趙云，王旭，張擎，姚文強(qiáng)，陳凱，徐奚如

（1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210029； 2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)代謝病中醫(yī)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210029； 3. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029）

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是目前全球最常見的慢性疾病之一，其發(fā)病率正呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，而認(rèn)知功能障礙，已被認(rèn)為是DM 的一種重要的共病和并發(fā)癥［1］。DM 作為一種逐年增長的代謝性疾病，威脅著全球數(shù)百萬人的健康，認(rèn)知功能障礙是DM 的一種日益嚴(yán)重的并發(fā)癥，越來越受到人們的重視。預(yù)計(jì)到2040年，這一數(shù)字將增加到7億，其中，2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）占大多數(shù)（90%～95%）；DM患者發(fā)生輕度認(rèn)知障礙（高達(dá)60%）和癡呆癥（50%～100%）的風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)高于非DM患者，因此認(rèn)知功能的改善逐漸成為DM 療效的評估標(biāo)準(zhǔn)之一［2-4］。現(xiàn)今對于糖尿病合并認(rèn)知功能障礙（diabetic cognitive dysfunction，DCD）的產(chǎn)生機(jī)制尚未完全清楚，對其治療也尚處于探索階段，如何治療DCD 成為當(dāng)前研究的一大難點(diǎn)和熱點(diǎn)，而中醫(yī)藥在治療DCD上已取得了一定的成績。

“糖脂清”是導(dǎo)師王旭教授多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)并創(chuàng)制的中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)方，全方由黃精、鬼箭羽、枸杞子、澤蘭、僵蠶五味中藥組成，獲得國家專利（101829271A）。具益氣養(yǎng)陰、益腎養(yǎng)肝、活血、化痰通絡(luò)等功效，方中諸藥對糖脂代謝、認(rèn)知功能、自噬調(diào)節(jié)均具有一定的積極作用。前期研究表明，“糖脂清”能夠提升DM 模型大鼠及DM 模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，改善其海馬區(qū)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)，緩解氧化應(yīng)激異常狀態(tài)，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，可在一定程度上調(diào)節(jié)自噬，從而保護(hù)海馬區(qū)神經(jīng)元得以改善DM 引起認(rèn)知障礙的DCD 鼠的認(rèn)知功能［5-8］。關(guān)于“糖脂清”通過調(diào)節(jié)自噬以改善認(rèn)知功能的具體影響及作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。本實(shí)驗(yàn)研究將從動(dòng)物層面探討“糖脂清”對T2DM 模型小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元自噬機(jī)制，并對“糖脂清”通過調(diào)節(jié)自噬改善DCD狀態(tài)小鼠認(rèn)知功能的療效進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)合課題組前期研究成果，分析“糖脂清”在改善DCD 小鼠認(rèn)知方面的作用機(jī)制及影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

90 只SPF 級黑色雄性C57BL/6J 小鼠（南京青龍山動(dòng)物養(yǎng)殖場），6～8 周齡，體質(zhì)量（20 ± 3）g，飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)室為恒溫、恒濕環(huán)境，溫度18～25 ℃，濕度40%～55%，晝夜光照交替，噪聲 < 60 dB。本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已通過南京中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目編號：012071001686，審查批號：202201A038。

1.2 試劑與藥物

“糖脂清”方由黃精150 g，僵蠶150 g，鬼箭羽225 g，枸杞子180 g，澤蘭180 g 組成，全部中藥飲片全部購于江蘇省中醫(yī)院中藥房，符合2020 年版《中華人民共和國藥典》及相關(guān)規(guī)定。

無水檸檬酸（批號：B21313，上海源葉生物科技有限公司）；檸檬酸鈉（批號：S11110，上海源葉生物科技有限公司）；鏈脲佐菌素（STZ）（批號：s－0130，美國Sigma 公司）；鹽酸二甲雙胍片（批號：H20113492，華北制藥股份有限公司）；多聚甲醛固定液（中性）（批號：20170323，Solarbio 公司）；HE 染液（批號：G1005，servicebio）；全蛋白提取試劑盒（批號：KGP250，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號：P0010，碧云天生物技術(shù)有限公司）；小鼠自噬相關(guān)蛋白5（ATG5）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒（批號：YJ822129）、小鼠自噬相關(guān)蛋白12（ATG12）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒（批號：YJ823286）（上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司）；β－Actin（內(nèi)參）抗體（批號：bs－0061R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；ATG7 Monoclonal antibody（批號：67341－1－Ig）、LC3 Polyclonal antibody（批號：14600－1－AP）（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；Beclin 1 Rabbit Polyclonal Antibody（KO Validated）（ 批號：AF5123）、ATG5 Rabbit Monoclonal Antibody（批號：AF2269）、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H + L）（批號：A0216）、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（批號：A0208）（碧云天生物技術(shù)有限公司）；PCR 引物（上海捷瑞生物工程有限公司）；SteadyPure 通用型RNA 提取試劑盒（批號：AG21017）、Evo M－MLV 反轉(zhuǎn)錄預(yù)混型試劑盒（批號：AG11728）、HS 預(yù)混型qPCR 試劑盒（含ROX）（批號：AG11718）［艾科瑞（AG）生物工程有限公司］。

1.3 溶液制備

1.3.1 “糖脂清”制備

將黃精150 g，僵蠶150 g，鬼箭羽225 g，枸杞子180 g，澤蘭180 g 五味中藥浸泡30 min，煎煮成濃度為每1 mL 含生藥量1.5 g 的中藥水煎劑，4 ℃保存?zhèn)溆?。按照人與小鼠體表面積換算公式換算出小鼠相應(yīng)的等效劑量［9］，給藥前將中藥取出復(fù)溫。

1.3.2 鹽酸二甲雙胍溶液制備

用天平稱取一定質(zhì)量的鹽酸二甲雙胍片（批號：H20113492，華北制藥股份有限公司）置于研缽中碾碎成粉末，以雙蒸水作為溶劑配置成1 mg/mL 二甲雙胍溶液，經(jīng)渦旋儀充分振蕩混勻后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 檸檬酸緩沖液制備

先準(zhǔn)備兩支裝有100 mL 雙蒸水的試管，然后稱取2.1 g 檸檬酸溶于其中一支裝有100 mL 雙蒸水的試管中混勻配成A 液，再稱取2.94 g 檸檬酸鈉溶于另一支裝有100 mL 雙蒸水的試管中混勻配成B 液，根據(jù)STZ量計(jì)算所需檸檬酸緩沖液量（mL），按一定比例將A、B液混勻（按體積比A∶B = 1∶1 即可，A 液加B 液為所需檸檬酸緩沖液量），再根據(jù)混合液PH值，適當(dāng)添加A、B液量，使混合溶液pH 值在4.2～4.5 范圍內(nèi)即可，置于4 ℃冷藏，檸檬酸緩沖液現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 儀器設(shè)備

三諾血糖儀、血糖試紙（三諾生物傳感股份有限公司）；Morris 水迷宮設(shè)備（安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司）；天平（賽多利斯公司）；生物熒光倒置顯微鏡（Olympus 公司，型號：CKX53）；脫水機(jī)（武漢俊杰電子有限公司，型號：JJ－12J）；包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司，型號：JB－P5）；病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司，型號：RM2016）；凍臺（武漢俊杰電子有限公司，型號：JB－L5）；組織攤片機(jī)（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司，型號：KD－P）；烤箱（天津市萊玻瑞儀器設(shè)備有限公司，型號：GFL－230）；正置光學(xué)顯微鏡（日本尼康，型號：E100）；成像系統(tǒng)（日本尼康，型號：DS－U3）；超凈工作臺（新加坡藝思高科技有限公司）；旋渦混合器（上海馳唐電子有限公司，型號：XW－80A）；多功能酶標(biāo)儀（PE，型號：enspire）；高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf 公司，型號：5417R）；臺式恒溫振蕩器（中國上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，型號：MM400）；超微量分光光度計(jì)（Thermo）；熒光定量PCR 儀（上海宏石醫(yī)療器械有限公司，型號：7500）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物造模與分組

所有動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，觀察小鼠一般情況，包括飲食、體質(zhì)量、精神狀態(tài)等，確認(rèn)小鼠狀況良好后進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)，將90只C57BL/6J雄性小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為兩組，即空白組（n= 12）和造模組（n= 78）。其中，空白組小鼠僅給予標(biāo)準(zhǔn)普通飼料和飲用水，造模組小鼠則給予高脂高糖飼料（具體成分：基礎(chǔ)飼料59%，蔗糖20%，豬油18%，蛋黃粉3%）和飲用水喂養(yǎng)，喂養(yǎng)6周左右，使小鼠平均體質(zhì)量達(dá)到30～35 g后準(zhǔn)備造模。造模前一天，所有小鼠禁食不禁水過夜，按照每只小鼠120 mg/kg 計(jì)算STZ 量并配好緩沖液，空白組小鼠腹腔注射等量緩沖液，3 d 后對造模小鼠進(jìn)行尾靜脈采血，小鼠血糖 ≥ 16.7 mmol/L 即認(rèn)為造模成功［9］。對于血糖不達(dá)標(biāo)的小鼠根據(jù)血糖值補(bǔ)打STZ，3 d 后復(fù)測。造模成功的小鼠依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為模型組、糖脂清低劑量組、糖脂清中劑量組、糖脂清高劑量組以及二甲雙胍組，造模期間體質(zhì)量不達(dá)標(biāo)小鼠4只（體質(zhì)量17～25 g），血糖無法達(dá)標(biāo)小鼠6 只，造模死亡小鼠7 只，最終分組為模型組14只，糖脂清低、中劑量組12只，糖脂清高劑量組11只，二甲雙胍組12只。

2.2 給藥

待所有小鼠造模成功并分組后，即對小鼠進(jìn)行灌胃給藥，給藥頻率為1次/d，固定時(shí)間灌胃。二甲雙胍組依據(jù)參考文獻(xiàn)［10］給予0.25 g/（kg·d）鹽酸二甲雙胍灌胃，糖脂清低劑量組給予6 g/（kg·d）糖脂清灌胃，糖脂清中劑量組給予12 g/（kg·d）糖脂清灌胃，糖脂清高劑量組給予24 g/（kg·d）糖脂清灌胃，空白組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃，持續(xù)12周。

2.3 行為學(xué)檢測

在灌胃給藥12 周后，對所有小鼠進(jìn)行Morris 水迷宮測試，整個(gè)試驗(yàn)過程共需6 d。每只小鼠在進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練1 d后，開始正式實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為定位航行和空間探索兩個(gè)部分。將每只小鼠分別從4 個(gè)象限面面壁入水，通過計(jì)算機(jī)觀察小鼠60 s 游泳運(yùn)動(dòng)軌跡。如果小鼠能夠在60 s 內(nèi)找到平臺，并于平臺上方逗留3 s，計(jì)算機(jī)會(huì)自動(dòng)停止追蹤，記錄該小鼠找尋平臺所用時(shí)間以作為逃避潛伏期。如果小鼠不能在60 s內(nèi)找到平臺，則系統(tǒng)自動(dòng)記錄該小鼠的逃避潛伏期為60 s，工作人員需要將小鼠人工引導(dǎo)放置于平臺之上，令小鼠于平臺上停留 15 s 后，再進(jìn)行下一只小鼠測試。每日按照第Ⅰ象限、第Ⅱ象限、第Ⅲ象限、第Ⅳ象限的順序?qū)π∈筮M(jìn)行訓(xùn)練，連續(xù)進(jìn)行5 d。

第6天即正式實(shí)驗(yàn)的第5天，需要撤去第Ⅳ象限的平臺，實(shí)驗(yàn)期間不再需要人工引導(dǎo)，只需將小鼠從第Ⅰ象限入水點(diǎn)放入，電腦自動(dòng)記錄每只小鼠在60 s 內(nèi)穿越的平臺次數(shù)，通過高速攝影機(jī)記錄每組小鼠的行動(dòng)軌跡，運(yùn)用計(jì)算機(jī)軟件分析小鼠的空間探索記憶能力。

2.4 取材

行為學(xué)檢測后，由于實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的不同，需對小鼠進(jìn)行分組后進(jìn)行不同方式的取材以制備標(biāo)本。

①血液標(biāo)本：在灌胃給藥12周末，灌胃用藥后24 h，禁食不禁水12 h，根據(jù)其體質(zhì)量予20%烏來糖進(jìn)行腹腔注射麻醉。麻醉成功后，使用消毒滅菌后的眼科鑷摘除小鼠眼球，快速眼眶取血至1.5 mL 離心管中，將離心管靜置于冰上，血液標(biāo)本后期需轉(zhuǎn)移至離心機(jī)，在4 ℃ 12 000 r/min 條件下離心10 min 后取出，小心吸取離心管上層淡黃色血清于新的離心管中，將血清標(biāo)本放置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

②腦組織：將小鼠進(jìn)行脫椎處死，并立即置于冰上，小心剝離顱骨，取出小鼠完整腦組織，將腦組織用中性多聚甲醛固定液固定，室溫保存。

③海馬組織標(biāo)本：眼眶取血后，將小鼠迅速進(jìn)行脫頸處死，并立即置于冰上，將小鼠用鑷子剝離顱骨后取出完整的腦組織，摘除前端嗅球、小腦、丘腦等結(jié)構(gòu)，翻轉(zhuǎn)皮層后用玻璃分針對小鼠腦組織進(jìn)行鈍性分離，迅速取出小鼠雙側(cè)的海馬組織并放入做好分類標(biāo)記的凍存管中，將裝有海馬組織的凍存管放入液氮中凍存，待取材完畢后根據(jù)需要將標(biāo)本進(jìn)行提取使用，或轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱中保存。

2.5 ELISA法檢測Atg5、Atg12表達(dá)量

嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒使用說明書進(jìn)行操作，檢測小鼠血清中的Atg5、Atg12表達(dá)量。

2.6 HE染色

將用中性多聚甲醛固定液固定的小鼠腦組織進(jìn)行石蠟切片、脫水處理，處理完成后，將腦組織切片放入蘇木素染液染色，返藍(lán)液返藍(lán)，再進(jìn)行梯度酒精脫水，隨后于伊紅染液中染色，最后進(jìn)行脫水封片處理，即用無水乙醇及二甲苯脫水后，再用中性樹膠進(jìn)行封片。標(biāo)本制備成功后，用光學(xué)顯微鏡鏡檢觀察，進(jìn)行圖像分析。

2.7 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)

首先對小鼠海馬組織進(jìn)行蛋白提取，BCA 法檢測蛋白濃度，在正式免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)前，須預(yù)先計(jì)算并設(shè)計(jì)Western blot 實(shí)驗(yàn)的蛋白樣品上樣量。常規(guī)電泳，轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉封閉，根據(jù)抗體說明書稀釋抗體，孵育Beclin1（1∶500）、Atg5（1∶1 000）、Atg7（1∶1 000）、LC3（1∶1 000）的一抗，同時(shí)孵育β－actin（1∶5 000）抗體作為內(nèi)參，孵育相應(yīng)二抗（1∶1 000）。加ECL 化學(xué)發(fā)光底物顯色，用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影，ImageJ軟件分析目的條帶的凈光密度值。采用Western blot 檢測蛋白表達(dá)小鼠海馬Beclin1、Atg5、Atg7、LC3 自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。

2.8 Real－time PCR實(shí)驗(yàn)

提取小鼠海馬組織RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件為：37 ℃孵育15 min，85 ℃度孵育5 s，4 ℃孵育結(jié)束。使用RT－qPCR 試劑盒檢測各組關(guān)鍵基因Atg5、Atg7的基因表達(dá)水平。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性時(shí)間30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s 循環(huán)次數(shù)40 次。用相對定量2-ΔΔCT法對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。引物設(shè)計(jì)見表1。

表1 引物序列表

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用 GraphPad Prism 8 的統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，其中計(jì)量資料用均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)。多組間的比較采用方差分析和重復(fù)檢驗(yàn)，兩組組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。對于不符合正態(tài)分布的樣本，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P< 0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠一般情況比較

實(shí)驗(yàn)過程中，有7 只小鼠于造模期間死亡，有8 只小鼠于灌胃給藥期間死亡。其中，模型組小鼠死亡2 只，糖脂清低、中、高劑量組死亡小鼠數(shù)目分別為2、1、1 只，二甲雙胍組小鼠死亡2 只，空白組小鼠未出現(xiàn)死亡?？瞻捉M小鼠精神狀態(tài)良好，毛色有光澤，活動(dòng)度良好，對外界聲音或光線刺激能作出敏銳的反應(yīng)，飲食、飲水、排泄均正常；模型組小鼠的整體精神狀態(tài)欠佳，毛色晦暗欠光澤，對外界刺激作出反應(yīng)較為遲鈍，行動(dòng)較為遲緩，多飲、多食、多尿；糖脂清各劑量組與二甲雙胍組的小鼠精神狀態(tài)稍欠佳，毛色光澤度及對外界刺激所做反應(yīng)程度下降，活動(dòng)度尚可，飲食量、飲水量、尿量明顯增加，整體情況比空白組略差，與模型組相比則較好。

3.2 Morris水迷宮行為學(xué)測試結(jié)果

3.2.1 各組小鼠定位航行能力的比較

Morris 水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)顯示：水迷宮實(shí)驗(yàn)第1 天，各組的逃避潛伏期無明顯差異（P> 0.05）；第2 天，各組小鼠的潛伏期均出現(xiàn)不同程度的縮短，但結(jié)果仍無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05）；第3 天，與空白組小鼠比，模型組小鼠的逃避潛伏期延長（P< 0.05），提示模型組小鼠的學(xué)習(xí)記憶及空間探索能力下降；與模型組小鼠比較，糖脂清低、高劑量組以及二甲雙胍組小鼠潛伏期明顯縮短（P< 0.05）；第4 天，與模型組小鼠相比較，糖脂清各劑量組與二甲雙胍組小鼠的逃避潛伏期縮短（P< 0.05，P< 0.01），提示隨著時(shí)間的延長，各組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力在逐漸得到提升，二甲雙胍組小鼠的學(xué)習(xí)能力提升最明顯（P< 0.01）；第5 天，和模型組比較，糖脂清各劑量組及二甲雙胍組的小鼠逃避潛伏期明顯縮短（P< 0.05，P< 0.01），其中糖脂清高劑量組和二甲雙胍組的學(xué)習(xí)能力提升最明顯（P<0.01），說明糖脂清組小鼠學(xué)習(xí)記憶及定位航行能力明顯優(yōu)于模型組，但糖脂清各劑量組間統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果無明顯差異（P> 0.05）；二甲雙胍組的逃避潛伏期雖明顯縮短（P< 0.01），但和糖脂清各組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05）。提示“糖脂清”及二甲雙胍可以提升認(rèn)知造模后小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，從而提高其定位航行能力。結(jié)果見表2。

表2 各組小鼠逃避潛伏期比較（ ± s，s）

表2 各組小鼠逃避潛伏期比較（ ± s，s）

注：與空白組比較，#P < 0.05，##P < 0.01；與模型組比較，*P < 0.05，**P < 0.01。

組別空白組模型組糖脂清低劑量組糖脂清中劑量組糖脂清高劑量組二甲雙胍組n 10 10 10 10 10 10第1天56.84 ± 2.08 59.75 ± 0.40 58.12 ± 2.89 59.15 ± 1.21 58.06 ± 3.99 57.98 ± 4.37第2天49.29 ± 6.34 57.22 ± 2.10 53.81 ± 5.13 53.50 ± 7.08 51.17 ± 8.12 50.28 ± 6.612第3天38.77 ± 9.32 55.28 ± 3.59#45.21 ± 6.05*46.71 ± 6.64 43.82 ± 6.87*45.25 ± 5.35*第4天34.54 ± 7.95 51.38 ± 3.11##38.88 ± 7.27*39.17 ± 7.39*36.52 ± 7.74*37.97 ± 4.95**第5天29.85 ± 8.65 49.67 ± 5.98##37.12 ± 7.18*36.69 ± 6.78*34.44 ± 5.23**34.56 ± 6.77**

3.2.2 各組小鼠空間探索能力的比較

Morris 水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在撤去平臺后，空白組小鼠的穿越平臺次數(shù)明顯增加，與空白組比較，模型組小鼠穿越平臺次數(shù)明顯減少（P< 0.01）；但與空白組比較，糖脂清各劑量組以及二甲雙胍組小鼠的穿越平臺次數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05）；與模型組比較，各給藥組小鼠的穿越平臺次數(shù)明顯增加，其中糖脂清中、高劑量組以及二甲雙胍組小鼠的穿越平臺次數(shù)明顯增加（P< 0.05，P< 0.01），糖脂清低劑量組小鼠穿越平臺次數(shù)雖較模型組高，但結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05），而糖脂清各劑量組之間，以及糖脂清各劑量組與二甲雙胍組之間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05）。結(jié)果見表3。

表3 各組小鼠穿越平臺次數(shù)比較（ ± s）

表3 各組小鼠穿越平臺次數(shù)比較（ ± s）

注：與空白組比較，##P < 0.01；與模型組比較，*P < 0.05，**P < 0.01。

組別空白組模型組糖脂清低劑量組糖脂清中劑量組糖脂清高劑量組二甲雙胍組n 10 10 10 10 10 10劑量/［g/（kg·d）］——6 12 24 0.25穿越平臺次數(shù)/次3.43 ± 1.13 1.14 ± 0.67##2.29 ± 0.76 2.43 ± 0.53*2.71 ± 0.76**2.86 ± 0.69**

各組小鼠每日的目標(biāo)象限路程比及時(shí)間比結(jié)果顯示：與模型組比較，各組小鼠的目標(biāo)象限路程比及時(shí)間比均明顯增加，但前四天的數(shù)據(jù)中，各組小鼠的路程比差異相對較明顯，而時(shí)間比差異不明顯，考慮因時(shí)間比差異受小鼠體力變化、游泳速度以及游泳路程等不確定因素影響，需結(jié)合路程比綜合分析。第5 天，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為明顯，與模型組相比，糖脂清各劑量組及二甲雙胍組的目標(biāo)象限路程比明顯上升（P< 0.01），糖脂清低劑量組和高劑量組的目標(biāo)象限時(shí)間比也明顯升高（P< 0.01）。結(jié)果見圖1和圖2。

圖1 各組小鼠目標(biāo)象限路程比的比較

圖2 各組小鼠目標(biāo)象限時(shí)間比的比較

綜合分析，造模后小鼠的空間探索能力出現(xiàn)明顯下降，與模型組小鼠相比較，糖脂清各劑量組及二甲雙胍組小鼠的學(xué)習(xí)記憶及空間探索能力則在不斷提升，說明造模后小鼠認(rèn)知功能受損，出現(xiàn)學(xué)習(xí)、記憶等認(rèn)知水平下降的表現(xiàn)，而“糖脂清”及二甲雙胍能夠改善小鼠學(xué)習(xí)記憶能力、提升認(rèn)知水平、提高其空間探索能力。

3.3 各組小鼠海馬組織的CA1區(qū)和CA3區(qū)的比較

HE染色結(jié)果顯示：空白對照組小鼠的海馬神經(jīng)元細(xì)胞，在CA1 區(qū)和CA3 區(qū)的排列均比較整齊且緊密，結(jié)構(gòu)較完整，細(xì)胞膜清楚，細(xì)胞核仁和核膜清晰可見，胞質(zhì)豐富，未見明顯的變性或壞死；模型組小鼠的海馬神經(jīng)元細(xì)胞，在CA1 區(qū)和CA3 區(qū)的排列不夠規(guī)則，結(jié)構(gòu)疏散，細(xì)胞間隙明顯，可見細(xì)胞胞體縮小，核固縮，呈深染狀態(tài)，可見壞死細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)目及層數(shù)減少；二甲雙胍組及糖脂清各劑量組的小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞，在CA1區(qū)和CA3區(qū)的細(xì)胞排列與模型組相比，排列整齊，結(jié)構(gòu)尚且緊湊，細(xì)胞數(shù)量較多，糖脂清低、中劑量組可見部分細(xì)胞核固縮，但整體較模型組胞質(zhì)豐富、結(jié)構(gòu)完整，少有變性、壞死。提示“糖脂清”及二甲雙胍對小鼠海馬神經(jīng)元有保護(hù)作用。結(jié)果見圖3。

圖3 各組小鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)HE染色圖

3.4 各組小鼠血清自噬相關(guān)蛋白Atg5、Atg12 含量的比較

ELISA 結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組的Atg5、Atg12 含量明顯減少（P< 0.01），提示造模后小鼠自噬水平的下降，而糖脂清低劑量組血清中Atg5、Atg12 的含量雖較空白組減少（P< 0.05，P< 0.01），但較模型組增加（P< 0.01），提示“糖脂清”能夠促進(jìn)Atg5、Atg12 的表達(dá)，說明“糖脂清”可能對自噬具有促進(jìn)作用。與模型組相比較，各給藥組的Atg5 含量均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.01）；糖脂清低、高劑量組以及二甲雙胍組的Atg12含量明顯上升（P< 0.01），其中糖脂清高劑量組的Atg12 含量甚至超過空白組（P< 0.01），糖脂清中劑量組的Atg12 表達(dá)水平雖升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05），提示“糖脂清”及二甲雙胍對造模后小鼠自噬水平的提高有促進(jìn)作用。結(jié)果見表4和圖4。

圖4 各組小鼠海馬組織中Beclin1、LC3、Atg5、Atg7蛋白表達(dá)

表4 各組小鼠Atg5、Atg12表達(dá)量比較（ ± s，pg/mL）

表4 各組小鼠Atg5、Atg12表達(dá)量比較（ ± s，pg/mL）

注：與空白組比較，#P < 0.05，##P < 0.01；與模型組比較，*P < 0.05，**P < 0.01。

組別空白組模型組糖脂清低劑量組糖脂清中劑量組糖脂清高劑量組二甲雙胍組n3 3 3 3 3 3 Atg5表達(dá)量5 987.00 ± 249.30 4 125.00 ± 243.50##5 131.00 ± 274.00#**5 125.00 ± 120.00#**6 419.00 ± 180.90**5 770.00 ± 170.40**Atg12表達(dá)量1 073.00 ± 58.19 678.50 ± 34.29##873.60 ± 42.43##**736.50 ± 31.47##1 478.00 ± 77.10##**987.80 ± 37.51**

3.5 各組小鼠海馬區(qū)Beclin1、Atg5、Atg7、LC3 蛋白表達(dá)的比較

Western blot 結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組的Beclin1、Atg5、Atg7、LC3 蛋白表達(dá)水平均出現(xiàn)明顯下降（P< 0.01），提示STZ造模后使得模型小鼠海馬的自噬水平出現(xiàn)明顯下降。與模型組比較，糖脂清高劑量組及二甲雙胍組的Beclin1、LC3、Atg5、Atg7 蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)了不同程度的升高，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05，P< 0.01）；糖脂清低劑量組Atg7 的蛋白表達(dá)水平升高，糖脂清中劑量組LC3 的蛋白表達(dá)水平也呈明顯上升趨勢（P< 0.01），提示“糖脂清”及二甲雙胍可能對模型小鼠海馬的自噬功能恢復(fù)有促進(jìn)作用，“糖脂清”及二甲雙胍能夠提高T2DM 模型小鼠海馬的自噬水平。結(jié)果見表5。

表5 各組小鼠海馬組織中Beclin1、LC3、Atg5、Atg7蛋白表達(dá)水平比較（ ± s）

表5 各組小鼠海馬組織中Beclin1、LC3、Atg5、Atg7蛋白表達(dá)水平比較（ ± s）

注：與空白組比較，#P < 0.05，##P < 0.01；與模型組比較，*P < 0.05，**P < 0.01。

組別空白組模型組糖脂清低劑量組糖脂清中劑量組糖脂清高劑量組二甲雙胍組n3 3 3 3 3 3 Beclin1/β－actin 0.42 ± 0.01 0.33 ± 0.07##0.39 ± 0.06 0.37 ± 0.00 0.43 ± 0.00**0.45 ± 0.03**LC3/β－actin 0.71 ± 0.13 0.51 ± 0.06##0.61 ± 0.03 0.80 ± 0.07**0.77 ± 0.04**0.79 ± 0.01**Atg5/β－actin 0.55 ± 0.04 0.34 ± 0.04##0.42 ± 0.04#0.43 ± 0.03 0.46 ± 0.03*0.51 ± 0.07**Atg7/β－actin 0.18 ± 0.00 0.17 ± 0.01##0.18 ± 0.00**0.14 ± 0.00##**0.18 ± 0.00**0.18 ± 0.01**

3.6 各組小鼠海馬組織Atg5、Atg7 mRNA表達(dá)情況的比較

Real－time PCR 結(jié)果顯示：對空白對照組、模型組以及糖脂清組（糖脂清高劑量組）的三組小鼠進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測，數(shù)據(jù)處理后發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，模型組Atg5、Atg7 mRNA 表達(dá)呈下降趨勢，但結(jié)果分析后提示無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05）；與模型組比較，糖脂清組（糖脂清高劑量組）Atg5 mRNA 表達(dá)量出現(xiàn)明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，糖脂清組（糖脂清高劑量組）Atg7 mRNA表達(dá)雖出現(xiàn)一定的升高趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05）。結(jié)果見表6。

表6 各組小鼠海馬組織Atg5、Atg7 mRNA表達(dá)水平比較（ ± s）

表6 各組小鼠海馬組織Atg5、Atg7 mRNA表達(dá)水平比較（ ± s）

注：與模型組比較，*P < 0.05。

組別空白組模型組糖脂清組高劑量組n3 3 3 Atg5 1.00 ± 0.00 0.82 ± 0.16 1.22 ± 0.16*Atg7 1.0 ± 0.00 0.60 ± 0.56 0.97 ± 0.28

4 討論

近年來諸多關(guān)于自噬的研究表明，在大多數(shù)自噬障礙導(dǎo)致的疾病中，大腦往往是受影響最嚴(yán)重的器官，自噬途徑中涉及的基因突變往往與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)，這表明神經(jīng)元嚴(yán)重依賴自噬來維持正常功能和體內(nèi)平衡。與其他細(xì)胞類型不同，神經(jīng)元是有絲分裂后細(xì)胞，無法通過有絲分裂途徑清除有害物質(zhì)［11-12］。因此，自噬清除功能在神經(jīng)元中更為重要，自噬有助于清除腦中累積的細(xì)胞毒性蛋白，從而發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用［13］。認(rèn)知功能障礙疾病和自噬的關(guān)系尤為密切，包括神經(jīng)系統(tǒng)慢性病變，如AD、腦微血管病變、帕金森?。≒arkinson disease，PD）等，研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元內(nèi)自噬水平異常會(huì)破壞細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，嚴(yán)重時(shí)可影響患者的認(rèn)知功能，通過調(diào)控各種細(xì)胞自噬信號通路可明顯改善細(xì)胞缺氧、促進(jìn)能量及物質(zhì)代謝，改善認(rèn)知功能［14］。ROCCHI等［15］通過敲入點(diǎn)突變F121A 至Beclin1/Becn1，生成細(xì)胞自噬活躍的小鼠模型，結(jié)果顯示，細(xì)胞自噬激活后腦淀粉樣蛋白積累減少，小鼠的認(rèn)知缺陷得到改善。在自噬的諸多通路中，Beclin1 作為在哺乳動(dòng)物中被鑒定出的第一個(gè)能夠誘導(dǎo)自噬的基因，能夠與不同的蛋白形成復(fù)合物從而發(fā)揮調(diào)控自噬的作用。GUAN 等［16］研究表明，Beclin1 介導(dǎo)的海馬神經(jīng)元自噬可能在老年DM 小鼠認(rèn)知和情感障礙中發(fā)揮重要作用。中藥及自噬在DCD 治療中的積極作用不可否認(rèn)［17-18］，無論是自噬相關(guān)蛋白，還是自噬經(jīng)典通路的相關(guān)研究，均表明自噬在DCD 為代表的神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮重要作用，本課題的研究也是在此基礎(chǔ)上，結(jié)合前期研究成果，以自噬相關(guān)蛋白ATG 系列，Beclin1、LC3 等切入，探究自噬相關(guān)通路下中藥參與自噬調(diào)節(jié)并引起認(rèn)知功能改變的機(jī)制可能，結(jié)果表明，自噬積極參與并影響DCD 的進(jìn)程，中藥對自噬功能的恢復(fù)有著積極作用。

本實(shí)驗(yàn)在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，選用C57BL/6J 雄性小鼠，通過注射STZ 誘導(dǎo)T2DM 模型小鼠，并逐漸進(jìn)展為DCD，研究“糖脂清”對T2DM 小鼠后期出現(xiàn)認(rèn)知功能受損的保護(hù)機(jī)制，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)對“糖脂清”治療和改善DCD 小鼠的效用機(jī)制的研究。前期實(shí)驗(yàn)表明“糖脂清”可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的表達(dá)實(shí)現(xiàn)對DCD 小鼠認(rèn)知功能的保護(hù)和修復(fù)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬也參與了DCD 的發(fā)生、發(fā)展過程中，“糖脂清”也有可能通過調(diào)控細(xì)胞自噬的相關(guān)信號通路實(shí)現(xiàn)對DCD 小鼠的腦保護(hù)作用。細(xì)胞自噬作為一種存在于機(jī)體細(xì)胞的代謝過程，生理狀態(tài)下，正常水平的細(xì)胞自噬參與細(xì)胞內(nèi)衰老細(xì)胞器和異常蛋白質(zhì)等成分的消化和降解，有利于維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)；病理狀態(tài)下，被適當(dāng)激活的細(xì)胞自噬可加強(qiáng)細(xì)胞對內(nèi)部廢物和有害物質(zhì)的消除，同樣有利于細(xì)胞的存活。但當(dāng)細(xì)胞自噬過程發(fā)生異常，細(xì)胞穩(wěn)態(tài)被破壞，細(xì)胞生存將受到影響，甚至可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。越來越多的證據(jù)表明，過度自噬對神經(jīng)元有害。過度自噬的閾值尚不清楚，相關(guān)機(jī)制的研究也缺乏有力的證據(jù)。細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬之間相互聯(lián)系，大量研究也表明細(xì)胞自噬在神經(jīng)發(fā)育性疾病中發(fā)揮重要作用，結(jié)合課題組前期結(jié)果，有充分理由相信，自噬在DCD 的生成等相關(guān)機(jī)制中占據(jù)著重要的作用。本實(shí)驗(yàn)正是此基礎(chǔ)上進(jìn)行設(shè)計(jì)，通過注射STZ 構(gòu)造T2DM 小鼠模型，通過水迷宮實(shí)驗(yàn)分析小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，評估小鼠認(rèn)知功能情況，通過組間數(shù)據(jù)的分析比較，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠認(rèn)知水平相較于其他各組小鼠明顯下降，提示模型組小鼠出現(xiàn)DCD表現(xiàn)。

在本次研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)STZ 誘導(dǎo)后的T2DM 小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力受到了明顯損害，主要通過以下幾個(gè)方面：①水迷宮行為學(xué)測試后發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，模型組小鼠出現(xiàn)逃避潛伏期延長、目標(biāo)象限路程比及目標(biāo)象限時(shí)間比下降明顯、穿越平臺次數(shù)明顯減少的現(xiàn)象，反映了DM 小鼠學(xué)習(xí)記憶、定位航行、空間探索等多方面能力的下降，是T2DM 小鼠存在顯著認(rèn)知功能障礙的表現(xiàn)。②海馬組織病理切片提示，相較于正常組小鼠，T2DM小鼠的海馬細(xì)胞排列不規(guī)則，細(xì)胞間出現(xiàn)間隙，其中很多細(xì)胞胞體縮小，胞核固縮，呈深染狀態(tài)，提示T2DM 小鼠海馬組織結(jié)構(gòu)的破壞。③在對于海馬組織分別采用ELISA 和Western blot 檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)，相較于空白組，T2DM 小鼠的自噬相關(guān)蛋白表達(dá)量明顯減少，結(jié)合前期模型組相比空白組小鼠的認(rèn)知功能明顯受損，筆者有理由認(rèn)為高血糖狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致小鼠的認(rèn)知功能受損，高血糖是DCD 發(fā)生、發(fā)展的重要因素之一，而自噬參與這一過程并可能起著重要的作用。因?yàn)椋噍^于模型組，在對T2DM 模型小鼠給予“糖脂清”干預(yù)后，小鼠的逃避潛伏期縮短，目標(biāo)象限路程比升高，提示T2DM 模型小鼠的認(rèn)知功能障礙改善，也側(cè)面反映“糖脂清”對DCD 的作用機(jī)制是正向、有益的。而結(jié)合細(xì)胞分子生物學(xué)的研究結(jié)果，相較于模型組，糖脂清各劑量組及二甲雙胍組的自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平的明顯升高，表明“糖脂清”對自噬的促進(jìn)作用，也提示“糖脂清”改善DCD 小鼠的認(rèn)知功能可能與促進(jìn)細(xì)胞自噬有關(guān)。但糖脂清高劑量組對于其他給藥組，自噬蛋白表達(dá)量明顯升高，甚至高于空白組，但小鼠認(rèn)知水平卻較空白組低，因此有理由推測，自噬的水平和認(rèn)知功能的修復(fù)未必呈正相關(guān)，這也說明“糖脂清”不同濃度、不同劑量可能引起了細(xì)胞自噬水平的變化，進(jìn)而影響認(rèn)知功能。對于自噬的正常水平和異常表達(dá)之間的界限，以及自噬和過度自噬對不同疾病的影響，仍有待進(jìn)一步研究。而對于中藥通過調(diào)控自噬實(shí)現(xiàn)對疾病進(jìn)展過程的調(diào)控，雖存在很多局限性，但不可否認(rèn)中藥用臨床療效證明了自己的積極作用，因此相關(guān)作用機(jī)制的研究仍需得到重視。

5 結(jié)論

“糖脂清”能夠改善DM 模型小鼠的認(rèn)知功能障礙，減緩由DM 引起的模型小鼠的海馬組織損傷，具體機(jī)制可能與細(xì)胞自噬有關(guān)。該研究結(jié)果可為后續(xù)研究“糖脂清”治療DCD 提供一定的基礎(chǔ)，也可為開發(fā)臨床治療DCD 方面的中藥或中成藥制劑提供一定的研究方法和科學(xué)依據(jù)。