入栓塞治療的療效評估等治療反應(yīng)的影像學(xué)檢測提供思路。