沈紅楓，查渭，金志江，夏海江，劉龍斌

紹興文理學院附屬醫(yī)院 紹興市立醫(yī)院 心血管內(nèi)科，浙江 紹興 312000

血管緊張素II（angiotensin II,Ang II）是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin-angiotensinaldosterone system,RAAS）重要的效應分子之一，可調(diào)節(jié)多種細胞因子的表達，在生理條件下維持心血管系統(tǒng)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，在調(diào)控血管內(nèi)皮細胞功能狀態(tài)中具有重要的作用[1]。在病理條件下，Ang II通過激活多條信號通路來參與血管內(nèi)膜增生、心肌肥大、心臟重塑等心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展，而使用血管緊張素受體抑制劑（如纈沙坦）能顯著延緩上述病理過程[2]。研究[3]顯示Ang II可以通過引發(fā)微血管通透性增加，從而參與多種心血管疾病的進展，但是其破環(huán)微血管的具體機制目前尚未闡明。

血管內(nèi)皮細胞屏障的完整性是維持正常血管通透性的基礎。血管內(nèi)皮細胞之間存在著許多緊密連接。這些緊密連接常圍繞細胞的頂端并呈連續(xù)帶狀，使相鄰的內(nèi)皮細胞緊密連接在一起，填充細胞間隙，形成一道天然的物理屏障，起著維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、選擇性通透等細胞基本功能的作用[4]。緊密連接相關跨膜蛋白（zonula occludens-1,ZO-1）是細胞間緊密連接的主要成分，其在內(nèi)皮細胞中的表達和分布對內(nèi)皮細胞緊密連接的功能具有決定性的作用[5]。孫瑞等[6]發(fā)現(xiàn)通過微小RNA干預內(nèi)皮細胞進而調(diào)控其ZO-1蛋白的表達升高，能有效抑制缺氧導致的血管通透性增高。同時，有研究[7]表明雷公藤內(nèi)酯干預在增加ZO-1蛋白表達的同時可以提高結(jié)腸內(nèi)膜的緊密連接數(shù)量。本研究擬通過細胞實驗檢測Ang II對內(nèi)皮細胞中ZO-1表達及分布的影響，以及血管內(nèi)皮鈣粘連蛋白（vascular endothelialcadherin,VE-cadherin）在其中的作用，以期探究Ang II破環(huán)微血管內(nèi)皮細胞屏障的可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料 M199培養(yǎng)液、胰蛋白酶購自美國Sigma公司；胎牛血清購自美國GIBCO公司；RNA提取試劑購自美國Invitrogen公司；Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物公司；SYBR Green熒光染料試劑盒購自美國Roche公司；兔或鼠抗人ZO-1、VE-cadherin、β-actin多克隆抗體和辣根過氧化酶標記的二抗購自美國ABCAM公司；脂質(zhì)體2000購自美國Invitrogen公司；蛋白質(zhì)印跡（Western blot）相關試劑購自上海碧云天生物技術有限公司；VE-cadherin過表達質(zhì)粒由上海吉瑪制藥技術有限公司設計合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和分組：大鼠主動脈內(nèi)皮細胞通過I型膠原酶酶消化法分離獲得，并在含20%胎牛血清的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)[8]。細胞分為對照組、Ang II組、Ang II+纈沙坦組以驗證Ang II對細胞通透性的影響。根據(jù)是否使用Ang II和VEcardherin過表達干預內(nèi)皮細胞，分別設置對照組、Ang II組和Ang II+VE-cadherin過表達組，并予以對應干預。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染：將內(nèi)皮細胞系接種至6孔板，生長至50%～70%密度時，以脂質(zhì)體2000分別轉(zhuǎn)染VEcadherin過表達質(zhì)粒或空質(zhì)粒各100 pmol，24 h后提取總RNA/蛋白后，實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）鑒定轉(zhuǎn)染效率，進行后續(xù)實驗。

1.2.3 RT-qPCR檢測基因表達：提取內(nèi)皮細胞中總RNA，將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應體系為20 μL，反應條件為：37 ℃、15 min反轉(zhuǎn)錄，85 ℃、5 s反轉(zhuǎn)錄酶失活，4 ℃保存。運用SYBR Green法檢測ZO-1 mRNA、VE-cadherin mRNA的表達情況，反應條件為：94 ℃、15 min預變性，94 ℃、30 s變性，60 ℃、30 s退火，72 ℃、30 s延伸，共循環(huán)40次。每組樣品重復3次，實驗重復3次。

1.2.4 Western blot法檢測蛋白表達量：提取各組細胞中的總蛋白，用BCA法定量蛋白，SDS-PAGE膠每孔加入20 μL的樣品，75 V、30 min進行蛋白濃縮，110 V、2 h進行蛋白電泳，并用孔徑0.45 μm的PVDF膜240 mA、90 min進行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后常溫下TBST洗膜3次、封閉1 h后，以1:1 000濃度加入兔（鼠）抗人ZO-1一抗（或抗VE-cadherin、β-actin一抗），4 ℃孵育過夜，常溫下TBST洗膜3次，辣根過氧化物酶標記羊抗兔（鼠）二抗孵育后ECL化學發(fā)光法檢測?？逻_膠片暗室顯影，Quantity One軟件分析。

1.2.5 細胞免疫熒光法檢測ZO-1在細胞中的分布及表達：各組細胞干預結(jié)束后，PBS洗3遍，用4%多聚甲醛固定，0.25% Triton X 100穿破細胞膜，山羊血清室溫封閉1 h，加入稀釋了250倍的ZO-1抗體，4 ℃過夜，PBST清洗3遍，加入結(jié)合有FICT的山羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，PBST清洗3遍，熒光顯微鏡拍照后圖片用Image pro plus 6.0分析。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料用±s表示，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Ang II抑制內(nèi)皮細胞中ZO-1表達水平和細胞膜分布 相比于對照組，Ang II組ZO-1的mRNA和蛋白表達量均顯著降低（P＜0.01），且ZO-1蛋白在細胞膜上表達趨勢減弱；與Ang II組比，Ang II+纈沙坦組內(nèi)皮細胞ZO-1 mRNA和蛋白表達量顯著增加（P＜0.01），且ZO-1蛋白在細胞膜上的表達恢復，見圖1。

圖1 Ang II對內(nèi)皮細胞中ZO-1表達及分布的影響

2.2 Ang II對內(nèi)皮細胞中VE-cadherin表達的影響 與對照組比較，Ang II組中VE-cadherin蛋白的表達減少（P＜0.01），VE-cadherin mRNA的表達也減少（P＜0.01）；相比于Ang II組，Ang II+纈沙坦組內(nèi)皮細胞中VE-cadherin表達增加（P＜0.01），見圖2。

圖2 Ang II抑制內(nèi)皮細胞中VE-cadherin的表達

2.3 VE-cadherin過表達質(zhì)粒逆轉(zhuǎn)成功 脂質(zhì)體2000分別轉(zhuǎn)染VE-cadherin過表達質(zhì)?；蛘呖召|(zhì)粒后，相比于空白對照組，空質(zhì)粒組和VE-cadherin過表達質(zhì)粒組中都可以觀察到綠色熒光的質(zhì)粒，見圖3A。RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，相比于空白對照組和空質(zhì)粒組，VE-cadherin過表達組內(nèi)皮細胞中VEcadherin mRNA表達升高（P＜0.01），見圖3B。

圖3 VE-cadherin過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功

2.4 VE-cadherin過表達質(zhì)粒逆轉(zhuǎn)Ang II的作用與對照組比，Ang II組內(nèi)皮細胞中ZO-1表達降低（P＜0.01）；相比于Ang II組，Ang II+VE-cadherin過表達組內(nèi)皮細胞中ZO-1表達增加（P＜0.01），見圖4A；Ang II+VE-cadherin過表達組相較于Ang II組，細胞膜上ZO-1表達顯著增強，見圖4B。

圖4 VE-cadherin過表達質(zhì)粒逆轉(zhuǎn)Ang II的作用

3 討論

血管內(nèi)皮細胞對維持正常血管通透性具有關鍵性作用，內(nèi)皮功能損傷是多種心血管疾病的關鍵環(huán)節(jié)。近年來，Ang II對血管內(nèi)皮細胞功能的影響越來越受到國內(nèi)外心血管系統(tǒng)研究者的關注。Ang II可通過刺激產(chǎn)生活性氧、促進血栓形成、抑制一氧化氮產(chǎn)生以及促進血管內(nèi)皮細胞凋亡等多種途徑促使細胞功能受損。研究[9-10]表明，Ang II可通過抑制血管內(nèi)皮細胞中一氧化氮合酶，誘導細胞中炎癥反應等作用損傷內(nèi)皮細胞。最近又有研究[11-12]表明Ang II可以通過破環(huán)微血管通透性從而參與多種心血管疾病的進展。

ZO蛋白包括3個異構(gòu)體ZO-1、ZO-2和ZO-3，三者以異聚體形式組成復合體，并通過與occludin、claudin和肌動蛋白相連接，對維持緊密連接復合體（tight junction complex,TJC）完整性和功能發(fā)揮有著重要的作用。有研究[13]表明，不管是抑制ZO-1蛋白的表達還是干預ZO-1蛋白的關鍵氨基酸序列，都會增加上皮細胞通透性，提高藥物呈遞效率[13-14]。張冰等[15]發(fā)現(xiàn)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織ZO-1蛋白表達水平下降，而中藥復方制劑能逆轉(zhuǎn)ZO-1蛋白的表達下調(diào)，進而起到保護腸道屏障的作用。在本研究中，Ang II不僅可以減少內(nèi)皮細胞中ZO-1蛋白的表達，還可以使原先規(guī)則分布在細胞膜周圍的ZO-1分布變得紊亂，提示Ang II可破壞內(nèi)皮細胞間的緊密連接，這可能是其引發(fā)微血管通透性增加的機制。

鈣粘連蛋白（cadherin）家族是一組介導同型細胞黏附的鈣依賴性I型跨膜糖蛋白，參與形成和維護正常細胞間的連接和極性，對干細胞分化、腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移、細胞增殖也具有一定的調(diào)控作用[16]。VE-cadherin屬于經(jīng)典cadherin家族，主要分布于內(nèi)皮細胞，是內(nèi)皮細胞所特有的cadherin，介導內(nèi)皮細胞細胞間的連接[17]。研究[18]發(fā)現(xiàn)，VEcadherin除了介導細胞間連接之外，同時也具有傳導細胞間信號的作用。MAHALANOBISH等[19]研究發(fā)現(xiàn)，VE-cadherin參與了Ang II誘導肺微血管內(nèi)皮細胞屏障損傷，而通過褪黑素上調(diào)VE-cadherin水平能有效拮抗Ang II以前的肺部水腫，減輕肺部毛細血管的細胞凋亡水平。此外，MüLLER等[20]研究發(fā)現(xiàn)，VEcadherin和claudin-5還能同時被miR-125a靶向抑制，從而引起巨噬細胞浸潤和局部血管炎癥水平增加。本研究發(fā)現(xiàn)，Ang II在抑制ZO-1表達的同時，也可以抑制細胞中VE-cadherin的表達，所以我們推測Ang II可能是通過下調(diào)VE-cadherin的表達從而發(fā)揮抑制血管內(nèi)皮細胞中ZO-1蛋白的表達的作用。為了進一步驗證這一推測，我們構(gòu)建了VE-cadherin過表達質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)事先用VE-cadherin過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細胞后，Ang II不能再抑制細胞中ZO-1蛋白的表達。綜上所述，Ang II可通過下調(diào)VE-cadherin的表達從而抑制血管內(nèi)皮細胞中ZO-1蛋白的表達，這可能是Ang II引發(fā)微血管通透性增加的分子機制。