孫軼群，趙軍招

溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 生殖醫(yī)學中心，浙江 溫州 325000

隨著女性生育年齡普遍推遲，女性不孕癥日益增多，越來越成為重要的社會問題。研究[1]表明世界上大約15%的人受到不孕不育的影響，輔助生殖技術（assisted reproductive technology,ART）的發(fā)展為解決這一問題提供了重要途徑，也要求我們對生殖過程有更加深入的研究以及更加精細的把控。ART主要包括體外受精（in vitro fertilization,IVF）與胚胎移植等過程，卵子的成熟、排卵以及胚胎著床都是其中的重要環(huán)節(jié)。臨床研究表明，kisspeptin作為下丘腦-垂體-性腺（hypothalamic-pituitary-gonadal,HPG）軸的上游因素，通過調(diào)節(jié)GnRH分泌促進卵子成熟，誘發(fā)排卵[2]，而局部作用在卵巢的kisspeptin也對卵子的成熟及排出起促進作用[3]。此外，子宮內(nèi)膜和胚泡中局部表達的kisspeptin/KISS1R在母胎界面參與多種生理活動，在著床的過程中也發(fā)揮著重要作用[4]。本文對kisspeptin在輔助生殖領域的相關研究進行綜述，以探尋其臨床應用價值。

1 KISS1/KISS1R 系統(tǒng)概述

Kisspeptin以及它的編碼基因KISS1 是由LEE等[5]于1996年在研究黑色素瘤轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)現(xiàn)并命名。而后LEE等[6]又在大鼠腦中發(fā)現(xiàn)一種G蛋白偶聯(lián)受體，命名為GPR54。2001年，OHTAKI等[7]證實了GPR54為kisspeptin的受體，此后GPR54又名為KISS1R。此外，多個研究小組在研究不同生理功能時獨立發(fā)現(xiàn)了KISS1R的存在，使KISS1R還有其他不同的名稱，包括AXOR12、CPPB1、hOT7T175和HH8[8-10]。2003年，SEMINARA等[11]發(fā)現(xiàn)GPR54突變導致人類和小鼠單純性促性腺激素功能減退癥（idiopathic hypogonadotropic hypogonadism,IHH），使人們開始認識到kisspeptin/KISS1R系統(tǒng)在HPG軸中起到重要作用，促進生殖領域?qū)isspeptin開展系列研究。研究[12]發(fā)現(xiàn)KISS1基因位于人染色體1q32上，編碼一個無生物學活性且不穩(wěn)定的145氨基酸前肽，可以裂解成四種活性短肽，以氨基酸數(shù)量分為kisspeptin-10、13、14和54，其中kisspeptin-54又可以進一步裂解kisspeptin-10、13、14，這些不同的亞型統(tǒng)稱為kisspeptins。短肽kisspeptins均含有一個活性Arg-Phe-NH2序列的C端區(qū)域，具有高親和力，能夠結合并完全激活KISS1R，從而進一步發(fā)揮生理作用[13]。

2 Kisspeptin促進卵細胞成熟及誘導排卵

2.1 Kisspeptin神經(jīng)元的中樞調(diào)控 Kisspeptin神經(jīng)元位于下丘腦前腹側室旁核（anteroventral periventricular nucleus,AVPV）和弓狀核（arcuate nucleus,ARC），后者的kisspeptin神經(jīng)元除了表達kisspeptin外，還表達神經(jīng)激肽B（neurokinin B,NKB）和強啡肽（dynorphin,Dyn）兩種神經(jīng)肽，也被稱作kisspeptin/神經(jīng)激肽B/強啡肽（kisspeptin/NKB/Dyn,KNDy）神經(jīng)元[14]，它們通過調(diào)控促性腺激素釋放激素（gonadotropin releasing hormone,GnRH）神經(jīng)元脈沖的頻率和幅度調(diào)控垂體黃體生成素（luteinizing hormone,LH）和促卵泡生成素（follicle stimulating hormone,FSH）的分泌，見圖1。Kisspeptin神經(jīng)元增加GnRH脈沖的幅度，優(yōu)先刺激LH的分泌，KNDy神經(jīng)元上的Dyn則降低GnRH脈沖的頻率，優(yōu)先刺激FSH的分泌[15]。此外，AVPV的kisspeptin神經(jīng)元主要接受雌激素的正反饋，ARC的KNDy神經(jīng)元則接受雌激素的負反饋[16]。在卵泡發(fā)育的初始階段，雌激素水平低下，刺激ARC的KNDy神經(jīng)元，kisspeptin、NKB、Dyn分泌增加，引起低頻率的GnRH脈沖，使FSH分泌增加，刺激卵泡的募集和生長。隨著卵泡的生長，雌激素的分泌逐漸增加，負反饋作用使KNDy神經(jīng)元活性下調(diào)，GnRH脈沖頻率增加，導致LH分泌開始增加，F(xiàn)SH的分泌逐漸減少。到排卵前階段時，AVPV的kisspeptin神經(jīng)元接受雌激素的正反饋信號，產(chǎn)生高幅度的GnRH脈沖，在高頻率和高幅度的GnRH脈沖下，LH激增，從而引發(fā)排卵[15]。

圖1 下丘腦中kisspeptin神經(jīng)元對下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)控作用

YEO等[17]利用轉(zhuǎn)基因小鼠進行病毒示蹤，發(fā)現(xiàn)大腦多個區(qū)域顯示與KISS1 神經(jīng)元的突觸連通性，包括視上核和視交叉中的加壓素神經(jīng)元，室旁核中促甲狀腺激素釋放的神經(jīng)元和其他區(qū)域的神經(jīng)元，例如杏仁核、紋狀體、大腦皮層的視覺、觸覺、嗅覺區(qū)等。許多研究[18-20]也證明kisspeptin在大腦其他區(qū)域發(fā)揮著重要作用，例如杏仁核內(nèi)的kisspeptin神經(jīng)元，也可以調(diào)節(jié)下丘腦GnRH脈沖發(fā)生器頻率，在杏仁背內(nèi)側核內(nèi)注射kisspeptin將導致LH分泌增加。kisspeptin在生殖神經(jīng)內(nèi)分泌中有復雜的網(wǎng)絡與作用機制，其具體通路以及將來的應用有待進一步研究與發(fā)掘。

2.2 Kisspeptin局部作用于卵巢 JAYASENA等[21]對53名婦女進行單次皮下注射kisspeptin-54，36 h后取卵評估成熟度，發(fā)現(xiàn)注射kisspeptin-54 能促進卵子成熟，且患者的平均成熟卵數(shù)以劑量依賴性方式增加。鑒于kisspeptin-54能夠穿過血腦屏障，刺激LH釋放到外周循環(huán)，但是提高的LH水平也可以誘導卵母細胞成熟，尚不能說明kisspeptin可以直接作用于卵巢誘導卵母細胞成熟。但有研究[22-25]表明了kisspeptin在大鼠、小鼠、綿羊、豬、犬、牛、人類等哺乳動物卵巢組織中表達，揭示了kisspeptin在卵巢組織中的局部功能。HU等[3]更是進一步綜述了kisspeptin在直接控制卵泡發(fā)育，卵母細胞成熟，類固醇生成和排卵中的作用。由此可見，無論是對于HPG軸的中樞調(diào)控，還是對于卵巢的局部作用，kisspeptin在哺乳動物卵子成熟及排卵方面都有著積極作用，這也為其在促進排卵方面的應用提供理論基礎。

2.3 Kisspeptin作為促排卵藥物的應用 動物實驗和臨床研究均證實了外源性kisspeptin可作為觸發(fā)卵母細胞成熟的新型替代方法，其有效性并不弱于傳統(tǒng)的β-人絨毛膜促性腺激素（human choionic gonadotophin,HCG）和GnRH激動劑，且在卵巢過度刺激綜合征（ovarian hyperstimulation syndrome,OHSS）高風險患者中應用更為安全[26]。OHSS是誘發(fā)排卵過程中較常見的并發(fā)癥，主要與IVF治療期間用于誘導卵母細胞成熟的激素有關。ZHAI等[27]研究發(fā)現(xiàn)kisspeptin-10 通過激活KISS1R和抑制血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）來防止OHSS患者血管通透性增加。ABBARA等[28]通過對照實驗發(fā)現(xiàn)對于OHSS高風險女性，kisepteptin-54 可以延長LH的作用時間，提高卵母細胞的成熟度的同時并不增加OHSS的發(fā)生率，可見kisspeptin作為新型觸發(fā)卵母細胞成熟的治療劑，讓OHSS高風險女性也能實現(xiàn)胚胎移植。ABBARA等[29]又進行了一項回顧性隊列研究，發(fā)現(xiàn)在OHSS高風險女性中，通過kisspeptin誘導GnRH釋放來觸發(fā)卵母細胞成熟，較外源性HCG更有優(yōu)勢。OWENS等[30]研究也發(fā)現(xiàn)，與HCG相比kisspeptin給藥后所觀察到的血清促性腺激素的分布與自然周期更為相似。綜合上述研究，kisspeptin作為一個促進卵母細胞成熟的制劑在臨床上應用前景廣闊，特別是對于OHSS高風險女性而言，可以顯著提高安全性。然而，還需要進一步的實驗來確定kisspeptin的臨床效用，比較kisspeptin和當前誘導卵母細胞成熟模式的優(yōu)劣，探尋卵子成熟的最佳觸發(fā)機制，優(yōu)化IVF治療的妊娠結局。

3 Kisspeptin調(diào)控胚胎著床

在哺乳動物著床和胎盤發(fā)育過程中，kisspeptin/KISS1R系統(tǒng)在母胎界面表達，通過多種信號通路在子宮和胎盤中參與各種生理活動[31-32]。母胎界面是母體與胎兒直接交流的界面，主要由胎兒側的滋養(yǎng)層細胞及母體側的蛻膜細胞共同構成。胚胎著床在母胎界面發(fā)生，當調(diào)節(jié)胚胎生長分化和調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性的分子程序?qū)崿F(xiàn)同步，胚泡在短暫的植入窗口期內(nèi)與子宮內(nèi)膜貼附，隨后滋養(yǎng)層細胞侵入內(nèi)膜，與蛻膜化的子宮內(nèi)膜共同組成胎盤，維持胚胎進一步發(fā)育[33]。

3.1 Kisspeptin在滋養(yǎng)層細胞中的作用

3.1.1 黏附作用：早期研究[34]表明，KISS1 和KISS1R在女性胎盤早期表達最高，隨后逐步建立了KISS1 參與早期滋養(yǎng)層著床的概念。KISS1 的表達局限于絨毛滋養(yǎng)細胞，而KISS1R的表達同時存在于絨毛滋養(yǎng)細胞和絨毛外滋養(yǎng)細胞，提示KISS1可能通過自分泌和旁分泌的方式在植入早期發(fā)揮作用[35]。TAYLOR等[36]發(fā)現(xiàn)kisspeptin以劑量和時間依賴性誘導人絨毛外滋養(yǎng)細胞（extravillous trophoblast cells,EVT）對I型膠原蛋白（人胎盤的主要成分）的黏附，這種黏附作用可能通過激活PKC和ERK途徑而發(fā)生，且抑制PKC和ERK1/2減弱了kisspeptin誘導的EVT黏附性。此外，BABWAH等[37]發(fā)現(xiàn)kisspeptin可增加小鼠胚胎對膠原蛋白I的黏附力，表明kisspeptin信號傳導是著床早期胎盤滋養(yǎng)細胞黏附作用的關鍵調(diào)節(jié)劑。

3.1.2 調(diào)控侵襲：滋養(yǎng)細胞的侵襲和癌細胞的侵襲極為相似，包括增加細胞增殖，減少細胞凋亡，增加血液供應以及局部組織的侵襲[38]。絨毛外滋養(yǎng)細胞過度侵襲會導致胎盤植入，造成不良妊娠結局。因此，精確調(diào)控絨毛外滋養(yǎng)層細胞侵襲子宮內(nèi)膜是成功著床的關鍵。Kisspeptin已被證明可以抑制癌細胞轉(zhuǎn)移，基于此，F(xiàn)RANCIS等[39]從人妊娠早期胎盤中分離到滋養(yǎng)細胞，在劃痕遷移實驗中證明kisspeptin降低了滋養(yǎng)細胞的遷移能力。RT-PCR結果顯示kisspeptin處理降低了基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMPs）1、2、3、7、9、10、14和VEGF-A的表達，增加了MMPs抑制劑1和3的表達。MMPs主要通過降解細胞外基質(zhì)中的多種蛋白，進而破壞細胞侵襲的組織學屏障，在細胞侵襲轉(zhuǎn)移中起關鍵作用[40]。VEGF-A促進侵襲過程中血管內(nèi)皮細胞的生成，抑制子宮螺旋動脈的栓塞與重塑[41]，表明kisspeptin可以通過抑制細胞遷移、降低MMPs和VEGF-A表達來抑制早期妊娠滋養(yǎng)細胞的過度侵襲。

3.2 Kisspeptin在子宮內(nèi)膜細胞中的作用 胚胎植入需要胚胎與子宮內(nèi)膜之間的精密對話，使子宮內(nèi)膜免于普通月經(jīng)周期的脫落，增生并分化為一種特殊的蛻膜組織，該過程稱為子宮內(nèi)膜蛻膜化[42]。蛻膜化過程中，子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞發(fā)生蛻膜化反應，增殖并分化為上皮樣細胞，從而形成母體蛻膜。蛻膜化后的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞具有調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細胞侵襲，抵抗炎癥反應和氧化損傷以及抑制母體局部免疫反應的獨特能力，對于妊娠的建立以及維持具有重要作用。

3.2.1 促進內(nèi)膜基質(zhì)細胞蛻膜化：ZHANG等[31]采用qPCR動態(tài)檢測小鼠KISS1/KISS1R水平，發(fā)現(xiàn)KISS1和KISS1R的mRNA及蛋白水平在妊娠早期小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞動態(tài)增加，并在體內(nèi)誘導蛻膜化。此外，在體外基質(zhì)細胞培養(yǎng)模型中，KISS1和KISS1R mRNA的表達也隨著基質(zhì)細胞蛻膜化的進展逐漸升高，使用小干擾RNA（small interfering RNA,siRNA）使KISS1的表達減弱則顯著阻斷了基質(zhì)細胞蛻膜化的過程，證明了KISS1/KISS1R系統(tǒng)參與小鼠早孕期子宮蛻膜的形成。BABA等[43]將人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞體外原代培養(yǎng)，證明了人基質(zhì)細胞體外蛻膜過程中kisspeptin的表達增加。肖伊[44]進一步開展體外人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞蛻膜化實驗，發(fā)現(xiàn)隨著蛻膜化進展，kisspeptin干預組蛻膜化標志物胰島素樣生長因子結合蛋白1（insulin-like growth factor binding protein 1,IGFBP-1）及催乳素（prolactin,PRL）表達均升高，而siRNA抑制KISS1表達后蛻膜化標志物下調(diào)。以上研究表明kisspeptin在小鼠和人基質(zhì)細胞表達且對子宮蛻膜化有促進作用。

3.2.2 促進內(nèi)膜腺上皮細胞協(xié)調(diào)作用：Forkhead box A2（FOXA2）條件性缺失使小鼠子宮腺上皮細胞缺乏白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor,LIF），胚胎植入失敗，進而導致小鼠不孕[45]。KELLEHER等[46]采用FOXA2缺陷小鼠模型，揭示子宮內(nèi)膜腺上皮細胞同步胚胎-子宮內(nèi)膜間的相互作用，通過腺上皮細胞分泌的LIF啟動胚胎-子宮通訊，協(xié)調(diào)胚胎植入時機，并影響基質(zhì)細胞蛻膜化，從而實現(xiàn)胚胎順利著床。CALDER等[47]建立KISS1（-/-）小鼠模型，發(fā)現(xiàn)著床時LIF在腺上皮細胞中微弱表達，給予外源性LIF后部分挽救了小鼠胚胎著床。表明了kisspeptin是LIF的上游調(diào)控因子，通過上調(diào)腺上皮細胞中LIF促進胚胎的植入過程。

在胚胎著床的過程中，kisspeptin在胚胎和母體雙方均有表達，且通過不同的信號通路調(diào)節(jié)細胞黏附分子、MMPs、VEGF-A、LIF等下游信號，增強胚胎對子宮內(nèi)膜的黏附作用、抑制絨毛外滋養(yǎng)層細胞過度侵襲、促進子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞蛻膜化、協(xié)調(diào)胚胎-子宮內(nèi)膜間的相互作用，在植入過程中發(fā)揮著重要作用。

4 Kisspeptin預測妊娠結局

4.1 宮內(nèi)妊娠與流產(chǎn) 澳大利亞的一項橫斷面研究，共納入176名育齡期女性，將HCG日的血清kisspeptin水平與胞漿內(nèi)精子注射（intracytoplasmic sperm injection,ICSI）后的妊娠結局相聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)血清kisspeptin水平與妊娠HCG陽性獨立相關[48]，表明HCG日測量的kisspeptin可作為ICSI后女性治療成功的標志。另有一項病例對照研究將胎齡為6～10 周宮內(nèi)妊娠（IUP組）、胎齡為6～10 周自然流產(chǎn)（SAB組）和未妊娠的婦女進行比較，發(fā)現(xiàn)妊娠組（IUP及SAB組）kisspeptin水平高于未妊娠組，IUP組的kisspeptin水平高于SAB組，表明血清kisspeptin水平能用于鑒別SAB與IUP，預估妊娠結局[49]。HU等[50]及ABBARA等[51]研究均驗證了血清kisspeptin水平在妊娠和非妊娠狀態(tài)以及持續(xù)妊娠和流產(chǎn)中存在差異，kisspeptin水平與胎齡呈正相關，流產(chǎn)患者血清kisspeptin水平與HCG值正相關。YUKSEL等[52]的研究也表明正常妊娠患者在妊娠早期的血清kisspeptin水平高于異位妊娠患者和流產(chǎn)患者。SILVA等[53]將7項病例對照研究進行系統(tǒng)回顧，綜述了kisspeptin預測早期妊娠存活的潛在作用。綜合上述研究，kisspeptin在預測妊娠結局方面具有潛在臨床應用價值，kisspeptin水平較高預示著相對較優(yōu)的妊娠結局。

4.2 復發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion,RSA）RSA是指連續(xù)2次或2次以上的自然流產(chǎn)，流產(chǎn)多發(fā)生在妊娠早期，發(fā)病率占總妊娠數(shù)的1%～5%[54]，再次妊娠發(fā)生流產(chǎn)的可能性高達30%～40%[55]。WU等[56]收集了32例RSA婦女和35例自愿流產(chǎn)婦女的滋養(yǎng)層和蛻膜組織，通過免疫組化檢測kisspeptin、KISS1R的表達，發(fā)現(xiàn)RSA女性滋養(yǎng)細胞中kisspeptin、KISS1R表達均低于對照組（P＜0.05）。RSA女性蛻膜組織中kisspeptin表達低于對照組（P＜0.01），KISS1R表達無差異。表明kisspeptin在滋養(yǎng)層和蛻膜中的表達降低可能與RSA的發(fā)生相關聯(lián)。LI等[57]比較了RSA患者和正常妊娠患者母胎界面kisspeptin/KISS1R的表達，發(fā)現(xiàn)RSA患者表達水平較低（P＜0.001）。MENG等[58]檢測KISS1基因中錯義單核苷酸多態(tài)性（SNPs），顯示rs12998 G＞A和rs4889 C＞KISS1的G變異與不明原因的RSA有關，可能是該疾病的危險因素。以上研究均表明kisspeptin水平與RSA相關，kisspeptin的降低可能是發(fā)生RSA的重要原因。由此設想，外源性kisspeptin治療可能可以通過改善RSA患者母胎界面滋養(yǎng)層和蛻膜組織的結構與功能，最終提高妊娠率。

4.3 反復移植失敗（recurrent implantation failure,RIF）RIF指移植≥3次，優(yōu)質(zhì)胚胎或多次移植胚胎數(shù)量≥10 枚，仍然未能臨床妊娠[59]，是IVF治療后胚胎移植反復不著床的結果。楊賀佳[60]對比RIF患者與正常婦女不同子宮內(nèi)膜周期KISS1/KISS1R基因的表達，發(fā)現(xiàn)增生期RIF組KISS1的mRNA的表達顯著低于對照組，分泌期RIF組KISS1R的mRNA的表達顯著低于對照組，表明RIF患者反復移植失敗可能與其子宮內(nèi)膜KISS1/KISS1R信號通路異常相關。邢晶晶[61]用RT-PCR檢測kisspeptin、KISS1R在正常妊娠女性和RIF患者植入窗期子宮內(nèi)膜上的表達和定位，發(fā)現(xiàn)kisspeptin、KISS1R在RIF患者植入窗期子宮內(nèi)膜中表達下降，可能也參與RIF患者子宮內(nèi)膜容受性的改變。由此推測，適當提高RIF患者子宮內(nèi)膜KISS1/KISS1R的表達可能可以改善RIF患者子宮內(nèi)膜容受性，提高患者胚胎移植成功率。當然，對于RIF患者具體發(fā)病機制及其與KISS1/KISS1R系統(tǒng)的相關關系有待進一步研究與明確。

5 結論與展望

中樞性kisspeptin在調(diào)控女性生殖生理過程發(fā)揮重要作用，除下丘腦之外，大腦多個區(qū)域中kisspeptin的價值也有待進一步發(fā)掘。卵巢局部表達的kisspeptin對于卵細胞成熟及排卵過程也存在重要影響。臨床上kisspeptin在IVF周期中作為“扳機”藥物的有效性和安全性均得到了初步證實，尚需更多的臨床試驗驗證其機制與制劑用法用量。而在滋養(yǎng)細胞和子宮內(nèi)膜等局部細胞和組織中的kisspeptin系統(tǒng)則通過多種信號通路，增加胚胎對子宮內(nèi)膜的黏附、抑制絨毛外滋養(yǎng)層細胞過度侵襲、促進子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞蛻膜化、協(xié)調(diào)胚胎-子宮內(nèi)膜間的相互作用從而促進胚胎的植入過程。血清kisspeptin水平還可以作為早期妊娠存活率生物標志物，預測IVF的最終結局?；趉isspeptin途徑的藥物在IVF治療中將得到廣泛應用。

有研究[4，52，62-64]表明kisspeptin水平還與多囊卵巢綜合征，多胎妊娠、異位妊娠、妊高癥、妊娠期糖尿病、妊娠滋養(yǎng)細胞瘤等妊娠相關疾病相關聯(lián)，除此之外，kisspeptin在診斷和治療OHSS、RSA、RIF等疾病中具有重要作用。相關制劑在評估和治療生殖系統(tǒng)疾病方面也具有巨大潛力，kisspeptin在生殖醫(yī)學領域?qū)⒂兄鼜V闊的應用。