文/朱凱莉 劉虎 卞從明 董世建 程婷 李增禮[安徽安科生物工程（集團）股份有限公司]

多肽藥物是指通過生物合成法（天然原料提取法、酶解法、發(fā)酵法、基因重組法）或化學合成法（液相合成法和固相合成法）獲得的具有特定治療作用的多肽，具有生物活性高、特異性強、免疫原性低及穩(wěn)定性強等優(yōu)點，廣泛應用于抗病毒、抗腫瘤、抗菌、疫苗、內分泌、心血管及糖尿病等醫(yī)療領域。目前，合成多肽藥物應用最普遍的是固相合成法，以保護氨基酸（Boc-氨基酸或Fmoc- 氨基酸）作為起始物料，定向獲得目標肽，由于Fmoc- 氨基酸具有在堿性條件下進行脫保護的優(yōu)勢，因此是目前固相合成法中最為常用的起始物料。關于起始物料中雜質的控制，食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）、歐洲藥品管理局（EMA）以及ICHQ11、《合成多肽藥物藥學研究技術指導原則》均對原料藥（API）起始物料質量控制提出評估意見或要求。芴甲氧羰基氨基酸作為固相合成多肽中的起始物料，引入的雜質及所產(chǎn)生的相關雜質在純化過程中可能與目標肽共同洗脫，因此雜質很難減少或消除，為了盡量減少對終產(chǎn)物的潛在影響，需對此類雜質建立嚴格的質控要求。

檢測固相合成多肽中起始物料的方法有很多，其中高效液相色譜法（HPLC）具有靈敏度高、分析速度快、重復性好及操作簡單等諸多優(yōu)點。有關物質檢測雜質含量低、種類多，故更適合采用HPLC 法進行檢測。本文以芴甲氧羰基-L- 亮氨酸（Fmoc-L-Leu-OH）作為研究對象，建立了HPLC 檢測Fmoc-L-Leu-OH有關物質的方法，并進行了系統(tǒng)的方法學驗證。

一、材料

1.主要材料和試劑

Fmoc-L-Leu-OH 對照品，雜質對照品：N- 羥基琥珀酰亞胺（HOSu）、9- 芴甲氧羰基- 琥珀酰亞胺碳酸酯（Fmoc-OSu）、9- 芴甲醇（Fmoc-OH）、N- 芴甲氧羰基-β- 丙氨酸（Fmoc-β-Ala-OH）、N- 芴甲氧羰基-β- 丙氨酸- 亮氨酸（Fmoc-β-Ala-Leu-OH）、N- 芴甲氧羰基- 亮氨酰- 亮氨酸（Fmoc-Leu-Leu-OH），乙腈，磷酸，注射用水。

2.主要儀器設備

賽默飛U3000 高效液相色譜儀，紫外檢測器，電子天平。

二、方法與結果

1.試液配制

系統(tǒng)適用性溶液：分別稱取Fmoc-L-Leu-OH 對照品與雜質對照品HOSu、Fmoc-OSu、Fmoc-OH、Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-β-Ala-Leu-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH 適量，精密稱定，加乙腈制成每1 mL 含F(xiàn)moc-Leu-OH 1.0 mg 與雜質 HOSu、Fmoc-OSu、Fmoc-OH、Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-β-Ala-Leu-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH 各約3.0 微克的混合溶液作為系統(tǒng)適用性溶液。

定位溶液：精密稱取各已知雜質（HOSu、Fmoc-OSu、Fmoc-OH、Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-β-Ala-Leu-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH）適量，加乙腈溶解并稀釋分別制成濃度約1.0 毫克/毫升的雜質定位溶液；精密稱取Fmoc-L-Leu-OH 適量，加乙腈溶解并稀釋配制成濃度約為1.0 毫克/毫升的樣品溶液。

供試品溶液：取本品適量，精密稱定，加乙腈溶解并稀釋制成濃度約為1.0 毫克/毫升的溶液，作為供試品溶液。

對照溶液：精密量取供試品溶液適量，加乙腈定量稀釋制成每1 毫升中約含F(xiàn)moc-Leu-OH 1.0 微克的溶液，作為對照溶液。

以乙腈作為空白溶劑和稀釋液。

2.色譜條件

采用Waters XSelect CSHTM C18（4.6×250 mm，5微米）色譜柱，以0.15%磷酸∶乙腈（60∶40）為流動相進行梯度洗脫，洗脫程序如表1 所示，流速為1.0 毫升/分，進樣量為5 微升，柱溫為35 ℃，檢測波長為220納米。

表1 流動相梯度洗脫程序

3.計算方式

本次方法學驗證各雜質采用加校正因子的自身對照法計算，計算公式如下：

已知雜質＝AS×f/AR×0.1%

單一未知雜質＝Ai/AR×0.1%

總雜質＝∑所有雜質

式中：AS為供試品溶液中的已知雜質峰峰面積；Ai為供試品溶液中的未知雜質峰峰面積；AR為對照溶液的峰面積；f為已知雜質的相對校正因子。

4.限度

HOSu、Fmoc-OSu、Fmoc-OH、Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-β-Ala-Leu-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH 均不得大于對照溶液主峰面積（0.1%），其他單個雜質不得大于對照溶液主峰面積的2 倍（0.2%），總雜質不得大于對照溶液主峰面積的5 倍（0.5%）。

5.檢測波長的確定

取系統(tǒng)適用性溶液的Fmoc-Leu-OH 和已知雜質（HOSu、Fmoc-OSu、Fmoc-OH、Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-β-Ala-Leu-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH）在190～400 納米紫外掃描光譜圖，結果發(fā)現(xiàn)HOSu 在波長230納米以上幾乎無紫外吸收，流動相中乙腈的截止波長是190 納米，結合文獻研究結果，故將Fmoc-L-Leu-OH 有關物質檢測波長定為220 納米。

6.方法學驗證

（1）專屬性：取各定位溶液分別進樣檢測，結果已知雜 質 HOSu、Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-OH、Fmoc-β-Ala-Leu-OH、Fmoc-OSu、Fmoc-Leu-Leu-OH 與Fmoc-L-Leu-OH 的保留時間分別為2.647、8.593、9.163、10.277、11.580、14.022、13.155 分鐘。取空白溶劑、適用性溶液進樣檢測，色譜圖如圖1 所示。結果空白溶劑對各雜質檢測無干擾，主峰與相鄰雜質之間的分離度分別為11.59、6.07，雜質峰之間的分離度分別為62.26、4.60、8.78、10.11，分離度遠大于2.0，表明方法專屬性良好。

圖1 系統(tǒng)適用性溶液色譜圖

（2）系統(tǒng)重復性：精密稱取Fmoc-L-Leu-OH 對照品適量，加乙腈溶解并定量稀釋制成每毫升中約含F(xiàn)moc-L-Leu-OH 1.0 微克的對照溶液（0.1%），按“2.2色譜條件”連續(xù)進樣檢測6 次，結果顯示峰面積的RSD 為0.69%，說明系統(tǒng)穩(wěn)定，系統(tǒng)重復性較好。

（3）檢測限及定量限：取Fmoc-L-Leu-OH 對照品及各雜質對照品，分別用稀釋液逐級稀釋至適宜濃度按前文所述“色譜條件”進樣檢測，分別以信噪比3∶1和10∶1 時注入儀器的量作為檢測限和定量限。結果發(fā)現(xiàn)，各雜質的檢測限均不高于主成分質量的0.0040%，定量限均不高于主成分質量的0.0100%，表明色譜條件靈敏度高，適合進行雜質控制。

（4）定量限重復性：取“（3）檢測限及定量限”中規(guī)定的Fmoc-L-Leu-OH 對照品稀釋至定量限的溶液按前文所述“色譜條件”連續(xù)進樣6 次，結果主峰保留時間RSD 為0.03%，峰面積的RSD 為5.63%，表明定量限重復性良好。

（5）線性和范圍：分別精密量取各定位溶液適量，置于同一個10 mL 量瓶中，定容，搖勻，即得混合對照品儲備液。分別精密量取混合對照品貯備液適量，稀釋制成每毫升中含F(xiàn)moc-L-Leu-OH 和各已知雜質均為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 微克的溶液，取Fmoc-LLeu-OH 和各已知雜質的定量限溶液和上述系列濃度溶液進樣檢測，以濃度（微克/毫升）為x軸，峰面積A為y軸，進行線性回歸，結果發(fā)現(xiàn)Fmoc-L-Leu-OH 和各已知雜質在定量限至3 微克/毫升范圍內呈現(xiàn)良好的線性關系。根據(jù)標準曲線斜率計算校正因子（校正因子＝Fmoc-L-Leu-OH 的標準曲線斜率/雜質的標準曲線斜率），HOSu、Fmoc-OSu、Fmoc-OH、Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-β-Ala-Leu-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH的雜質校正因子在0.2～5.0，因此可采用加校正因子的主成分自身對照法計算各雜質的含量。

（6）準確度：已知供試品溶液中Fmoc-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH 含量分別約為0.03%、0.06%。取供試品溶液適量，分別加入各已知雜質對照品，并用乙腈稀釋至刻度，使各雜質的含量為質控限度的80%、100%、120%，每個濃度各配制3 份，并分別配制自身對照溶液（0.1%），按前文所述“色譜條件”進樣檢測。計算平均回收率和RSD，結果發(fā)現(xiàn)各雜質均能被準確測出。

（7）精密度：

①重復性：精密稱取待測樣品適量，平行配制6份供試品溶液按前文所述“色譜條件”進樣檢測，結果顯示6 份供試品溶液均僅檢測出Fmoc-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH 兩個雜質，兩個雜質的RSD 分別為3.22%、3.58%，表明本方法重復性較好。

②中間精密度：在不同時間，由不同操作人員平行配制6 份供試品溶液，采用不同儀器考察樣品的有關物質和雜質個數(shù)，與重復性試驗的6 份實驗結果比較，結果顯示6 份供試品溶液檢測出Fmoc-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH 兩個雜質，兩個雜質的RSD 分別為3.35%、2.48%，兩個操作人員共12 份供試品溶液Fmoc-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH 兩個雜質的RSD 分別為3.81%、3.00%，表明本方法中間精密度良好。

（8）溶液穩(wěn)定性：取供試品溶液于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12 小時，按色譜條件分別進樣檢測，按面積歸一化法計算各雜質的含量，結果顯示供試品溶液在室溫放置12 小時后，已知雜質Fmoc-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH 無增長，其他已知雜質、其他單雜均未檢出，溶液穩(wěn)定，溶劑峰無干擾。

（9）耐用性：在不同流速（0.9、1.0、1.1 毫升/分）、柱溫（32、35、38℃）及色譜柱（Waters XSelect CSHTM C18 4.6×250 毫米，5 微米柱、島津GL WondaSil C18，4.6×250 毫米，5 微米）條件下，系統(tǒng)適用性溶液各峰的相對遷移時間、理論塔板數(shù)均無明顯變化，各峰分離度均大于2，能滿足雜質的分離要求，且供試品溶液有關物質檢測結果基本一致。

三、結論與展望

本文對高效液相色譜法測定Fmoc-L-Leu-OH 中的有關物質進行系統(tǒng)的方法學驗證，驗證結果表明：該方法空白溶劑無干擾，F(xiàn)moc-L-Leu-OH 中的6 種已知雜質能達到有效分離；6 種雜質的檢測限為主成分質量的0.0006%～0.0040%，定量限為主成分質量的0.0020%～0.0100%，可有效檢測出各雜質；各雜質在定量限至3 微克/毫升范圍內線性關系良好，線性相關系數(shù)r均大于0.999，平均回收率在91.6%～103.6%（n＝9），可準確檢測各雜質；且精密度與系統(tǒng)重復性良好；該方法對流速、柱溫及色譜柱耐受性良好，可用于Fmoc-L-Leu-OH 中有關物質的檢測和控制。

由于多肽原料藥起始物料的雜質水平直接關系到目標藥物的安全性和有效性，在其分析方法開發(fā)過程中，應充分考慮藥物特點、風險評估、靈敏度目標、可接受誤差及試驗可行性等，合理選擇分析方法和平臺，提高分析方法開發(fā)的效率，有效地對原料藥起始物料進行質量控制。