姬文莉，王翠翠，林珍珍，張煥

（新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院 病理科，新疆 烏魯木齊 830011）

膀胱癌是一種常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，可引起膀胱纖維化，降低膀胱容量，出現(xiàn)尿液反流，造成腎積水和腎臟炎癥，使患者出現(xiàn)尿急、尿痛等排尿系統(tǒng)損害，甚至危及患者生命[1]。膀胱癌惡性程度高、預后差且早期診斷率較低，故積極探索與疾病進展、癌細胞轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白，或許能夠為預后評估提供新的思路，并為臨床治療提供新的靶點。Beclin1蛋白是酵母自噬基因Atg6的同源基因，作為與自噬相關(guān)的腫瘤抑制基因，其具有抑制腫瘤的發(fā)生與進展、誘導凋亡、自噬等功能，與多種惡性腫瘤的抗腫瘤治療相關(guān)[2-3]。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ（LC3Ⅱ）蛋白也屬于自噬相關(guān)基因之一，參與自噬體形成，在自噬的溶酶體降解過程中發(fā)揮抑癌作用[4-5]。本研究觀察膀胱癌組織中Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達狀況，并分析兩者與預后的相關(guān)性，旨在為膀胱癌的治療及預后評估提供新的途徑。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年1月—2021年8月新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院病理資料完整的110例膀胱癌患者。其中，男性79例，女性31例；年齡54～78歲，平均（65.49±6.13）歲；體質(zhì)量指數(shù)20～29 kg/m2，平均（25.82±2.16）kg/m2；白細胞計數(shù)4.2～11.5×109/L，平均（7.52±2.03）×109/L；血紅蛋白89～128 g/L，平均（116.42±7.18）g/L；合并糖尿病14例，高血壓42例。

1.2 納入與排除標準

納入標準：①符合《臨床腫瘤學》[6]中膀胱癌診斷標準；②經(jīng)病理組織學檢查確診；③預計生存期＞6個月；④接受根治性切除治療；⑤患者或家屬簽署知情同意書。排除標準：①入組前接受放射治療、化學治療或其他輔助治療；②長期服用免疫抑制劑；③伴有其他惡性腫瘤；④合并血液系統(tǒng)疾病或免疫系統(tǒng)功能障礙；⑤膀胱癌以外的因素導致死亡。

1.3 方法

1.3.1 膀胱癌組織Beclin1、LC3Ⅱ蛋白檢測 采集患者癌組織、癌旁組織樣本，生理鹽水沖洗，置于10%甲醛固定24 h，取出用酒精洗滌待測。采用分支DNA-液相芯片法檢測樣本中Beclin1、LC3Ⅱ蛋白，具體操作：在待測樣本中加入一定量裂解液，置于55～58 ℃環(huán)境中裂解120 min，移至孵育板上，加入緩沖液、探針-微球、延伸探針置于55 ℃環(huán)境中震蕩孵育過夜；第2天將孵育板靜置于磁力架上60 s，使磁性微球沉積至底部，去除上清液，加入洗滌液，震蕩洗滌60 s，再次置于磁力架上靜置60 s，去除上清液，反復3次；加入標記延伸探針、探針，50 ℃環(huán)境下震蕩反應60 min；再次加入洗滌液，震蕩洗滌60 s，磁力架上靜置60 s，去除上清液，洗滌2次；加入藻紅蛋白，50 ℃環(huán)境下震蕩反應30 min，磁力架上靜置60 s，去除上清液，洗滌2次；加入洗滌液震蕩5 min，采用Luminex閱讀儀讀取數(shù)據(jù)，獲得檢驗結(jié)果。結(jié)果判讀：Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達水平≥75%視為高表達，65%～＜ 75%視為中偏高表達，40%～＜ 65%視為中表達，25%～＜ 40%視為中偏低表達，＜ 25%視為低表達。將高表達、中偏高表達作為高表達，中表達、中偏低表達、低表達作為中低表達。

1.3.2 病理參數(shù) 詳細記錄膀胱癌患者病理參數(shù)，包括性別、年齡（＜ 60歲、≥ 60歲）、腫瘤直徑（＜ 3 cm、≥ 3 cm）、血管侵犯（是、否）、組織學分級（高級別、低級別）、臨床分期（Ta～T1、T2～T4）、浸潤性（是、否）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（是、否）。

1.3.3 預后評估 隨訪1年，將腫瘤病灶完全緩解或部分緩解且持續(xù)生存的患者視為預后良好；將腫瘤復發(fā)、腫瘤病灶穩(wěn)定、進展、出現(xiàn)新發(fā)病灶或病死的患者視為預后不良。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗；相關(guān)性分析用Phi法；影響因素的分析采用多因素逐步Logistic回歸模型。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌組織與癌旁組織Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達率比較

膀胱癌組織與癌旁組織Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達率比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），膀胱癌組織Beclin1、LC3Ⅱ蛋白高表達率較癌旁組織低，Beclin1、LC3Ⅱ蛋白中低表達率較癌旁組織高。見表1。

表1 膀胱癌組織與癌旁組織Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達比較 [n =110，例（%）]

2.2 不同因素膀胱癌患者Beclin1蛋白高表達率比較

有49例膀胱癌患者Beclin1蛋白高表達。不同組織學分級、臨床分期、預后和是否浸潤性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者Beclin1蛋白高表達率比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），高組織學分級、T2～T4分期、浸潤性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預后不良的膀胱癌患者低于低組織學分級、Ta～T1分期、非浸潤性、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預后良好的患者。不同性別、年齡、腫瘤直徑、血管侵犯的膀胱癌患者Beclin1蛋白表達率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 不同因素膀胱癌患者Beclin1蛋白高表達率比較 例（%）

2.3 不同因素膀胱癌患者LC3Ⅱ蛋白高表達率比較

36例膀胱癌患者LC3Ⅱ蛋白高表達。不同組織學分級、臨床分期、預后和是否浸潤性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者LC3Ⅱ蛋白高表達率比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），高組織學分級、T2～T4分期、浸潤性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預后不良的膀胱癌患者LC3Ⅱ蛋白高表達率低于低組織學分級、Ta～T1分期、非浸潤性、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預后良好的患者。不同性別、年齡、腫瘤直徑、血管侵犯的膀胱癌患者LC3Ⅱ蛋白表達率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 不同因素膀胱癌患者LC3Ⅱ蛋白高表達率比較 例（%）

2.4 膀胱癌組織中Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達與預后的相關(guān)性

經(jīng)Phi系數(shù)相關(guān)性分析，Beclin1、LC3Ⅱ蛋白與預后不良均呈負相關(guān)（Phi= -0.277和-0.222，P=0.004和0.020）。

2.5 影響膀胱癌患者預后的多因素逐步Logistic回歸分析

將患者預后作為因變量（預后良好= 0，預后不良= 1），Beclin1蛋白表達（中低表達= 0，高表達= 1）和LC3Ⅱ蛋白表達（中低表達= 0，高表達= 1）為自變量，采用向前逐步法，進行多因素逐步Logistic回歸分析。結(jié)果顯示：Beclin1高表達[=3.892（95% CI：1.504，10.072）]、LC3Ⅱ蛋白中低表達[=3.358（95% CI：1.165，9.677）]是預后不良的危險因素（P＜0.05）。見表4。

表4 影響膀胱癌患者預后的多因素逐步Logistic回歸分析參數(shù)

3 討論

自噬主要指通過溶酶體途徑降解一些細胞內(nèi)源性底物和細胞內(nèi)大分子物質(zhì)的生理過程，是機體對外界不良刺激的主動防衛(wèi)策略，也是一種細胞程序性死亡形式，是真核生物普遍存在的生理過程之一。近年來研究發(fā)現(xiàn)，自噬與多種惡性腫瘤密切相關(guān)，參與腫瘤的發(fā)生、細胞死亡、進展等病理過程[7]。在前列腺癌、肝癌、甲狀腺癌、卵巢癌等多種癌癥中均發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)蛋白缺失或活性下調(diào)，并對患者預后及生存產(chǎn)生重要影響[8-9]。但目前，有關(guān)自噬在膀胱癌中的潛在分子機制尚無明確定論。

Beclin1基因位于染色體17q21，是具有450個氨基酸序列、12個外顯因子的蛋白質(zhì)，由3個結(jié)構(gòu)域組成，N端是與抗凋亡家族成員BCL-w、BCL-xl、BCL-2等結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，能夠破壞腫瘤的抗凋亡能力；中間為螺旋結(jié)構(gòu)域，可結(jié)合紫外線輻射抵抗的相關(guān)蛋白，形成自噬膜并對腫瘤進展產(chǎn)生抑制作用；C端與細胞膜相連，為進化保守結(jié)構(gòu)域，可與Vps34相結(jié)合，啟動自噬達到抑制腫瘤的作用[10-11]。ZHANG等[12]研究指出，Beclin1過表達能夠抑制食管癌細胞增殖并誘導自噬。ZHANG等[13]研究表明，靶向ARBeclin1復合物能夠有效抑制去勢抵抗性前列腺癌的生長。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膀胱癌組織中Beclin1、LC3Ⅱ蛋白高表達率低于癌旁組織，表明Beclin1蛋白表達減少與腫瘤生長相對應；進一步分析其與膀胱癌患者預后的關(guān)系，結(jié)果顯示，Beclin1與患者預后不良呈負相關(guān)，Beclin1蛋白中低表達是預后不良的危險因素。細胞自噬凋亡能夠消除衰老細胞，維持生物體動態(tài)平衡。自噬基因Beclin1結(jié)合其配體能夠調(diào)節(jié)自噬，誘導癌細胞自噬性凋亡；而自噬基因Beclin1表達缺失時，腫瘤則可能逃避自噬性死亡。Beclin1作為促凋亡分子能夠抑制BCL-w、BCLxl、BCL-2等抗凋亡因子活性，并增強半胱氨酸蛋白酶活性，增強順鉑、白樺脂酸、甲氨蝶呤等抗癌藥物功效，誘導腫瘤細胞凋亡[14]。有研究認為，Beclin1能夠上調(diào)去泛素化酶人泛素特異性肽酶13（USP13）、USP10、USP2活性，增強抑癌基因活性，誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤進展[15]。而Beclin1表達缺失或降低則可能促進腫瘤細胞周期相關(guān)蛋白表達、促進腫瘤血管生成，進而促進腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移和新血管成熟，導致腫瘤進展，對患者預后產(chǎn)生不利影響。

LC3與酵母自噬基因Atg8約有30%的氨基酸同源，LC3在細胞內(nèi)部主要定位于自噬泡表面和前自噬泡。LC3可分為Ⅰ型和Ⅱ型，未出現(xiàn)自噬時，細胞胞質(zhì)內(nèi)常規(guī)表達Ⅰ型LC3，出現(xiàn)自噬時，LC3Ⅰ可與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺相結(jié)合，形成LC3Ⅱ，并始終結(jié)合在自噬體膜上，是標志性自噬基因[16]。HUANG等[17]研究指出，LC3乙酰haul水平降低可促進子宮內(nèi)膜癌細胞增殖。吳筱蔓等[18]觀察喉癌組織及正常組織中LC3表達發(fā)現(xiàn)，與正常組織比較，喉癌組織中LC3陰性表達率更高，LC3表達陰性可能是影響喉癌患者預后生存的獨立危險因素。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膀胱癌組織中LC3Ⅱ蛋白高表達率低于癌旁組織，與患者預后密切相關(guān)，LC3Ⅱ蛋白中低表達是預后不良的危險因素。研究指出，自噬的自我降解過程廣泛存在于真核細胞中，其在細胞廢物清除、生長發(fā)育、重建等過程中發(fā)揮重要作用[19]。而作為自噬溶酶體最基本的組成成分，LC3表達與自噬活性相關(guān)，當機體發(fā)生自噬時，細胞內(nèi)LC3含量明顯增加。LC3表達降低時，細胞自噬能力也隨之降低，惡性細胞增殖速度加快，機體不能及時、有效地清除損傷、變異的細胞，則可能促進腫瘤的發(fā)生[20]。此外，LC3表達下調(diào)或缺失還可能對多種癌基因產(chǎn)生激活作用，誘導癌細胞生長，加重病情進展，影響患者預后。

綜上所述，膀胱癌組織中Beclin1、LC3Ⅱ表達與預后密切相關(guān)，Beclin1、LC3Ⅱ蛋白中低表達是預后不良的危險因素，臨床應密切關(guān)注膀胱癌患者癌組織中兩種蛋白表達情況，并采取對應干預措施，以改善患者預后。