呂歡歡 郝浩浩 李 翔 周俊學(xué) 吳俊林 孫會忠

（1河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南洛陽 471003；2河南煙草公司駐馬店市公司，河南駐馬店 463000；3河南省煙草公司洛陽市公司，河南洛陽 471003）

獲得優(yōu)質(zhì)的促生菌是提高煙草品質(zhì)的切入點之一，目前已報道的植物生長促進(jìn)菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）主要包括假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、腸桿菌屬（Enterobacter）和伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）等[1-3]，在煙草促生方面發(fā)揮了重要作用。但單一促生菌作用機(jī)制單一[4]，受環(huán)境影響大[5]。因此，尋找多功能促生菌具有重要的理論和現(xiàn)實意義。皮特不動桿菌（Acinetobater pittii）為莫拉菌科（Bacillaceae）不動桿菌屬，是一類廣泛存在于水體和土壤的重要根際有益菌。皮特不動桿菌不僅能夠抑制煙草黑脛病[6]，還能高效解磷解鉀[7]，促進(jìn)植物的生長，具有巨大的生物應(yīng)用價值。

煙草（Nicotiana tabacum）屬茄科一年生或有限多年生草本植物[8]，是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物。隨著種植面積的擴(kuò)大和難以避免的多年連作，煙葉生產(chǎn)受煙草病害影響嚴(yán)重，造成的年平均產(chǎn)量損失達(dá)10%左右[9]。使用化學(xué)藥劑防治是我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中快速防治病害的有效手段，但長期使用化學(xué)藥劑易導(dǎo)致煙草農(nóng)藥殘留、病害產(chǎn)生抗藥性等問題，對煙草質(zhì)量產(chǎn)生了不良影響[10-12]。微生物防治具有安全綠色、環(huán)境友好等優(yōu)勢，受到國內(nèi)外各方廣泛關(guān)注[13]。煙草病害防治菌劑的開發(fā)研究資源豐富，但目前有關(guān)廣譜抑制真菌的不動桿菌的報道不多，且不動桿菌對煙草促生作用的研究較少。

為豐富促生煙草生長菌種資源，本研究從煙草根際土壤中分離可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌，篩選出對煙草生長具有促生作用的菌株，同時評估目的菌株的生物活性，明確目的菌株的分類信息，并通過盆栽試驗驗證目的菌株的促生效果，為煙草促生菌劑的開發(fā)提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 土樣和煙草品種 土壤樣品采自河南省駐馬店市確山縣植煙區(qū)團(tuán)棵期至成熟期健康煙株根際土壤，共10份。供試煙草品種為云煙87。

1.1.2 供試培養(yǎng)基和試劑 采用肉湯培養(yǎng)基（LB）和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）進(jìn)行細(xì)菌的分離與純化[14]；采用馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）進(jìn)行病原真菌的培養(yǎng)及平板對峙試驗[15]；采用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB）進(jìn)行細(xì)菌懸液的制備及菌種的活化[16]；采用蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基和無機(jī)磷培養(yǎng)基（PKO）進(jìn)行菌株的溶磷活性鑒別；采用鉀長石培養(yǎng)基進(jìn)行菌株的解鉀活性鑒別[17]；采用羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基（CMC-Na）進(jìn)行菌株的纖維素分解活性鑒別[18]；采用TaKaRa MiniBEST細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株DNA。

1.1.3 供試病原真菌 指示病原真菌包括小麥根腐病菌（Fusarium culmorum）、番茄枯萎病菌（F.oxysporum）、牡丹黑斑病菌（Alternaria suffruticosae）、小麥灰霉病菌（F.graminearum）、牡丹灰霉病菌（Botrytis paeoniae）、牡丹黃斑病菌（Phyllosticta commonsii），均保存于河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院微生物實驗室。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的分離純化 采用溫度篩選法和平板稀釋涂布法[19]從采集的土壤樣品中分離純化內(nèi)生細(xì)菌，將培養(yǎng)得到的表面褶皺程度不同、邊緣不同、大小不同、顏色不同的可培養(yǎng)植物內(nèi)生細(xì)菌依次編號，純化后放在終濃度15%甘油中于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌株抑菌譜的測定 采用平板對峙法，以6 種病原真菌為指示菌株，無菌條件下將待測菌株點接于病原菌相等距離十字交叉線的四端，28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，3 次重復(fù)，以僅接病原真菌作為空白對照。當(dāng)空白對照的病原菌長滿平板時，觀察并測量接種拮抗菌的培養(yǎng)皿中菌落直徑[20]，計算相對抑制率，計算方法如下：相對抑制率（%）=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-5）×100。

1.2.3 菌株促生活性測定 （1）溶磷、解鉀菌活性篩選：將菌株分別接種到有機(jī)磷培養(yǎng)基、PKO和鉀長石培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，測量透明圈直徑D、菌落直徑d，根據(jù)D/d大小初步篩選溶磷、解鉀菌[21-22]。

（2）產(chǎn)纖維素酶活性篩選：將菌株點接于CMCNa 培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d 后，0.1%剛果紅浸潤20 min，1 mol/L NaCl 沖洗，測定菌落直徑d和透明圈直徑D，并計算比值（D/d）[23]。

（3）IAA能力測定：于1 000 r/min下離心菌株菌懸液10 min，取上清液，上清液與比色液按照1∶1加入白色陶瓷板上，室溫避光放置30 min 后觀察混合液顯色變化，以40 μg/mL IAA 標(biāo)準(zhǔn)溶液為陽性對照，不接菌的LB 液體培養(yǎng)基為陰性對照，混合液為粉色或紅色表明具有產(chǎn)IAA 活性，混合液為透明無色則表明不具有產(chǎn)IAA活性[24]。

1.2.4 多相鑒定 （1）形態(tài)和生理生化鑒定：形態(tài)學(xué)觀察參照《不動桿菌屬》，觀察菌株的顏色、形體大小、表面黏稠度等特征并記錄，同時取少量菌體進(jìn)行革蘭氏染色，電子顯微鏡下鏡檢并拍照。根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》與《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》中介紹的不動桿菌屬生理生化試驗進(jìn)行，以此對篩選出來的拮抗菌株進(jìn)行初步鑒定[25]。

（2）分子生物學(xué)鑒定：使用TaKaRa MiniBEST DNA 提取試劑盒提取菌株的基因組，細(xì)菌通用引物27F（5′-AGTT-TGATCMTGTCCAG-3′）和1492R（5′-GGTT-ACCTTTACGCTT-3′）進(jìn)行擴(kuò)增。1.5%瓊脂糖凝膠電泳后純化PCR產(chǎn)物，并送公司測序[26]。采用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株的分類地位。

1.2.5 菌株對煙草的促生作用 采用盆栽試驗，設(shè)3 個處理，分別為：CK，空白對照處理；處理T1，每株均用等量的1×108CFU/mL 微生物菌株發(fā)酵液灌根；處理T2，枯草芽孢桿菌菌劑灌根。各處理除微生物菌劑不同以外，其余的栽培管理措施均相同。每個處理3次重復(fù)。在煙草生長前后每7 d處理1次，共處理3 次，最后一次處理42 d 后開始調(diào)查植株的株高、莖圍、節(jié)距、最大葉面積等生物量指標(biāo)，并觀測植株的光合速率等指標(biāo)，統(tǒng)計和評估不同處理對煙草植株生長的影響[27]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用SPSS 27.0進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離篩選結(jié)果

從10 份煙草根際土樣中共分離到35 株菌株，以6 株病原菌為指示菌進(jìn)行篩選，得到菌株YC-25。試驗結(jié)果表明，菌株YC-25 對番茄枯萎病菌抑制效果最好（圖1L），對小麥灰霉病菌和牡丹黃斑病菌抑制效果稍弱（圖1B、H），對小麥根腐病菌、牡丹灰霉病菌和黑斑病菌抑制效果最弱（圖1D、F、J），平均抑菌率達(dá)到48%（圖2）。光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，正常未受抑制菌絲密集交織，分枝豐富，菌絲完整、表面平滑（圖1M）；受抑制菌絲通常表現(xiàn)出局部膨大、集結(jié)，幼嫩菌絲數(shù)量減少，分枝稀疏或密集（圖1N、O、P）。

圖1 菌株YC-25對6種病菌的拮抗作用

2.2 菌株YC-25的促生功能活性

（1）溶磷、解鉀活性：菌株在無機(jī)磷培養(yǎng)基和鉀長石培養(yǎng)基上均出現(xiàn)明顯透明圈（圖3A、B），菌株YC-25的溶磷可溶性指數(shù)為1.33，解鉀指數(shù)為1.31。

圖3 菌株YC-25的促生功能活性鑒別

（2）分解纖維素活性：菌株YC-25可在CMC-Na培養(yǎng)基上產(chǎn)生透明圈（圖3C），D/d=1.9。

（3）產(chǎn)吲哚乙酸（IAA）特性：定性與定量結(jié)果分析，菌株YC-25具有分泌IAA的能力，顯色反應(yīng)為粉紅色，分泌量為39.05 μg/mL（圖4C）。

圖4 菌株的IAA顯色反應(yīng)

2.3 菌株YC-25形態(tài)特征

2.3.1 菌株的形態(tài)和生理生化特征 菌株YC-25在LB培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d后觀察，單菌落呈淡黃色，不透明，表面光滑濕潤，中間略微凸起菌落較為黏稠，邊緣不規(guī)則（圖5A）。革蘭氏試劑染色后鑒定為革蘭氏陰性菌株（圖5B），菌體呈短桿狀，直徑為0.3～0.5 μm，長1.3～2.2 μm，無芽孢，無莢膜，無鞭毛（圖5C）。

圖5 菌株YC-25的形態(tài)特征

生理生化結(jié)果顯示，不可水解蛋白酶和果膠酶，能水解尿素，氧化酶反應(yīng)、硝酸鹽還原試驗、V-P 試驗、明膠液化試驗、接觸酶試驗為陰性。糖醇類發(fā)酵試驗結(jié)果顯示，蔗糖、阿拉伯糖、葡萄糖、木糖和乳糖為陰性。依據(jù)試驗結(jié)果，菌株YC-25 符合不動桿菌屬種群特征描述。

2.3.2 菌株YC-25的16S rRNA序列分析特征 測序結(jié)果顯示菌株YC-25的基因序列長度為1 030 bp，提交至GenBank 數(shù)據(jù)庫（登錄號為OR125558）。通過比對發(fā)現(xiàn)，菌株YC-25 與Acinetobacter pittiiLMG1035（NR 117930.1）聚在同一分支，相似度達(dá)到99%。綜合菌株YC-25 的形態(tài)、生理生化及基因序列分析，鑒定為不動桿菌（Acinetobater pittii），暫命名為Acinetobater pittiiYC-25（圖6）。

圖6 YC-25的16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 菌株YC-25對煙草的促生效果驗證

盆栽試驗驗證菌株發(fā)酵液（1×108CFU/mL）對煙草的促生效果顯示，處理42 d 后，處理T1的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率略高于處理T2，顯著高于CK，胞間CO2濃度低于CK 和處理T2（表1），說明菌株處理后的煙株生理活性較強(qiáng)。處理T1煙株各項農(nóng)藝性狀均高于CK 和處理T2，與CK 相比，處理T1煙草株高增加了26.29%，莖圍增加了27.54%，最大葉面積增加了17.26%（表2）。圖7 顯示，處理T1煙草葉片寬厚、濃綠，新生根系更加發(fā)達(dá)，說明菌株YC-25對煙草生長產(chǎn)生了較好的促進(jìn)作用。

表1 不同處理的生理參數(shù)

表2 不同處理農(nóng)藝性狀的比較

圖7 不同處理煙株生長狀況

3 結(jié)論與討論

周亞男等[28]研究表明，從煙草根際土壤分離出來的假單胞菌（P.koreensisHCH2-3）、淺黃綠假單胞菌（P.luridaFGD5-2）和貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensisEM-1）對煙苗呈現(xiàn)不同程度的促生作用。本研究從煙草根際土壤中篩選出的一株高效促生菌株，對6 種病原真菌平均抑菌率為48%，經(jīng)多相鑒定屬于皮特不動桿菌，豐富了煙草促生菌種資源庫。大多數(shù)研究表明，皮特不動桿菌主要功能為降解纖維素[29-30]和高效分解有機(jī)磷及無機(jī)磷[31]。煙草促生過程中，關(guān)于皮特不動桿菌促進(jìn)煙草生長的相關(guān)產(chǎn)品較少，本試驗篩選獲得的促生菌不動桿菌YC-25，為煙草促生及生物菌劑開發(fā)提供了重要的資源。菌株在防治枯萎病菌的同時，對黃斑病菌、黑斑病菌等其他植物病菌也具有生物防治作用，抑菌譜較廣。菌株YC-25分泌IAA的同時，兼具解磷、解鉀活性和產(chǎn)纖維素酶能力，對煙草發(fā)育產(chǎn)生促進(jìn)作用。因此，菌株YC-25 作為促生菌開發(fā)潛力巨大，在后期的研究中，可對菌株的發(fā)酵特性和次生產(chǎn)物進(jìn)行開發(fā)。不動桿菌在防控植物病害、促進(jìn)植物生長等方面發(fā)揮著重要作用，但其在植物體內(nèi)的代謝過程、調(diào)控機(jī)制和對植物的作用效果等還需要更多的研究，以明確不動桿菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用效果，并為其發(fā)展和推廣提供理論基礎(chǔ)。當(dāng)下，不動桿菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用研究相對較少，但隨著其生物防治效果和環(huán)境安全性越來越受到人們關(guān)注，不動桿菌將會有更廣闊的發(fā)展前景。