李倩倩,林 馨,韋依琳,崔昊宇,鄒榮華,吳曉妮,葛家振,黃國梁,張麗娟,鄭福英,藺國珍*

(1.西北民族大學生命科學與工程學院,蘭州 730030;2.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所動物疫病防控全國重點實驗室,蘭州 730046)

鴨疫里默氏桿菌是一種革蘭陰性菌,屬于黃桿菌科,里默氏菌屬,可導致鴨的漿膜炎,嚴重危害養(yǎng)鴨業(yè)生產(chǎn),可造成重大經(jīng)濟損失[1]。該菌血清型眾多,目前國際公認有21個血清型,各血清型之間缺乏交叉保護,給疫苗的有效預防帶來了困難[2]。基于此,在實際生產(chǎn)中添加抗生素仍然是目前預防和治療鴨疫里默氏桿菌感染的重要手段。伴隨著抗生素的廣泛應用,耐藥菌株不斷出現(xiàn)并播散,進一步增加了對鴨疫里默氏桿菌的防控難度[3]。為提高抗生素的應用效果,并對實際生產(chǎn)給予指導,需對鴨疫里默氏桿菌的耐藥機制開展研究。

外排泵介導的主動外排是細菌產(chǎn)生耐藥的重要機制。目前已報道了5種外排泵系統(tǒng),分別是耐藥結(jié)節(jié)細胞分裂超家族(resistance nodulation cell division family,RND)、主要易化子超家族 (major facilitator superfamily,MFS)、小多重耐藥家族 (small multidrug resistance family,SMR)、多藥和毒性化合物外排家族 (multidrug and toxic compound extrusion family,MTE)和ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族 (ATP binding cassette family)[4-5]。RND在革蘭陰性菌中廣泛存在,并且是發(fā)揮重要生物學功能的外排泵,由內(nèi)膜蛋白(inner membrane protein,IMP)、外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)和周質(zhì)膜融合蛋白(membrane fusion protein,MFP)構(gòu)成三重外排復合體,有些含有調(diào)控子[6]。前期研究在鴨疫里默氏桿菌中鑒定了3個RND外排泵,包括RaeC-RaeA-RaeB(外排氨基糖苷類抗生素和去污劑)、RaeE-RaeF-RopN(外排氨基糖苷類抗生素和去污劑)和RaeX-RaeY-RopM(外排重金屬離子)[7-9]。根據(jù)基因組注釋,RaeC-RaeA-RaeB包含一個自身調(diào)控子RaeR,組合成RaeR-RaeC-RaeA-RaeB,對應于RA-LZ01基因組中的GE296_RS05175-GE296_RS05170-GE296_RS05165-GE296_RS05160。RaeR由GE296_RS05175基因編碼,讀碼框大小為615 bp,編碼204個氨基酸,蛋白大小約為22.44 ku。內(nèi)膜蛋白RaeB由GE296_RS05160基因編碼。

調(diào)控子可對RND外排泵的表達水平和功能發(fā)揮重要作用,目前對于RaeR對RaeC-RaeA-RaeB的調(diào)控作用還未見報道。本研究通過構(gòu)建RaeR和RaeB的缺失株及回復株,并對親本株RA-LZ01、缺失株和回復株進行藥敏試驗,測定菌株的生長速率,研究RaeR對RaeC-RaeA-RaeB的調(diào)控作用,進一步理解該外排泵的生物學功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 鴨疫里默氏桿菌RA-LZ01(GenBank登錄號:NZ_CP045564.1)和LJW-2菌株由中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所草食動物細菌病創(chuàng)新團隊惠贈;大腸埃希菌ATCC25922購自美國菌種保藏中心(American type culture collection);大腸埃希菌X7213和自殺質(zhì)粒pRE112購自NTCC國家典型培養(yǎng)物保藏中心;穿梭質(zhì)粒pCPRA由中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所草食動物細菌病創(chuàng)新團隊構(gòu)建;Trans-1感受態(tài)細胞購自北京全式金公司。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑 胰蛋白酶大豆肉湯(TSB)、胰蛋白酶大豆瓊脂(TSA)購自美國 BD difcoTM公司;LB肉湯、瓊脂粉和抗生素購自北京Solarbio公司;2,6-二氨基更二酸(DPA)購自東京化成工業(yè)株式會社;限制性內(nèi)切酶SacI、SphI、PstI,T4連接酶,質(zhì)粒提取試劑盒以及膠回收試劑盒均購自TaKaRa 公司;細菌RNA提取試劑盒購自北京天根公司;0.22 μm無菌硝酸纖維素膜和過濾器購自美國 Millipore 公司;SYBR qPCR Master Mix和HiScriptΙΙ Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)購自南京Vazyme生物科技有限公司。

1.1.3 主要設備 臺式高速離心機購自Beckman公司;PCR熱循環(huán)儀購自杭州博日科技公司;紫外分光光度計購自美國 Backman 公司;酶標儀購自美國Bio-Rad公司;CO2恒溫培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司;搖床購自上海蘇坤實業(yè)有限公司;凝膠成像儀購自美國Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 引物 本研究中所用的引物、序列、退火溫度及擴增的目的DNA片段見表1,引物由西安擎科生物有限公司合成。

1.2.2 構(gòu)建GE296_RS05160和GE296_RS05175基因缺失株ΔRaeB和ΔRaeR 首先由武漢金開瑞生物工程有限公司合成用于GE296_RS05160(編碼RaeB蛋白)和GE296_RS05175(編碼RaeR蛋白)基因缺失的打靶片段。GE296_RS05160基因的打靶片段包含上游同源臂600 bp,ermF基因讀碼框801 bp,下游同源臂600 bp。GE296_RS05175基因的打靶片段包含上游同源臂600 bp,ermF基因讀碼框801 bp,下游同源臂586 bp。打靶片段上、下游同源臂兩端分別加上SacI和SphI酶切位點。用SacΙ和SphΙ酶將打靶片段克隆進自殺質(zhì)粒pRE112,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進大腸埃希菌X7213細胞中。參照文獻[8-9]的方法,利用氯霉素抗性篩選供體菌,利用紅霉素和多黏菌素B抗性篩選缺失株。缺失株構(gòu)建具體流程詳見圖1。用引物OmpA-F/OmpA-R、Erm-F/Erm-R和5160-F/5160-R對缺失株ΔRaeB進行PCR鑒定;用引物OmpA-F/OmpA-R、Erm-F/Erm-R和5175-F/5175-R對缺失株ΔRaeR進行PCR鑒定。

圖1 缺失株構(gòu)建示意圖Fig.1 Schematic representation of the deletion strain constructs

1.2.3 構(gòu)建回復株cΔRaeB和cΔRaeR 以親本株RA-LZ01株的基因組為模板,以引物5160-F/5160-R和5175-F/5175-R分別擴增GE296_RS05160和GE296_RS05175基因,用PstΙ和SphΙ內(nèi)切酶將目的DNA片段分別克隆進穿梭質(zhì)粒pCPRA,得到回復重組質(zhì)粒,并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進X7213菌株。參照文獻[8-9]的方法,用氨芐青霉素抗性篩選供體菌,用頭孢西丁抗性篩選回復株,并用引物OmpA-F/OmpA-R和5160-F/5160-R,以及OmpA-F/OmpA-R和5175-F/5175-R引物對分別對回復株進行PCR鑒定,得到的回復株分別命名為cΔRaeB和cΔRaeR。

1.2.4 測定菌株的生長曲線 將親本株RA-LZ01和缺失株ΔRaeB、ΔRaeR分別增菌至OD600 nm約為1.0,以10倍系列稀釋至10-9,取10-7、10-8和10-9三個濃度梯度的菌液涂布TSA平板,每個樣本做3個重復,計算每個菌株的菌落形成單位(CFU)。取108CFU·mL-1的菌種,接種至10 mL TSB中,將培養(yǎng)物以37 ℃、200 r·min-1培養(yǎng),每隔1 h取130 μL菌液用紫外分光光度計測量其OD600 nm值,共測定12 h。每個菌株做3組平行試驗[9],利用GraphPad Prism 6.0軟件中的One-way ANOVA對每一個時間點的OD600 nm值進行統(tǒng)計學分析。

1.2.5 測定菌株MIC 參照文獻[10],將菌株增菌至OD600 nm約為1.0,通過微量肉湯稀釋法測定菌株對抗生素的最小抑菌濃度(MIC),大腸埃希菌ATCC25922作為質(zhì)控菌株?？股氐臐舛确秶鸀? 024～0.062 5 mg·L-1,同時設置陰性對照(培養(yǎng)基)和陽性對照(菌液)。96孔板中每孔加入100 μL稀釋好的菌液(含有106CFU)。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h,在酶標儀中測量其OD600 nm值,確定抗生素抑制菌株生長的MIC。試驗重復3次。

1.2.6 點板試驗 依據(jù)菌株的MIC,選出抗生素,并確定其濃度。參照文獻[9],將經(jīng)121 ℃、20 min高壓的TSA培養(yǎng)基冷卻至40 ℃左右,加入選定的合適濃度的抗菌素,制備TSA平板。將新鮮菌液以1∶100比例重新轉(zhuǎn)接后,增菌至OD600 nm約 1.0,稀釋至10 CFU·mL-1,取106～10 CFU·mL-1的菌液,每個菌液樣本取5 μL進行點板,將培養(yǎng)板在含5% CO2,37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h,觀察細菌生長狀況。

1.2.7 實時定量RT-PCR 對親本株RA-LZ01和缺失株ΔRaeB、ΔRaeR培養(yǎng)至OD600 nm約為1.0,培養(yǎng)過程中一份RA-LZ01菌液不添加SDS,另外一份RA-LZ01和缺失株ΔRaeB、ΔRaeR菌液添加4 mg·L-1的SDS。提取RA-LZ01和ΔRaeR的總RNA, 用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,作為模板備用。實時定量RT-PCR 反應體系為20 μL,反應條件:95 ℃ 30 s 預變性,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,40次循環(huán)。以特異性引物GAPDH-F/GADPH-R、q5160-F/q5160-R和q5175-F/q5175-R分別擴增GAPDH、GE296_RS05160和GE296_RS05175基因的靶標片段,其中GADPH基因作為內(nèi)參。通過2-△△Ct方法計算相對基因表達量,并利用GraphPad Prism 6.0軟件中的One-way ANOVA進行差異性分析。*P<0.05表示差異顯著;**P<0.01、***P<0.001、****P<0.000 1,表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 基因缺失株ΔRaeB和ΔRaeR的構(gòu)建

以菌液為模板,經(jīng)PCR鑒定,引物OmpA-F/OmpA-R擴增出1 119 bp大小的目的條帶;引物Erm-F/Erm-R擴增出801 bp大小的ermF基因,引物5160-UF/5160-DR擴增到2 038 bp大小的DNA片段,經(jīng)測序確認為打靶片段;引物5160-F/5160-R未擴增到目的片段(圖2A)。以上結(jié)果說明菌株為鴨疫里默氏桿菌,并且ermF基因替換了GE296_RS05160基因,缺失株ΔRaeB構(gòu)建成功。對缺失株ΔRaeR的PCR鑒定結(jié)果顯示,引物OmpA-F/OmpA-R和Erm-F/Erm-R均擴增到合適大小的目的條帶,5175-UF/5175-DR擴增到2 026 bp大小的DNA片段,經(jīng)測序確認為打靶片段;5175-F/5175-R未擴增出目的片段(圖2B),說明ermF基因成功替換了GE296_RS05175基因,ΔRaeR菌株構(gòu)建成功。

A. 缺失株ΔRaeB的鑒定;B. 缺失株ΔRaeR的鑒定;M. DL2000 DNA Marker;1. OmpA-F/OmpA-R引物擴增(1 119 bp);2. Erm-F/Erm-R引物擴增(801 bp);3. 5160-UF/5160-DR(A,2 038 bp)和5175-UF/5175-DR(B,2 026 bp)引物擴增;4. 5160-F/5160-R(A,3 156 bp)和5175-F/5175-R(B,615 bp)引物擴增A. Identification of the deletion mutant ΔRaeB; B. Identification of the deletion mutant ΔRaeR; M. DL2000 relative molecular mass standard; 1. PCR amplification with OmpA-F/OmpA-R primers (1 119 bp); 2. PCR amplification with ErmF/ErmF primers (801 bp); 3. PCR amplification with 5160-UF/5160-DR primers (A, 2 038 bp) and 5175-UF/5175-DR primers (B, 2 026 bp); 4. PCR amplification with 5160-F/5160-R primers (A, 3 156 bp) and 5 175-F/5175-R primers (B, 615 bp) 圖2 缺失株ΔRaeB和ΔRaeR的鑒定Fig.2 Identification of the deletion mutants ΔRaeB and ΔRaeR

2.2 回復株cΔRaeB和cΔRaeR的構(gòu)建

以菌液為模板,用引物OmpA-F/OmpA-R和5160-F/5160-R分別擴增出1 119 bp和3 156 bp的目的片段(圖3A),說明回復株 cΔRaeB構(gòu)建成功。以引物OmpA-F/OmpA-R和5175-F/5175-R分別擴增出1 119 bp和615 bp的目的片段,說明回復株cΔRaeR構(gòu)建成功(圖3B)。

A. 回復株cΔRaeB的鑒定;B. 回復株cΔRaeR的鑒定;M. DL2000 DNA Marker;1. OmpA-F/OmpA-R引物擴增(1 119 bp);2. 5160-F/5160-R(A,3 156 bp)和5175-F/5175-R(B,615 bp)引物擴增A. Identification of the complemented strain cΔRaeB; B. Identification of the complemented strain cΔRaeR; M. DL2000 relative molecular mass standard; 1. PCR amplification with OmpA-F/OmpA-R primers (1 119 bp); 2. PCR amplification with 5160-F/5160-R primers (A, 3 156 bp) and 5175-F/5175-R primers (B, 615 bp) 圖3 回復株cΔRaeB和cΔRaeR的鑒定Fig.3 Identification of the complemented strains cΔRaeB and cΔRaeR

2.3 菌株的生長速率

為確定GE296_RS05160和GE296_RS05175基因的缺失是否影響菌株的生長速率,測定了親本株RA-LZ01和缺失株ΔRaeB和ΔRaeR在12 h的OD600 nm值,每次測定間隔1 h。依據(jù)測定的OD600 nm值繪制了菌株的生長曲線。結(jié)果表明,與親本株RA-LZ01相比,缺失株ΔRaeB和ΔRaeR的生長速率沒有發(fā)生明顯變化,每個時間點的OD600 nm值均無統(tǒng)計學差異,說明GE296_RS05160和GE296_RS05175基因?qū)甑纳L無顯著影響(圖4)。

圖4 親本株RA-LZ01和缺失株ΔRaeB、ΔRaeR的生長曲線Fig.4 Growth curves of parental strain RA-LZ01, deletion mutants ΔRaeB and ΔRaeR

2.4 MIC測定

測定了11類、27種抗菌素對親本株RA-LZ01、缺失株ΔRaeB和ΔRaeR、回復株cΔRaeB和cΔRaeR的MIC值。結(jié)果表明,GE296_RS05160基因滅活后,僅氨基糖苷類的鏈霉素和卡那霉素以及去污劑類的SDS的MIC發(fā)生了改變,分別降低至1/2、1/2和1/8,并且回復株恢復到了和親本株相同的水平;而GE296_RS05175基因缺失后,菌株對鏈霉素、卡那霉素的MIC值無變化,而對SDS的MIC值增加了2倍。其他抗菌藥物的MIC值均無變化。具體結(jié)果如表2所示。

表2 抗菌藥物對鴨疫里默氏桿菌親本株、缺失株及回復株的MICsTable 2 MICs of antimicrobial agents to R. anatipestifer wild strain, deletion mutants and complemented strains mg·L-1

2.5 點板試驗

MIC試驗結(jié)果顯示,只有鏈霉素、卡那霉素和SDS對缺失株ΔRaeB和ΔRaeR的MIC發(fā)生改變,并且鏈霉素、卡那霉素只降至親本株的1/2,而SDS降至親本株的1/8。因此,選擇差異較大的SDS進行點板試驗,進一步驗證GE296_RS05160基因在外排SDS中的作用及GE296_RS05175基因?qū)υ撏馀疟玫恼{(diào)控作用。結(jié)果顯示,在8 mg·L-1的SDS濃度下,與親本株RA-LZ01株相比,缺失株ΔRaeB對SDS的敏感性顯著升高,而缺失株ΔRaeR對SDS的敏感性有所降低,回復株cΔRaeB和cΔRaeR基本恢復了對SDS的耐受水平(圖5)。

圖5 菌株對SDS的敏感性Fig.5 Sensitivity of the strains to SDS

2.6 實時定量RT-PCR

對實時定量RT-PCR的結(jié)果進行分析后,以親本株GE296_RS05160基因相對轉(zhuǎn)錄水平為1,發(fā)現(xiàn)在添加4 mg·L-1的SDS后,親本株GE296_RS05160基因的相對轉(zhuǎn)錄水平升高至2.26,而ΔRaeR的GE296_RS05160基因的相對轉(zhuǎn)錄水平升高至4.64(圖6)。與此結(jié)果相反,親本株和ΔRaeB的GE296_RS05175基因的相對轉(zhuǎn)錄水平分別下降至0.36和0.35(圖6)。

A. RA-LZ01和ΔRaeR菌株在SDS作用下GE296_RS05160基因的相對轉(zhuǎn)錄水平;B. RA-LZ01和ΔRaeB菌株在SDS作用下GE296_RS05175基因的相對轉(zhuǎn)錄水平;****P<0.000 1,差異極顯著A. The relative transcriptional levels of GE296_RS05160 gene of RA-LZ01 and ΔRaeR strains treated with SDS; B. The relative transcriptional levels of GE296_RS05175 gene of RA-LZ01 and ΔRaeB strains treated with SDS;****P<0.000 1,the differences are highly significant圖6 GE296_RS05160和GE296_RS05175基因的相對轉(zhuǎn)錄水平Fig.6 The relative transcriptional levels of GE296_RS05160 and GE296_RS05175 genes

3 討 論

RND是一種在革蘭陰性菌中廣泛存在的外排泵,目前的研究已在多種細菌中鑒定到RND外排泵,研究的比較清晰、深入的包括大腸埃希菌、沙門菌和銅綠假單胞菌的RND外排泵,包括大腸埃希菌的AcrB、AcrD、AcrF、CusA等[11-14];沙門菌的AcrB、AcrD、AcrF等[15-17];銅綠假單胞菌的MexB、MexD、MexF、MexY等[18-21]。外排底物是RND外排泵的重要生物學功能,并且這些外排泵有非常廣泛的底物譜,包括多種抗菌素、重金屬離子、膽汁、腸桿菌素、游離脂肪酸、激素等。除了外排底物,RND外排泵還可發(fā)揮其他多種生物學功能,包括維持細胞分裂和生長、毒力、新陳代謝、生物膜形成等[11-21]。

鑒于RND外排泵的多種重要的生物學功能,其表達水平受到多種調(diào)控子的嚴格調(diào)控。如大腸埃希菌的經(jīng)典RND外排泵AcrAB-tolC,受到AcrR、MarA、MarB、MarC、SdiA等調(diào)控子的正向或負向調(diào)控[22];AcrD受到BaeSR和CpxAR雙組分系統(tǒng)的調(diào)控[23];AcrS和H-NS分別對AcrEF進行負調(diào)控以及正調(diào)控[24]。對于沙門菌的RND外排泵,RamA、RamR、AcrR、MarA以及SoxS等調(diào)控子對AcrAB發(fā)揮調(diào)控作用[22];雙組分系統(tǒng)BaeSR和CpxAR調(diào)控AcrD的表達[23];AcrEF受到雙組分系統(tǒng)AcrS和H-NS的調(diào)控[25-26]。銅綠假單胞菌含有多個RND外排泵,鑒定到MexR、NalC、NalD、RocS1/S2-A2等二十多個調(diào)控因子和雙組分系統(tǒng)[6]。

目前對于鴨疫里默氏桿菌的RND外排泵研究的較少,只鑒定到3個RND外排泵系統(tǒng),包括外排氨基糖苷類抗生素和去污劑的RaeC-RaeA-RaeB和RaeE-RaeF-RopN,外排重金屬離子的RaeX-RaeY-RopM,其中內(nèi)膜蛋白為RaeB、RaeF和RaeY,周質(zhì)膜融合蛋白為RaeA、RaeE和RaeX,外膜蛋白為RaeC、RopN和RopM[7-9]。目前研究僅初步鑒定了上述外排泵的外排底物、與菌株生長和毒力相關(guān)的生物學表型,對于調(diào)控其表達水平的調(diào)控子還未見報道。根據(jù)基因組注釋,RaeC-RaeA-RaeB有一個屬于TetR/AcrR家族的調(diào)控子RaeR,本研究對該調(diào)控子是否對RaeB發(fā)揮調(diào)控作用進行了驗證。

首先對菌株的生長能力進行了檢測。親本株、缺失株ΔRaeB和ΔRaeR在12 h內(nèi)的生長曲線無明顯差異,說明RaeC-RaeA-RaeB外排泵與菌株的生長能力無明顯相關(guān)性,也保證了缺失株ΔRaeB和ΔRaeR其他生物學表型的改變不是由生長速率改變而引起。

前期研究表明,以RA CH-1作為親本株,RaeC-RaeA-RaeB可以外排氨基糖苷類的慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素,去污劑SDS和Triton X-100。本研究以RA-LZ01作為親本株,缺失株ΔRaeB僅對鏈霉素、卡那霉素和SDS的敏感性上升,并且鏈霉素和卡那霉素的MIC值只減小至1/2,SDS的MIC值減小至1/8。這種差異應該是由于親本株不同引起的,不同的菌株有不同的耐藥表型。缺失株ΔRaeR與ΔRaeB相反,表現(xiàn)為對鏈霉素、卡那霉素和SDS的敏感性降低。點板試驗進一步驗證了這種表型改變。這些結(jié)果說明RaeR對RaeB外排底物有負向調(diào)控作用。

對親本株和缺失株ΔRaeR的GE296_RS05160基因的相對轉(zhuǎn)錄水平進行了檢測。在添加SDS后,親本株GE296_RS05160基因的相對轉(zhuǎn)錄水平升高,而ΔRaeR的GE296_RS05160基因的相對轉(zhuǎn)錄水平顯著上升。進一步對親本株和ΔRaeB的GE296_RS05175基因的相對轉(zhuǎn)錄水平進行檢測,當受到SDS刺激時,親本株和缺失株ΔRaeB中該基因的轉(zhuǎn)錄水平均明顯下降。這些結(jié)果表明,底物SDS促使GE296_RS05175基因的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào),GE296_RS05175基因?qū)E296_RS05160基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮負向調(diào)控作用。

4 結(jié) 論

GE296_RS05160基因編碼的RaeB和GE296_RS05175基因編碼的RaeR與鴨疫里默氏桿菌RA-LZ01株的生長無明顯相關(guān)性;與菌株對鏈霉素、卡那霉素和SDS的耐受性相關(guān)。藥物敏感性試驗和實時定量PCR試驗結(jié)果表明,RaeR對RaeB的表達發(fā)揮負向調(diào)控作用。