梁凱欣,鐘海文,宋長緒,楊化強(qiáng),黃思秀,徐 錚

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心,廣州 510642)

豬圓環(huán)病毒 2型(porcine circovirus type 2, PCV2)是豬圓環(huán)病毒中常見且危害較大的致病亞型,因其傳播性、變異性較強(qiáng)[1],目前PCV2及多個(gè)變種毒株在我國各地豬場(chǎng)廣泛傳播[2]。PCV2在感染過程中多與豬繁殖和呼吸障礙綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)等其他病毒協(xié)同感染[3-5],引發(fā)仔豬斷奶后多系統(tǒng)消耗綜合征(post-weaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)的發(fā)生[6],并導(dǎo)致仔豬免疫抑制[7],給相關(guān)疾病的預(yù)防及治療增添難度,且極大影響?zhàn)B殖效率及成本。PCV2主要通過和不同的宿主因子互作來完成自身生命周期[8-10]。因此,探究參與PCV2感染的關(guān)鍵宿主因子可以為病毒感染機(jī)制及抗病育種研究提供重要思路。

Synaptogyrin-2 (SYNGR2)被證實(shí)參與神經(jīng)囊泡和微囊泡組成,在除腦以外組織中高表達(dá)。在果蠅體內(nèi),缺失SYNGR2會(huì)造成突觸囊泡的發(fā)生受阻,在哺乳動(dòng)物體內(nèi)SYNGR2的詳細(xì)功能仍然研究較少[11]。除神經(jīng)囊泡外,SYNGR2還參與了葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(glucose transporter-4,GLUT4)的胞內(nèi)循環(huán),SYNGR2參與組成的囊泡可將質(zhì)膜上的GLUT4轉(zhuǎn)移至反面高爾基體管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(trans Golgi network,TGN)或溶酶體[12]。在病毒感染方面,SYNGR2可通過與病毒蛋白、脂筏等宿主因子結(jié)合形成復(fù)合體的形式參與發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)的包涵體組成,協(xié)助病毒復(fù)制[13]。在細(xì)胞膨脹毒素(cytolethal distending toxin,Cdt)內(nèi)化的過程中,SYNGR2也通過相似的方式與毒素活性亞基CdtB、脂筏結(jié)合。SYNGR2敲低的人巨噬細(xì)胞可抵御毒素引起的炎癥反應(yīng)[14]。

Walker等[15]基于樣本量為974的豬群,通過全基因組關(guān)聯(lián)分析揭示了SYNGR2可促進(jìn)PCV2感染,并且發(fā)現(xiàn)了位于SYNGR2關(guān)鍵功能結(jié)構(gòu)域中的唯一SNP位點(diǎn),在此位點(diǎn)存在針對(duì)豬的物種特異抗性突變SYNGR2 p.Arg63Cys,個(gè)體的PCV2抗性跟該位點(diǎn)的基因型直接相關(guān)。作者通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,對(duì)比國內(nèi)外幾種主要豬種的基因型與樣本中包含該SNP的幾種主要單倍型,發(fā)現(xiàn)在杜洛克等外來品種中SYNGR2 p.63Cys基因頻率較高,且該抗性突變?cè)谖覈就疗贩N中較少見,揭示SYNGR2可能成為我國PCV2抗性豬培育的切入點(diǎn)。

本研究首先在體外驗(yàn)證宿主因子SYNGR2及錯(cuò)義突變SYNGR2 p.Arg63Cys對(duì)PCV2在PK15細(xì)胞上增殖的影響,并通過轉(zhuǎn)錄組分析研究與SYNGR2功能相關(guān)的基因變化,尋找與SYNGR2關(guān)聯(lián)的其他PCV2感染相關(guān)宿主因子,研究PCV2與宿主的相互作用,揭示PCV2感染宿主的可能分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、病毒及質(zhì)粒

PK15細(xì)胞、PCV2毒株(PCV2-JS17-8,GenBank編號(hào):MH211363.1)、pX330質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存;兩種SYNGR2過表達(dá)質(zhì)粒(Arg型和Cys型)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

1.2 主要試劑

RaPure Viral RNA/DNA Kit購自美基生物公司;PrimeScriptTMRT reagent Kit、Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)、DNA Ligation Kit、PrimeScript RT Master Mix購自TaKaRa公司;2×Rapid Taq Master Mix購自諾唯贊公司;Lipofectamine 3000購自Thermo Fisher公司。

1.3 SYNGR2敲除、過表達(dá)及點(diǎn)突變對(duì)PCV2增殖水平影響的鑒定

1.3.1 CRISPR/Cas9 技術(shù)構(gòu)建SYNGR2基因敲除PK15細(xì)胞系 設(shè)計(jì)靶向SYNGR2外顯子區(qū)域的gRNA,gRNA識(shí)別SYNGR2基因第2外顯子上的靶位點(diǎn)序列:GTACTGCTCTCCGGACTTG。合成gRNA相應(yīng)的Oligo DNA(合成序列見表1SYNGR2-exon2-gRNA-F和SYNGR2-exon2-gRNA-R所示),經(jīng)過退火并連接入CRISPR打靶載體pX330,形成pX330-SYNGR2 gRNA質(zhì)粒。將pX330-SYNGR2 gRNA質(zhì)粒以電穿孔轉(zhuǎn)染入PK15細(xì)胞,經(jīng)過G418篩選獲得穩(wěn)定敲除SYNGR2的單克隆細(xì)胞。逐個(gè)挑取單克隆細(xì)胞,抽提基因組DNA后以PCR擴(kuò)增SYNGR2打靶位點(diǎn)附近的基因組序列進(jìn)行測(cè)序檢測(cè),CRISPR打靶位點(diǎn)處含有純合移碼突變的細(xì)胞克隆即為SYNGR2基因敲除(KO)細(xì)胞系。經(jīng)過同樣篩選過程但是目的位點(diǎn)未發(fā)生敲除的細(xì)胞用作野生型(WT)對(duì)照細(xì)胞。SYNGR2基因型鑒定引物見表1 SYNGR2-exon2-F和SYNGR2-exon2-R所示。

表1 本研究用到的引物和寡聚核苷酸序列Table 1 Primer and oligo sequences used in this study

1.3.2 SYNGR2蛋白表達(dá)分析 采用Western blot方法檢測(cè)基因敲除細(xì)胞中SYNGR2蛋白的表達(dá)情況。WT和KO細(xì)胞以RIPA裂解液進(jìn)行裂解,將等量細(xì)胞裂解液上樣進(jìn)行SDS-PAGE分離蛋白。電泳完畢后將蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,并對(duì)蛋白膜進(jìn)行封閉和SYNGR2一抗(Rabbit polyclonal to Synaptogyrin 2,ab106459,Abcam)孵育。此后對(duì)蛋白膜以TBST進(jìn)行洗滌并繼續(xù)孵育HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗,洗滌后進(jìn)行ECL曝光,獲取目的蛋白信號(hào)。

1.3.3 SYNGR2過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞 以PK15細(xì)胞的cDNA作為模版擴(kuò)增SYNGR2編碼區(qū)序列,并連接入pcDNA3.1載體構(gòu)建SYNGR2過表達(dá)載體。轉(zhuǎn)染前將PK15細(xì)胞鋪于24孔板中,待第2天細(xì)胞長滿后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染方法按照Lipofectamine 3000說明書步驟進(jìn)行。

1.3.4 SYNGR2突變體PK15細(xì)胞篩選 PK15細(xì)胞系為SYNGR2 p.63Arg基因型,為了獲取SYNGR2 p.63Cys型PK15,采用CRISPR介導(dǎo)的同源重組方案進(jìn)行目的位點(diǎn)突變操作。作者設(shè)計(jì)了覆蓋突變位點(diǎn)處的200 bp的單鏈DNA作為同源修復(fù)模板,并將模板中的編碼SYNGR2 p.63Arg的核苷酸突變?yōu)門GC(對(duì)應(yīng)氨基酸為Cys)。將單鏈模板和pX330-SYNGR2 gRNA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞,進(jìn)行G418篩選,獲得單克隆細(xì)胞。逐個(gè)挑取單克隆細(xì)胞,抽提基因組DNA后以PCR擴(kuò)增SYNGR2打靶位點(diǎn)附近的基因組序列進(jìn)行測(cè)序檢測(cè),目的位點(diǎn)處含有純合T/T或雜合T/C的細(xì)胞系為陽性突變細(xì)胞系。

1.3.5 PCV2感染PK15細(xì)胞 細(xì)胞以2×105·mL-1密度鋪板后24 h內(nèi),將PCV2儲(chǔ)存液以DMEM進(jìn)行稀釋后,以MOI=1的劑量進(jìn)行細(xì)胞感染。病毒于37 ℃吸附2 h后換DMEM繼續(xù)培養(yǎng),在對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞和上清,凍融2次后釋放病毒,抽提病毒DNA進(jìn)行定量檢測(cè)。病毒增殖情況,通過qPCR結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算病毒拷貝數(shù)或通過2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)病毒量。病毒生長曲線需分別收獲感染后0、12、24、48、72 h各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞及上清樣品,通過qPCR計(jì)算病毒拷貝數(shù)。qPCR所用引物和探針見表1。qPCR體系包括Probe qPCR Mix 10 μL,上下游引物各0.4 μL,探針0.2 μL,病毒DNA模板2 μL,ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,40個(gè)循環(huán)。

1.4 SYNGR2 KO PK15細(xì)胞及野生型細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

1.4.1 原始數(shù)據(jù)過濾及質(zhì)量評(píng)估 對(duì)測(cè)序所得的reads采用Cutadapt去除3′端帶接頭的序列,并去除平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于Q20的reads。利用單堿基質(zhì)量分布圖、堿基含量分布、reads平均質(zhì)量分布來評(píng)估測(cè)序質(zhì)量。

1.4.2 基因組比對(duì)及基因表達(dá)差異分析 利用HISAT2將reads比對(duì)到參考基因組上。將統(tǒng)計(jì)到成功比對(duì)到各基因的read count作為各基因的原始表達(dá)量,采用DESeq對(duì)基因表達(dá)量進(jìn)行差異分析,分析標(biāo)準(zhǔn)為P-value <0.05,log2(Fold Change)>1。

1.4.3 基因表達(dá)模式聚類分析 對(duì)各組樣品中差異表達(dá)基因的表達(dá)量通過取log2(FPKM+1)的方式標(biāo)準(zhǔn)化,再通過計(jì)算Zscore對(duì)不同樣品同一基因表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,將標(biāo)準(zhǔn)化后的基因表達(dá)量代入ORIGIN 2021軟件繪制聚類熱圖。

1.4.4 GO富集分析及KEGG通路分析 使用TopGO進(jìn)行GO富集分析,通過計(jì)算P-value篩選差異基因顯著富集的GO term;對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析,通過計(jì)算FDR值篩選被顯著富集到的通路。

1.5 PK15細(xì)胞中MYRIP、RAB27A、RAB27B等宿主因子mRNA表達(dá)量檢測(cè)

提取細(xì)胞中的總RNA,根據(jù)各樣品中RNA濃度適當(dāng)稀釋后,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒去除樣品中的DNA并將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。將得到的cDNA產(chǎn)物稀釋10倍后作為RT-qPCR模板,利用SYBR法進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增和檢測(cè),根據(jù)2-ΔΔCt方法計(jì)算得到相對(duì)定量結(jié)果。qPCR所用引物和探針見表1。qPCR體系包括SYBR Mix 10 μL,上下游引物各0.4 μL,cDNA模板2 μL,ddH2O 7.2 μL。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性 30 s;95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,40個(gè)循環(huán);熔解曲線反應(yīng)條件為95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min。

1.6 不同品種豬群中SYNGR2等位基因頻率分析

基于29個(gè)豬種全基因組測(cè)序數(shù)據(jù),針對(duì)突變SYNGR2 p.Arg63Cys發(fā)生的SNP位點(diǎn)進(jìn)行序列比對(duì),統(tǒng)計(jì)該SNP位點(diǎn)中各等位基因出現(xiàn)的次數(shù)并計(jì)算相應(yīng)的等位基因頻率。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本研究采用GraphPad Prism 9的Ttest及one-way ANOVA進(jìn)行差異顯著分析,ns表示P>0.05,差異不顯著;*、**、***、****分別表示P<0.05、P<0.01、P<0.001、P<0.000 1,代表差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 不同豬群中SYNGR2等位基因頻率分析

針對(duì)國內(nèi)外不同品種豬的群體遺傳學(xué)分析表明,在杜洛克、大白豬等外來品種豬群中SYNGR2 p.Arg63Cys突變發(fā)生頻率較高,而在國內(nèi)大部分豬群中未檢測(cè)到這一突變(表2),此結(jié)果與之前的研究相符[15]。

表2 不同豬群中SYNGR2的等位基因頻率Table 2 Summary of allele frequencies of SYNGR2 in different pig breeds

2.2 敲除SYNGR2抑制PCV2體外增殖

將構(gòu)建的靶向SYNGR2第2外顯子區(qū)域的CRISPR/Cas9打靶質(zhì)粒電轉(zhuǎn)PK15細(xì)胞,篩選SYNGR2基因敲除的單克隆。以打靶位點(diǎn)處含有雙等位移碼突變的細(xì)胞作為陽性克隆,并通過Western blot檢測(cè)SYNGR2蛋白的表達(dá)情況(圖1A)。SYNGR2基因敲除細(xì)胞標(biāo)記為SYNGR2 KO細(xì)胞,同時(shí)將經(jīng)過同樣篩選的野生型細(xì)胞(WT)用作對(duì)照。PCV2以MOI=1感染KO細(xì)胞和對(duì)照WT細(xì)胞,感染后48 h,凍融細(xì)胞釋放病毒,通過qPCR檢測(cè)病毒拷貝數(shù)。結(jié)果顯示,WT組增殖的病毒量顯著高于SYNGR2 KO組細(xì)胞(圖1B)。

A. 基因敲除PK15細(xì)胞的SYNGR2蛋白表達(dá)分析,紅色星號(hào)表示目的蛋白條帶;B. PCV2感染野生型和SYNGR2基因敲除型PK15細(xì)胞48 h的病毒拷貝數(shù);C、D. PCV2在野生型和SYNGR2基因敲除型PK15細(xì)胞上的生長曲線(C圖為細(xì)胞上清中病毒,D圖為胞內(nèi)病毒)。*. P<0.05;**. P<0.01;***. P<0.001;****. P<0.000 1A. Western blot assay of SYNGR2 expression in gene KO cells, SYNGR2 protein signal is denoted by red asterisk; B. PCV2 viral copies in WT and SYNGR2-KO PK15 cells infected with PCV2 for 48 h; C, D. Growth curves of PCV2 in WT and SYNGR2-KO PK15 cells (Fig.C shows the viral growth level in supernantant of infected cells, and Fig.D shows the viral growth level within cells). *. P<0.05;**. P<0.01; ***. P<0.001; ****. P<0.000 1圖1 PCV2在SYNGR2敲除PK15細(xì)胞上的增殖情況Fig.1 PCV2 proliferation level on SYNGR2 KO PK15

進(jìn)一步對(duì)各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞與上清病毒拷貝數(shù)定量,繪制生長曲線,對(duì)比發(fā)現(xiàn),SYNGR2 KO細(xì)胞中上清及細(xì)胞內(nèi)PCV2病毒量在感染后第48、72小時(shí)低于WT組(圖1C)。以上結(jié)果表明SYNGR2基因敲除可抑制PCV2在PK15上的增殖。

2.3 過表達(dá)SYNGR2補(bǔ)償PCV2在SYNGR2敲除細(xì)胞上的增殖能力

將構(gòu)建好的SYNGR2過表達(dá)質(zhì)粒通過脂質(zhì)體分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SYNGR2敲除細(xì)胞及野生型細(xì)胞,定量PCR結(jié)果檢測(cè)顯示過表達(dá)Arg和Cys型SYNGR2比野生型細(xì)胞的SYNGR2 mRNA水平高30倍左右(圖2A)。SYNGR2敲除細(xì)胞轉(zhuǎn)染后以MOI=1接種PCV2,過表達(dá)SYNGR2補(bǔ)償PCV2在SYNGR2敲除細(xì)胞上的增殖能力(圖2C),證明SYNGR2敲除是PCV2增殖受阻的影響因素。野生型細(xì)胞過表達(dá)SYNGR2后以MOI=1接種PCV2,對(duì)比未處理的野生型細(xì)胞,感染PCV2 48 h后,PCV2病毒含量無顯著差異(圖2B)。以上結(jié)果證實(shí)SYNGR2敲除抑制PCV2體外增殖,在敲除細(xì)胞上進(jìn)一步補(bǔ)償SYNGR2可以增加PCV2的復(fù)制能力。但是在野生型細(xì)胞過表達(dá)SYNGR2無法顯著促進(jìn)PCV2體外增殖,原因可能是SYNGR2在細(xì)胞正常生理狀態(tài)下高表達(dá),因此過表達(dá)后表型差異不顯著。

A. SYNGR2過表達(dá)后的SYNGR2 mRNA水平分析;B. 野生型PK15過表達(dá)Arg和Cys型SYNGR2后對(duì)PCV2復(fù)制水平的影響;C. SYNGR2敲除的PK15細(xì)胞過表達(dá)Arg和Cys型SYNGR2后對(duì)PCV2復(fù)制水平的影響。**. P <0.01;***. P <0.001;****. P <0.000 1A. Determination of SYNGR2 mRNA levels after overexpression of SYNGR2 in PK15 cells; B. PCV2 viral copies in WT PK15 transfected with SYNGR2-Arg and SYNGR2-Cys expressing plasmids and infected with PCV2 for 48 h; C. PCV2 viral copies in SYNGR2-KO PK15 transfected with SYNGR2-Arg and SYNGR2-Cys expressing plasmids and infected with PCV2 for 48 h. **. P <0.01; ***. P <0.001; ****. P <0.000 1圖2 SYNGR2敲除細(xì)胞及野生型細(xì)胞過表達(dá)不同基因型SYNGR2后PCV2的增殖情況Fig.2 PCV2 proliferation on WT PK15 or SYNGR2 KO PK15 over-expressing SYNGR2 with different genotypes

2.4 SYNGR2 p.Arg63Cys點(diǎn)突變降低PCV2體外增殖能力

PK15細(xì)胞的SYNGR2為Arg基因型,為了檢測(cè)Arg和Cys兩種基因型對(duì)PCV2復(fù)制能力的影響,作者對(duì)PK15細(xì)胞進(jìn)行點(diǎn)突變,獲得SYNGR2-Cys型的PK15細(xì)胞。PCV2感染SYNGR2野生型(SYNGR2-Arg)及構(gòu)建好的突變PK15細(xì)胞(SYNGR2-Cys)。與野生型細(xì)胞相比,感染48 h后突變PK15細(xì)胞上的病毒含量顯著降低(P<0.01)(圖3A)。細(xì)胞及上清內(nèi)的PCV2生長曲線趨勢(shì)也表明SYNGR2-Cys型細(xì)胞中PCV2增殖較SYNGR2-Arg型細(xì)胞差(圖3B)。以上結(jié)果說明SYNGR2 p.Arg63Cys突變后可提高PK15細(xì)胞對(duì)PCV2的抗性。

A. PCV2感染野生型和SYNGR2 p.Arg63Cys突變型PK15細(xì)胞48 h的病毒拷貝數(shù);B、C. PCV2在野生型和SYNGR2 p.Arg63Cys突變型PK15細(xì)胞上的生長曲線(B圖為細(xì)胞上清中病毒,C圖為胞內(nèi)病毒)。**. P <0.01;***. P <0.001A. PCV2 viral copies in WT and SYNGR2 p.Arg63Cys mutant PK15 cells infected with PCV2 for 48 h; B,C. Growth curves of PCV2 in WT and SYNGR2 p.Arg63Cys mutant PK15 cells (Fig.B shows the viral growth level in supernantant of infected cells and shows the viral growth level within cells). **. P <0.01; ***. P <0.001圖3 PCV2在SYNGR2 p.Arg63Cys點(diǎn)突變PK15細(xì)胞上的增殖情況Fig.3 PCV2 replication level in PK15 with SYNGR2 p.Arg63Cys mutation

2.5 SYNGR2基因敲除細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組分析

為了探究SYNGR2在PCV2感染中的功能,對(duì)SYNGR2敲除細(xì)胞及野生型細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組水平高通量測(cè)序。每組分別檢測(cè)3株KO或WT型細(xì)胞,平均每個(gè)樣品測(cè)得reads數(shù)約為440 000,其中絕大部分reads被正確識(shí)別(>99.9%),說明測(cè)序質(zhì)量良好。對(duì)RNAseq數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控篩選后,將篩選后數(shù)據(jù)以NCBI的Sscrofa11.1為參考基因組進(jìn)行比對(duì),平均94%左右的clean reads被成功匹配到特定基因。以P-value<0.05,log2(Fold Change)>1為表達(dá)量差異顯著條件篩選匹配到的基因。結(jié)果顯示,SYNGR2敲除后,共有176個(gè)基因表達(dá)量顯著上調(diào),85個(gè)基因表達(dá)量顯著下調(diào)(圖4A、B)。

A. 火山圖展示SYNGR2野生型和敲除型PK15細(xì)胞差異表達(dá)基因的分布;B. SYNGR2野生型和敲除型PK15細(xì)胞上上調(diào)和下調(diào)差異表達(dá)基因數(shù)A. Volcano plot showing distribution of differentially expressed genes between WT and KO cells; B. The numbers of differentially expressed genes with up-regulation and down-regulation between WT and KO cells圖4 SYNGR2基因敲除與野生型PK15細(xì)胞的差異表達(dá)基因分析Fig.4 Differentially expressed gene analysis between SYNGR2-KO and WT PK15 cells

對(duì)所有差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析,篩選富集到SYNGR2的通路,統(tǒng)計(jì)這些通路中包含的差異表達(dá)基因(DEG)并進(jìn)一步分析。篩選共得到196個(gè)與SYNGR2功能相關(guān)的差異表達(dá)基因,包括細(xì)胞免疫相關(guān)的防御素β1(defensin beta 1,DEFB1)、參與組成胞吐囊泡的MYRIP及抗原呈遞相關(guān)的豬白細(xì)胞抗原Ⅱ型(swine leukocyte antigen-Ⅱ,SLAⅡ)基因等。196個(gè)SYNGR2功能相關(guān)差異表達(dá)基因在兩組細(xì)胞中的差異情況如圖5所示。其中最顯著上調(diào)和下調(diào)的10個(gè)基因信息見表3所示。進(jìn)一步的GO富集分析結(jié)果顯示,差異表達(dá)基因與膜成分、囊泡組成及被膜細(xì)胞器組成等密切相關(guān)(圖6A、B),揭示SYNGR2在細(xì)胞中的主要功能為參與組成膜成分組成及相關(guān)囊泡運(yùn)輸。

圖5 SYNGR2功能相關(guān)差異表達(dá)基因聚類熱圖Fig.5 Clustering heat map of SYNGR2-related differentially expressed genes

A. SYNGR2功能相關(guān)差異表達(dá)基因GO分析條形圖;B. SYNGR2功能相關(guān)差異表達(dá)基因GO分析餅圖A. Bar plot for GO analysis of SYNGR2 associated DEGs; B. Pie chart for GO analysis of SYNGR2 associated DEGs圖6 SYNGR2功能相關(guān)差異表達(dá)基因GO富集分析Fig.6 GO enrichment analysis of differentially expressed genes functionally related to SYNGR2

表3 前10名顯著上調(diào)差異表達(dá)基因及前10名顯著下調(diào)差異表達(dá)基因Table 3 The top 10 DEGs for upregulation and downregulation between SYNGR2 KO and WT cells

2.6 SYNGR2基因敲除影響囊泡相關(guān)蛋白R(shí)AB27A的轉(zhuǎn)錄

作者對(duì)富集到囊泡相關(guān)功能的宿主因子MYRIP進(jìn)一步研究。由于MYRIP在PK15細(xì)胞中表達(dá)豐度過低,無法通過qPCR檢測(cè)其mRNA表達(dá)量。MYRIP是RAB27特異的結(jié)合蛋白,通過qPCR檢測(cè)兩種細(xì)胞中RAB27A、RAB27B的mRNA表達(dá)量,結(jié)果顯示,RAB27A在SYNGR2敲除后,mRNA表達(dá)量提升約1.4倍(圖7)。

****. P<0.0001圖7 SYNGR2基因敲除細(xì)胞及野生型細(xì)胞中RAB27A mRNA的表達(dá)差異Fig.7 Differential expression levels of RAB27A mRNA between SYNGR2-KO and WT PK15

為了探究RAB27A與PCV2感染之間的關(guān)系,作者比較了PCV2感染及未感染情況下細(xì)胞中RAB27A表達(dá)量,結(jié)果顯示PCV2感染對(duì)細(xì)胞內(nèi)RAB27A mRNA表達(dá)量沒有顯著影響。對(duì)PCV2感染及未感染細(xì)胞中的SYNGR2 mRNA表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè),二者差異也不顯著(結(jié)果未展示)。

3 討 論

SYNGR2是四跨膜蛋白超家族(tetraspanins,tspans)成員,tspan蛋白可通過在細(xì)胞膜上聚集形成tspan富集的微結(jié)構(gòu)域(tspan-enriched microdomains,TEM),召集受體等功能蛋白至TEM后,tspan通過結(jié)合不同功能蛋白,可參與病毒感染吸附[16]、內(nèi)化[17]、胞內(nèi)運(yùn)輸[18]、病毒復(fù)制[19]、胞間運(yùn)輸?shù)雀腥倦A段[20]。SYNGR2可通過與病毒蛋白及其他宿主因子結(jié)合參與病毒感染[13],但SYNGR2的具體功能及作用機(jī)制仍未知。已有研究報(bào)道SYNGR2與PCV2引起的病毒血癥相關(guān),且SYNGR2點(diǎn)突變導(dǎo)致了可抑制體內(nèi)PCV2病毒載量增加的抗性突變體產(chǎn)生[15]。由于SYNGR2參與組成的微囊泡在多種細(xì)胞類型中普遍存在[21],結(jié)合上述研究,推測(cè)SYNGR2可能通過形成包裹病毒蛋白的病毒囊泡來協(xié)助PCV2等病毒感染。

本研究首先通過對(duì)PK15細(xì)胞中SYNGR2進(jìn)行敲除、回補(bǔ)、定點(diǎn)突變驗(yàn)證了SYNGR2對(duì)PCV2體外增殖的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明,敲除SYNGR2后攻毒,感染后48 h病毒拷貝數(shù)顯著低于相同處理的野生型細(xì)胞,感染后0～72 h內(nèi)生長曲線反映了相同趨勢(shì);對(duì)敲除SYNGR2的細(xì)胞過表達(dá)SYNGR2回補(bǔ)后發(fā)現(xiàn),病毒拷貝數(shù)顯著提高,證實(shí)SYNGR2是PCV2拷貝數(shù)變化的因素之一。對(duì)Arg/Cys定點(diǎn)突變型細(xì)胞進(jìn)行PCV2感染,感染后48 h病毒拷貝數(shù)顯示Cys型細(xì)胞抗性較Arg型細(xì)胞強(qiáng)。以上結(jié)果說明SYNGR2可促進(jìn)PCV2體外增殖,并且突變SYNGR2 p.Arg63Cys發(fā)生位點(diǎn)是在SYNGR2參與PCV2感染過程中發(fā)揮主要作用的關(guān)鍵SNP位點(diǎn)。

本研究通過分析SYNGR2 KO細(xì)胞及WT型細(xì)胞的RNA-seq數(shù)據(jù),根據(jù)富集分析結(jié)果進(jìn)一步篩選與SYNGR2相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)研究發(fā)現(xiàn),SYNGR2主要參與膜成分、囊泡等被膜細(xì)胞器組成,由差異表達(dá)基因MYRIP調(diào)節(jié)的外泌體分泌相關(guān)基因RAB27A[22]mRNA表達(dá)量在SYNGR2敲除或PCV2感染條件下顯著提高。研究報(bào)道,在SYNGR2敲除或者發(fā)生SYNGR2 p.63Cys點(diǎn)突變后,細(xì)胞內(nèi)外PCV2拷貝數(shù)之比明顯減小,研究者猜測(cè)這是由于PCV2內(nèi)化或者胞內(nèi)運(yùn)輸受阻導(dǎo)致。由于PCV2感染的PK15細(xì)胞可分泌包含PCV2的外泌體[23],結(jié)合RAB27A參與組成的外泌體可協(xié)助塞內(nèi)卡病毒(Seneca Valley virus, SVV)[24]、PRRSV[25]、甲肝病毒(hepatitis A virus,HAV)和丙肝病毒(hepatitis C virus,HCV)[26]內(nèi)化及免疫逃逸,作者推測(cè)RAB27A和SYNGR2可以通過組成囊泡參與PCV2運(yùn)輸協(xié)助其體外感染PK15,這也可以解釋為何SYNGR2敲除后,PCV2內(nèi)化、胞內(nèi)運(yùn)輸受阻,但仍有部分病毒可以正常增殖[27]。RAB27A在單純皰疹病毒1型(herpes simplex virus 1,HSV-1)感染過程中與病毒蛋白共定位于囊泡,且RAB27A敲降可顯著抑制HSV-1感染,但qPCR及免疫熒光均未檢測(cè)到感染期間RAB27A表達(dá)量變化[28]。本研究同樣未能檢測(cè)到PCV2感染對(duì)SYNGR2及RAB27A表達(dá)的影響,其潛在機(jī)制可能與PCV2與宿主因子的互作模式相關(guān),病毒蛋白可誘導(dǎo)宿主因子轉(zhuǎn)移至病毒囊泡內(nèi),從而挾持宿主因子參與自身感染,但此過程不一定涉及宿主因子表達(dá)水平的改變,SYNGR2及RAB27A參與PCV2感染的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

SYNGR2是支持PCV2在PK15細(xì)胞增殖的關(guān)鍵宿主因子,缺失SYNGR2顯著影響PCV2的體外增殖。通過對(duì)SYNGR2 敲除細(xì)胞及野生型細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及差異表達(dá)基因分析、富集分析,本研究揭示了SYGNR2及RAB27A在PCV2感染過程中潛在的功能。