張兆博,侯黎明,李平華,杜陶然,王中宇,吳承武,黃瑞華*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學養(yǎng)豬研究所,南京 210095;2.南京農(nóng)業(yè)大學淮安研究院,淮安 223001)

我國豬肉消費需求已從“量穩(wěn)”進入“質(zhì)升”階段,如何改善豬肉品質(zhì)已成為畜牧業(yè)生產(chǎn)的新目標。以往有較多研究發(fā)現(xiàn)日糧纖維可以影響豬肉品質(zhì),但因日糧纖維代謝過程復(fù)雜,對機體的調(diào)控形式也可能存在直接或間接的作用途徑,導(dǎo)致其作用機理研究一直不清。日糧纖維是指飼料中不能被動物分泌的消化酶直接消化的細胞壁成分,主要包括纖維素、半纖維素、果膠和木質(zhì)素等。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn):與同生理階段和同體重的大白豬育肥閹公豬相比,二花臉豬可以耐受更高的纖維日糧,且7%的麩皮替代基礎(chǔ)日糧可以顯著提高二花臉豬背最長肌紅度值(a值),初步分析發(fā)現(xiàn),7%的麩皮替代基礎(chǔ)日糧改變了二花臉豬肌纖維類型,肌纖維類型標記基因MyHCI的mRNA表達水平升高,而MyHC IIb和MyHC IIx的mRNA和蛋白表達水平顯著降低[1],提示適量的日糧纖維添加可通過改變肌纖維類型改善二花臉豬的肉色,提高豬肉品質(zhì)。

日糧纖維在豬體內(nèi)主要由后腸定植的微生物發(fā)酵生成短鏈脂肪酸(short chain fatty acids, SCFAs)、CO2、H2等物質(zhì)[2],同時日糧纖維可能通過影響腸道微生物的平衡和代謝,誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生氨基酸、小肽等小分子代謝物[3-6],調(diào)控動物整體代謝和健康。近年來,隨著DNA高通量測序、基因組學等技術(shù)和學科的快速發(fā)展,特別是代謝組學技術(shù)的日益成熟,為研究日糧纖維的分子營養(yǎng)調(diào)控機制提供了新的方法與思路。代謝組學是研究生物體受到干預(yù)前后代謝產(chǎn)物圖譜及其動態(tài)變化的一種技術(shù),具有技術(shù)通用性強、數(shù)據(jù)庫簡易等特點[7],且代謝處于生命調(diào)控過程的末端,相較于其他組學而言,代謝組學提供的是生物學的終端信息,更接近于生物體表型[8]。作為“后基因組學時代”的一項新興技術(shù),代謝組學平臺在動物營養(yǎng)調(diào)控的研究中已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用[9],但基于代謝組學技術(shù)解析日糧纖維調(diào)控豬肉品質(zhì)機理的研究還鮮見報道。因此,本研究選擇可代表和體現(xiàn)生物體整體生理系統(tǒng)代謝變化特征的二花臉豬血漿樣品[10],采用GC-MS非靶標代謝組學技術(shù)對其代謝物進行全面分析、鑒定和比較,并在體外細胞水平開展代謝物的功能驗證試驗,探究日糧纖維對豬血漿代謝物的影響,篩選日糧纖維影響二花臉豬肉質(zhì)性狀的候選代謝物,為揭示日糧纖維的營養(yǎng)功能并對其進行合理的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究以二花臉豬基礎(chǔ)日糧組(EHL_0%)和7%麩皮替代基礎(chǔ)日糧組(EHL_7%)的血漿樣品為試驗材料[1]。試驗用到的細胞分離自1日齡二花臉公豬的背最長肌(購自常熟市畜禽良種有限公司)。Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶和L多聚賴氨酸購自Sigma公司;DMEM/F12培養(yǎng)基、丙氨酰谷氨酰胺(Glutamax)、非必需氨基酸(NEAA)和丙酮酸鈉(Sodium Pyruvate)購自Gibco公司;胎牛血清(FBS)購自DCELL Biologics公司;細胞生長因子(bFGF)購自PeproTech公司;血清替代物(Ultroser G)購自美國PALL公司;雙抗(青霉素、鏈霉素)購自Hyclone公司。

1.2 試驗設(shè)計

本研究中血漿代謝組學所用到的樣品材料與前期本課題組已發(fā)表的文章[1]相同。選擇二花豬基礎(chǔ)日糧組(EHL_0%,5.13% ADF,12.84% NDF)和7%麩皮替代基礎(chǔ)日糧組(EHL_7%,5.7% ADF,14.43% NDF)正試期第28天的血漿樣品進行非靶向代謝組學檢測,鑒定兩個組別差異代謝物,并與前期基礎(chǔ)日糧組和7%麩皮替代基礎(chǔ)日糧組二花臉豬背最長肌的肉質(zhì)表型結(jié)果(肉色、pH和滴水損失)進行相關(guān)性分析,鑒別日糧纖維影響二花臉豬肉質(zhì)性狀的候選代謝物,探究肉質(zhì)性狀與代謝物之間的相互關(guān)系;然后在體外分離培養(yǎng)二花臉豬的肌衛(wèi)星細胞并誘導(dǎo)分化獲得肌管細胞,評價遴選的候選代謝產(chǎn)物對二花臉豬肌管細胞肌纖維類型轉(zhuǎn)變的影響,探究日糧纖維影響二花臉豬肉品質(zhì)的潛在調(diào)控機理。

1.3 豬血漿收集與樣品處理

正試期第28天,所有試驗豬通過前腔靜脈采集全血于肝素抗凝管中,上下輕輕顛倒混勻后,室溫靜置30 min,3 000 r·min-1離心10 min,吸取上清液,制作血漿樣本,隨后將血漿轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中,液氮速凍后,于-80 ℃冰箱保存。在開展GC-MS代謝組檢測時,從-80 ℃冰箱取出樣品,4 ℃緩慢融解后分別取各組樣品200 μL,加入300 μL提取液(v(甲醇):v(乙腈)=2∶1(含5%的內(nèi)標L-2-氯-苯丙氨酸));渦旋30 s混勻后,冰水浴超聲萃取30 min;將樣品于-20 ℃靜置30 min,然后高速離心15 min(4 ℃,13 000 r·min-1);取上清,裝入玻璃衍生小瓶中,氮氣吹干;于玻璃衍生小瓶中加入80 μL的甲氧胺鹽酸鹽吡啶溶液(15 mg·mL-1),渦旋2 min后于37 ℃震蕩培養(yǎng)箱中進行90 min肟化反應(yīng);再加入80 μL的BSTFA(含1%TMCS)衍生試劑,渦旋2 min后于70 ℃反應(yīng)60 min;取出樣本后,在室溫放置30 min,進行GC-MS代謝組學檢測。

1.4 色譜-質(zhì)譜(GC-MS)分析

本試驗所用分析儀器為Agilent公司的8890B-5977B氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent, USA)。衍生化后樣本用分流模式注入GC-MS系統(tǒng)進行分析,進樣量1 μL,分流比10∶1。樣品經(jīng)DB-5MS毛細管柱(40 m×0.25 mm×0.25 μm, Agilent122-5532G)分離后進入質(zhì)譜檢測。進樣口溫度 260 ℃,載氣為高純氦氣,載氣流速1 mL·min-1,隔墊吹掃流速3 mL·min-1,溶劑延遲5.5 min。升溫程序為初始溫度60 ℃,平衡0.5 min,然后以8 ℃·min-1的速度升至310 ℃,并維持6 min。質(zhì)譜條件為電子轟擊離子源(EI),傳輸線溫度為310 ℃,離子源溫度230 ℃,四極桿溫度150 ℃,電子能量70 eV。掃描方式為全掃描模式(SCAN),質(zhì)量掃描范圍:50～500 m·z-1,掃描頻率為3.2 scan·s-1。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

GC-MS的原始文件經(jīng)MassHunter workstation Quantitative Analysis(v10.0.707.0)軟件進行搜庫鑒定及數(shù)據(jù)預(yù)處理,將質(zhì)譜信息與代謝數(shù)據(jù)庫進行匹配,根據(jù)質(zhì)譜匹配度鑒定代謝物。主要數(shù)據(jù)庫為Fiehn database等商業(yè)數(shù)據(jù)庫,導(dǎo)出CSV格式的三維數(shù)據(jù)矩陣,該矩陣信息包括樣品名稱、代謝物名稱和峰面積等。將數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA-P 14.1軟件,分別進行峰面積歸一化、主成分分析(principal component analysis, PCA)和正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least-squares discrimination analysis, OPLS-DA)。以變量權(quán)重值(variable important in projection, VIP)>1.0,且t檢驗(P<0.05)為標準篩選差異代謝物,使用AMDIS軟件進行差異代謝物定性鑒別、匹配分析。將匹配到的差異代謝物導(dǎo)入 MetaboAnalyst 5.0數(shù)據(jù)庫進行代謝通路分析,同時借助KEGG數(shù)據(jù)庫構(gòu)建相關(guān)的代謝網(wǎng)絡(luò)。再者,將課題組前期得到的肉質(zhì)表型數(shù)據(jù)[1]與血漿中篩選出顯著性差異代謝物進行相關(guān)性分析,以皮爾森相關(guān)系數(shù)為原理進行分析,計算肉質(zhì)性狀與差異代謝物的相關(guān)系數(shù)值,其數(shù)值的絕對值越大,說明兩者關(guān)系越密切,P<0.05表示顯著相關(guān),P<0.01表示極顯著相關(guān),以Heatmap圖展示兩者之間的相關(guān)性。

1.6 二花臉豬肌衛(wèi)星細胞分離與鑒定

選取1日齡健康純種的二花臉仔豬,頸動脈放血處死后,用75%消毒酒精擦拭全身,進行消毒處理。在超凈工作臺內(nèi)快速切取仔豬背最長肌樣品,用含雙抗的PBS沖洗肌肉2次后轉(zhuǎn)移到無菌培養(yǎng)皿,用眼科鑷、眼科剪盡可能地去除筋膜、神經(jīng)、血管和脂肪組織,除去雜質(zhì)的肌肉轉(zhuǎn)入新的無菌培養(yǎng)皿,充分剪碎肌肉組織,約1 mm3大小。轉(zhuǎn)移肌肉組織樣品至細胞培養(yǎng)瓶,室溫靜置5～10 min,待肌肉樣品沉淀后,用巴氏吸管吸棄上清。按照 2∶1 體積比向肌肉組織樣品中加入0.28%的 I 型膠原酶(即2.8 mg·mL-1),37 ℃水浴搖床震蕩充分消化2 h,至組織樣呈黃色黏稠狀液體,充分消化后,加含胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化,收集消化的細胞懸液和未消化完全的組織塊經(jīng)100目、200目細胞篩過濾。收集濾液,1 000 r·min-1離心5 min,棄除上清液,在沉淀中加入適量的完全生長培養(yǎng)基重懸(完全培養(yǎng)基配方為:F12/DMEM,20% FBS,1% Glutamax,1% NEAA,1% Sodium Pyruvate,2 ng·mL-1bFGF,1%雙抗),經(jīng)細胞計數(shù)后接種于培養(yǎng)瓶中,置于37 ℃、50 mL·L-1CO2的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2 h后,吸出上清于另一新培養(yǎng)瓶即為肌衛(wèi)星細胞。純化后的細胞接種培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),隔天進行換液,運用免疫熒光技術(shù)檢測Pax7蛋白的表達情況,Pax7染色陽性細胞比例較高表明肌肉衛(wèi)星細胞分離成功。

1.7 免疫熒光染色

將制備的豬肌衛(wèi)星細胞接種至預(yù)放有細胞爬片的24孔板中,接種孔周圍用無菌PBS填充,待細胞在爬片上生長融合至60%～80%時,用PBS漂洗3次,加4%的多聚甲醛室溫固定15 min,用0.2%TritonX-100透化10 min,PBS洗3次,每次5 min;使用免疫熒光封閉液室溫封閉30 min,加入Pax7抗體(Developmental Studies Hybridoma Bank, 1∶50)4 ℃孵育過夜;PBS漂洗后用二抗Cy3山羊抗小鼠IgG(H+L)抗體(碧云天,A0521,1∶1 000)避光室溫孵育1 h;用DAPI(碧云天,C1002,1∶5 000)染核5 min;PBS漂洗后用抗熒光淬滅封片劑封片,通過熒光顯微鏡捕獲圖像。

1.8 代謝物十七烷酸處理二花臉豬肌管細胞

將原代二花臉豬肌衛(wèi)星細胞接種在6孔板上(設(shè)計5個組,每組2個重復(fù),共10個孔),每個孔中的細胞數(shù)相等(約為5×105個);加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞,待細胞生長至亞融合狀態(tài)時,改用分化培養(yǎng)基(含0.4%血清替代物的DMEM/F12培養(yǎng)基)進行誘導(dǎo)分化培養(yǎng),分化至第4天時可觀察到明顯的多核肌管。根據(jù)十七烷酸的溶解度信息,首先用去離子水(ddH2O)作為溶劑配制成母液,然后用分化培養(yǎng)基稀釋到所需的工作液濃度(0、0.2、2、20、200 μmol·L-1),處理分化第4天的肌管細胞48 h,然后用濃度為0.012 5%的胰蛋白酶300 μL消化上述肌管3 min,收集肌管細胞的RNA樣品,然后通過實時熒光定量PCR檢測不同肌纖維類型的標志基因MyHCI、MyHCIIa、MyHCIIb和MyHCIIxmRNA的表達水平。

1.9 實時熒光定量PCR

采用TRIzol法提取細胞總RNA,通過試劑盒(EVOM-MLVRT Kit with gDNA Clean for qPCR,艾科瑞)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后,參照ChamQ SYBR qPCR Master Mix(Vazyme)說明書在QuantStudio5實時熒光定量PCR儀上進行實時熒光定量PCR檢測。實時熒光定量PCR所用引物由北京擎科生物公司設(shè)計并合成,引物序列見表1。每個樣本設(shè)3個重復(fù),以GAPDH作為內(nèi)參基因通過2-△△Ct法換算目的基因相對表達量。將試驗結(jié)果數(shù)據(jù)表示為“平均值±標準差”,并采用SPSS 20.0軟件對各組數(shù)據(jù)進行方差檢驗,以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

表1 定量PCR引物信息Table 1 Primers information for qPCR

2 結(jié) 果

2.1 血漿差異代謝物的篩選及鑒定

首先采用無監(jiān)督的主成分分析(PCA)對二花臉豬基礎(chǔ)日糧組(EHL_0%)和7%麩皮替代基礎(chǔ)日糧組(EHL_7%)血漿的GC-MS數(shù)據(jù)從整體上進行評價,結(jié)果顯示樣本基本處于95%置信區(qū)間內(nèi)(圖1)。為進一步明確兩組間的差異性,采用有監(jiān)督的正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)追蹤這些差異代謝物在基礎(chǔ)日糧組和7%麩皮替代基礎(chǔ)日糧組間的變化趨勢,結(jié)果如圖2所示,兩組區(qū)分較明顯,表明不同日糧纖維水平導(dǎo)致血漿形成特異性的代謝組。利用t檢驗的P值和差異倍數(shù)(Fold change, FC)繪制火山圖對血漿差異代謝物進行可視化,如圖3所示,共發(fā)現(xiàn)5個代謝物上調(diào),4個代謝物下調(diào)。選擇OPLS-DA模型得到的VIP>1,同時P<0.05的化合物作為顯著差異代謝物,最終篩選出9個顯著差異富集的代謝物(表2)。

圖中每個點代表了1個樣品。橫坐標為第1主成分,縱坐標為第2主成分,2點之間在橫、縱坐標上的距離代表了樣品受第1主成分或第2主成分影響下的相似性距離。橢圓區(qū)域表示本組樣本在95%的置信度下分布在此區(qū)域內(nèi);超過此區(qū)域表示樣本可能異常 Each point in the figure represents a sample. The x-axis represents the first principal component (PC1), the y-axis represents the second principal component (PC2), and the distance between two points on the x-axis and y-axis represents the similarity distance of the sample under the influence of the PC1 or PC2. The ellipse region indicates that the samples of this group were distributed in this region with 95% confidence. Exceeding the ellipse region indicates that the sample may be abnormal圖1 EHL_0%組和EHL_7%組血漿代謝組樣品PCA得分圖Fig.1 PCA scores of plasma metabolome samples in EHL_0% and EHL_7% groups

橫坐標為第一預(yù)測主成分解釋度,主要反映組間差異;縱坐標為第一正交成分解釋度,主要反映組內(nèi)差異。橢圓區(qū)域表示本組樣本在95% 的置信度下分布在此區(qū)域內(nèi);超過此區(qū)域表示樣本可能異常The x-axis represents the interpretation degree of the first predicted principal component, which mainly reflects the differences between groups. The y-axis represents the degree of interpretation of the first orthogonal component, which mainly reflects the intra-group differences. The ellipse region indicates that the samples of this group were distributed in this region with 95% confidence. Exceeding this region indicates that the sample may be abnormal圖2 EHL_0%組和EHL_7%組血漿代謝組樣品OPLS-DA得分圖Fig.2 OPLS-DA scores of plasma metabolome samples in EHL_0% and EHL_7% groups

橫坐標為代謝物在兩組間差異富集水平的倍數(shù)值,即log2FC,縱坐標為代謝物差異富集水平的統(tǒng)計學檢驗值,即-lg (P value)值,值越高表示差異越顯著,橫縱坐標的均為對數(shù)化數(shù)值。圖中每個點代表一個特定的代謝物,點的大小表示VIP值?；疑c(nosig)代表沒有差異的代謝物,藍色點(down)代表差異下調(diào)的代謝物,紅色點(up)代表差異上調(diào)的代謝物The x-axis represents the fold change of the differential enriched metabolites between two groups, namely log2FC; The y-axis represents the statistical value of the differential enriched metabolites, namely-lg (P value) value. The higher the value, the more significant difference it is. Each dot in the figure represents a specific metabolite, and the size of the dot indicates the VIP value. The gray dots (nosig) represent metabolites with no difference, the blue dots (down) represent the down-regulated metabolites, and the red dots (up) represent up-regulated metabolites圖3 EHL_0%組和EHL_7%組血漿代謝組火山圖Fig.3 Volcanic map of plasma metabolome in EHL_0% and EHL_7% groups

表2 血漿差異代謝物表Table 2 Table of differential metabolites in plasma

為了更直觀地展示差異血漿代謝物在不同樣本之間富集水平的差異,對血漿樣本中所有顯著差異代謝物進行層次聚類(圖4)。結(jié)果顯示,二花臉豬血漿差異代謝物明顯分為兩大類,其中D-threitol、1, 4-dideoxy-1, 4-imino-D-arabinitol、tyrosine和urea 4種代謝物在基礎(chǔ)日糧組(EHL_0%)豐度較高,heptadecanoic acid、p-toluenesulfonic acid、D-allose、pipecolic acid和 beta-myrcene 5種化合物在7%麩皮替代基礎(chǔ)日糧組(EHL_7%)中豐度較高。

從藍到紅顏色深度表示代謝物富集豐度從低到高。A37～A43為基礎(chǔ)日糧組樣品,B38～B51為7%麩皮替代基礎(chǔ)日糧組樣品Colors from blue to red indicate the enrichment level of metabolites from low to high. A37-A43 were the basal diet group samples, and B38-B51 were the 7% bran replacement basal diet group samples圖4 血漿差異代謝物聚類分析圖Fig.4 Cluster analysis diagram of differential metabolites in plasma

2.2 血漿差異代謝物的代謝通路分析

為探究飼喂7%日糧纖維對二花臉豬代謝通路的影響,利用KEGG數(shù)據(jù)庫對二花臉豬基礎(chǔ)日糧組(EHL_0%)和7%麩皮替代基礎(chǔ)日糧組(EHL_7%)血漿樣品鑒定到的9個差異代謝物進行代謝通路富集分析,結(jié)果表明(圖5),二花臉豬的血漿差異代謝產(chǎn)物主要富集的代謝途徑包括:黑色素生成途徑、ABC轉(zhuǎn)運體途徑、酪氨酸和色氨酸生物合成途徑等。

橫坐標為富集率,縱坐標為KEGG通路。圖中氣泡的大小代表該通路中富集的差異代謝集的數(shù)量,氣泡的顏色表示顯著性富集P值的大小The x-axis represents the enrichment rate, and the y-axis represents KEGG pathway. In the figure, the size of the bubble represents the amount of metabolites enriched into the metabolic set for specific pathway, and the color of the bubble represents the magnitude of the significance enrichment P value圖5 血漿差異代謝物的代謝通路分析圖Fig.5 Pathway analysis diagram of plasma differential metabolites

2.3 血漿差異代謝物與肉質(zhì)表型的相關(guān)性分析

將課題組前期測定的二花臉豬肉質(zhì)表型數(shù)據(jù)與血漿差異代謝物豐度值進行Pearson相關(guān)性分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅有十七烷酸與二花臉豬背最長肌24 h的紅度值(a24 h)呈顯著的正相關(guān)(圖6)。推測7%麩皮替代基礎(chǔ)日糧組提高了代謝物十七烷酸的水平,進而提高了背最長肌24 h的紅度值(a24 h)。

圖中的右側(cè)為代謝物名稱,底部為不同的肉質(zhì)表型,圖中每個格子表示兩個屬性(代謝物與肉質(zhì)表型)之間的相關(guān)性,不同顏色代表屬性間相關(guān)系數(shù)的大小。L表示亮度,a表示紅度,b表示黃度,DL表示滴水損失,pH表示背最長肌的酸度。*. P<0.05The right side of the figure is the name of metabolite, and the bottom is the meat quality phenotypes. In the figure, each grid represents the correlation between two features (metabolite and meat quality phenotypes), and different colors represent the magnitude of correlation coefficient between features. L is brightness, a is redness, b is yellow, DL is drip loss, pH is the acidity of longissimus dorsi muscle. *. P<0.05圖6 血漿差異代謝物與肉質(zhì)表型的關(guān)聯(lián)分析Fig.6 Correlation analysis of plasma differential metabolites and meat quality traits

2.4 十七烷酸處理對二花臉豬肌管細胞MyHC I表達的影響

選用差速貼壁法分離二花臉豬骨骼肌肌衛(wèi)星細胞(圖7)。剛分離出的原代骨骼肌衛(wèi)星細胞比較小,呈球形,折光性強;培養(yǎng)48 h后,細胞貼壁,呈梭形或紡形;72 h后貼壁完全,細胞逐漸延展成梭形。利用免疫熒光檢測肌衛(wèi)星細胞標記蛋白Pax7的陽性率,發(fā)現(xiàn)剛分離的二花臉豬肌衛(wèi)星細胞的純度約為50%(圖8),可用于后續(xù)代謝物的功能研究。

A. 剛分離的豬肌衛(wèi)星細胞;B. 分離培養(yǎng)48 h的肌衛(wèi)星細胞;C. 分離培養(yǎng)72 h的肌衛(wèi)星細胞A. Newly isolated muscle satellite cells; B. Satellite cells cultured for 48 h; C. Satellite cells cultured for 72 h圖7 二花臉豬肌衛(wèi)星細胞的形態(tài)(40×)Fig.7 The morphology of Erhualian pig muscle satellite cells(40×)

A. 肌衛(wèi)星細胞核DAPI染色結(jié)果;B. 肌衛(wèi)星細胞Pax7蛋白免疫熒光結(jié)果;C. 疊加圖像A. DAPI nucleus staining of muscle satellite cells; B. Immunofluorescence of Pax7 protein in muscle satellite cells; C. Merged image圖8 二花臉豬肌衛(wèi)星細胞Pax7的免疫熒光檢測圖(100×)Fig.8 Immunofluorescence of Pax7 in muscle satellite cells of Erhualian pig(100×)

為研討十七烷酸對二花臉豬肌管細胞肌纖維類型組成的影響,利用不同濃度(0、0.2、2、20和200 μmol·L-1)的十七烷酸處理分化第4天的肌管細胞48 h,然后利用實時熒光定量 PCR檢測十七烷酸對4種肌管肌纖維類型標記基因表達水平的影響,發(fā)現(xiàn)MyHCI基因mRNA表達水平隨著代謝物處理濃度的升高而顯著提高,其它基因mRNA的表達量沒有發(fā)生顯著變化(圖9)。推測,十七烷酸可能通過改變MyHCI的表達提高了其背最長肌的紅度值。

**. P<0.01圖9 十七烷酸對二花臉豬肌纖維類型標記基因相對mRNA表達水平的影響Fig.9 Effect of heptadecanoic acid on relative mRNA expression of muscle fiber type marker genes in Erhualian pig

3 討 論

日糧纖維在過去一直被認為是一種抗營養(yǎng)因子,隨著研究的深入,越來越多的學者認識到日糧纖維作為豬日糧的營養(yǎng)成分對其生命活動的重要作用[11-12]。適量日糧纖維有利于維持豬正常腸道生理和機體代謝平衡[13-15]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),適量日糧纖維的添加可通過改變肌纖維類型改善二花臉豬的肉色,提高豬肉品質(zhì),但其機理不清?；趯θ占Z纖維發(fā)酵和代謝過程的分析,推測腸道微生物發(fā)酵纖維后不僅可以產(chǎn)生SCFAs,也會誘導(dǎo)腸道微生物合成其他代謝產(chǎn)物[16]。而前期的試驗結(jié)果表明,日糧纖維的添加并未改變腸道短鏈脂肪酸含量,但影響了二花臉豬腸道微生物的豐度以及結(jié)腸內(nèi)容物和肝的代謝產(chǎn)物(結(jié)果尚未發(fā)表),因此推測,日糧纖維可能通過影響二花臉豬代謝產(chǎn)物來調(diào)控肌纖維類型的轉(zhuǎn)變?；谠摷僭O(shè),本試驗通過GC-MS非靶向代謝組學,檢測了添加不同水平日糧纖維后二花臉豬血漿的代謝產(chǎn)物。結(jié)果顯示,7%麩皮替代基礎(chǔ)日糧提高了二花臉豬血漿代謝物十七烷酸、哌啶酸、對甲基苯磺酸、D-阿洛糖和月桂烯的水平。相關(guān)性分析表明僅有十七烷酸與二花臉豬背最長肌24 h紅度值(a24 h)呈顯著正相關(guān)。

十七烷酸是公認的乳脂攝入生物標志物[17],除了來源于反芻動物脂肪外,它們也可以內(nèi)源合成,例如,有研究報道十七烷酸可從腸道衍生的丙酸或其他短于十五碳的奇數(shù)鏈飽和脂肪酸合成[18]。Weitkunat等[19]研究發(fā)現(xiàn),飼喂膳食纖維可以顯著增加小鼠體內(nèi)丙酸的含量,同時也會增加血漿磷脂中十五烷酸和十七烷酸的含量。李碧俠等[20]研究發(fā)現(xiàn),飼糧中添加苜蓿草粉可加快蘇山豬背最長肌中葵酸、棕櫚酸和十七烷酸等飽和脂肪酸富集,減少亞油酸碳二燒酸、二十碳三烯酸等多不飽和脂肪酸富集,從而改變蘇山豬肌肉中脂肪酸的含量,改善肌肉嫩度和風味品質(zhì)。十七烷酸是一種奇數(shù)鏈飽和脂肪酸,可以通過脂肪酸合成酶介導(dǎo),以丙酸和戊酸為前體重復(fù)縮合而成[21]。另有研究報道,十七烷酸可以通過轉(zhuǎn)化為丙酰輔酶A,并進一步轉(zhuǎn)化為琥珀酰輔酶A,為三羧酸循環(huán)提供無雜合中間體,調(diào)節(jié)線粒體代謝,從而有利于改善骨骼肌信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)[18]。

研究表明,豬骨骼肌肌纖維包括4種不同的肌纖維類型,即慢速氧化型肌纖維(Ⅰ型)、快速氧化型肌纖維(Ⅱa型)、快速酵解型肌纖維(Ⅱb型)和中間型肌纖維(Ⅱx型),分別表達MyHC-I/slow(Myh7)、MyHC-IIa(Myh2)、MyHC-IIb(Myh4)和MyHC-IIx(Myh1)基因[22-24]。豬肉色性狀與肌纖維類型組成相關(guān),慢速氧化型纖維(Ⅰ型)直徑小,具有更小的滴水損失,肌紅蛋白含量高,顏色更鮮紅;相反的,快速酵解型纖維(Ⅱb型)直徑大,具有更大的滴水損失,屠宰后pH下降快,蛋白質(zhì)降解程度增加,容易產(chǎn)生顏色蒼白、質(zhì)地松軟和表面滲水(pale soft exudative, PSE)的肉[25-28]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),Ⅰ型肌纖維的含量越高,宰后pH的下降速率和幅度越低,肌肉的感官品質(zhì)越好[29-30]。Ryu和Kim[31]研究也證實I型纖維與紅度值呈正相關(guān)(r=0.22;P<0.001),而IIb型纖維與紅度值呈負相關(guān)(r=0.33;P<0.001),增加氧化型肌纖維含量有利于改善豬肉色澤,提升豬肉品質(zhì)。本研究表明,十七烷酸處理可以提高二花臉豬肌管細胞MyHCI基因的表達。因此推測,日糧纖維的添加可能通過影響腸道微生物的平衡和代謝,通過誘導(dǎo)腸道微生物產(chǎn)生十七烷酸,經(jīng)血液直接或經(jīng)肝組織間接作用于肌肉組織,進而影響豬肉色性狀。

4 結(jié) 論

添加日糧纖維可以引起二花臉豬血漿代謝組發(fā)生顯著的變化,在基礎(chǔ)日糧組和7%麩皮替代基礎(chǔ)日糧組二花臉豬血漿中共鑒定出9個差異代謝物,其中4個差異代謝產(chǎn)物在基礎(chǔ)日糧組含量較高,5個差異代謝產(chǎn)物在7%麩皮替代基礎(chǔ)日糧組含量較高。通過將差異代謝物與肉質(zhì)表型進行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)血漿差異代謝物中僅有十七烷酸與二花臉豬背最長肌24 h紅度值(a24 h)呈顯著正相關(guān)。體外肌管細胞試驗進一步表明,十七烷酸處理可能通過提高二花臉豬肌管細胞MyHCI基因的表達,改善其肉色性狀。本研究初步闡明了適量日糧纖維添加改善豬肉色性狀的分子機理,為非常規(guī)日糧的合理利用提供了理論依據(jù)。