羅 嫚，吳太琴，胡 夷

（畢節(jié)市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴州 畢節(jié) 551700）

大腸埃希菌是人體腸道當(dāng)中的一種正常且重要的菌群，如果機(jī)體出現(xiàn)抵抗力、免疫力下降的情況，或者是遭受細(xì)菌侵襲，且已進(jìn)入到腸道外組織器官，此時(shí)大腸埃希菌便有引起多種疾病的可能，比如肺炎、尿路感染及敗血癥等[1]。近年來，伴隨抗菌藥物種類的日漸增多，使用頻率、量的逐漸增加，使得大腸埃希菌的耐藥性也呈現(xiàn)出不斷增加的趨勢(shì)[2]；需指出的是，產(chǎn)生超廣譜β- 內(nèi)酰胺酶（ESBLs）是大腸埃希菌耐藥的典型機(jī)制。產(chǎn)ESBLs 的大腸埃希菌有多種基因型，且在各地區(qū)、不同國家之間，有著不同的流行情況[3]。為深入剖析畢節(jié)地區(qū)產(chǎn)ESBLs 大腸埃希菌的實(shí)際耐藥性情況以及基因分型情況，本文特選取本院所采集的產(chǎn)ESBLs 大腸埃希菌菌株開展藥敏試驗(yàn)，并檢測(cè)其基因分型，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

在2019 年12 月至2020 年12 月這一階段內(nèi)，以門診、住院病人為對(duì)象，共選取2217 例，對(duì)其各類標(biāo)本進(jìn)行采集（如血液標(biāo)本、膿液標(biāo)本、痰液標(biāo)本及尿液標(biāo)本等），進(jìn)行培養(yǎng)，得到大腸埃希菌菌株85 株。其中，45 株是產(chǎn)ESBLs 大腸埃希菌。對(duì)于所分離的菌株，使用甘油肉湯菌株保存液在冰箱中予以保存（-20℃）。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器 選用由法國生物梅里埃公司生產(chǎn)的VITEK 2 Compact 微生物鑒定及藥敏分析儀，杭州安譽(yù)科技有限公司生產(chǎn)的熒光定量PCR 儀（AGS4800型），法國生物梅里埃公司生產(chǎn)的革蘭陰性細(xì)菌鑒定卡及藥敏卡；選用由南京諾唯贊生物科技有限公司生產(chǎn)的質(zhì)粒提取試劑盒及由Oxoid 公司提供的ESBLs 確證藥敏紙片；采用由鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)的M-H 瓊脂平板、麥康凱平板與血平板。

1.2.2 操作方法 （1）鑒定菌株及開展藥敏試驗(yàn)。對(duì)病人感染處的標(biāo)本進(jìn)行采集，依據(jù)《臨床微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作》[4]中的相關(guān)要求，開展細(xì)菌培養(yǎng)，并進(jìn)行分純處理。用VITEK 2 Compact 微生物鑒定及藥敏分析儀、配套的藥敏卡、革蘭陰性細(xì)菌鑒定卡進(jìn)行實(shí)時(shí)鑒定，并開展藥敏試驗(yàn)。（2）ESBLs 確證試驗(yàn)。經(jīng)藥敏卡證實(shí)為產(chǎn)ESBLs 菌株后，參照雙紙片協(xié)同法〔美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）所推薦〕開展規(guī)范化的表型確證試驗(yàn)操作，即：分別用兩組紙片實(shí)施試驗(yàn)（一組為頭孢他啶及頭孢他啶/ 克拉維酸，另外一組是頭孢噻肟及頭孢噻肟/ 克拉維酸）；如果與不加克拉維酸相比，加克拉維酸后抑菌環(huán)直徑增加≥5 mm，便可明確為產(chǎn)ESBLs 菌株。質(zhì)控菌株：藥敏試驗(yàn)的質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌（ATCC27853）、大腸埃希菌（ATCC25922）；將大腸埃希菌（ATCC25922）當(dāng)作ESBLs 確證試驗(yàn)的陰性質(zhì)控菌株，而把肺炎克雷伯菌（ATCC70063）當(dāng)作其陽性質(zhì)控菌株。（3）檢測(cè)ESBLs 基因型。用質(zhì)粒提取試劑盒對(duì)45 株菌株進(jìn)行質(zhì)粒提取。基本的操作流程：將菌株保存液從冰箱中拿出，使其恢復(fù)至室溫狀態(tài)，然后轉(zhuǎn)種血平板，于特定溫度下（37℃）持續(xù)培養(yǎng)24 h；選1 個(gè)菌落，置入5 mL 肉湯管進(jìn)行增菌處理，然后用質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行菌液的質(zhì)粒提取。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，提取的質(zhì)粒保存于-20℃的環(huán)境中。對(duì)各基因型實(shí)施PCR 擴(kuò)增。分別取核酸熒光PCR 檢測(cè)混合液（n×36 μL）、擴(kuò)增酶（n×0.4 μL）（其中，n 代表的是樣本數(shù)），制作研究所需要的反應(yīng)液。將適量反應(yīng)液（36 μL）、質(zhì)粒（4 μL）加入各管當(dāng)中，實(shí)施PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增的基本條件：預(yù)溫2 分鐘（37℃），預(yù)變性2 分鐘（94℃），1 個(gè)循環(huán)；變性15 s（93℃），退火（60℃）及延伸1 分鐘，40 個(gè)循環(huán)。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，挑選陽性產(chǎn)物送至安徽通用生物股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。擴(kuò)增引物序列見表1。

表1 待測(cè)基因?qū)?yīng)的引物序列

2 結(jié)果

2.1 大腸埃希菌對(duì)于各種抗菌藥所具有的耐藥性

收集到85 株大腸埃希菌菌株，其中45 株為產(chǎn)ESBLs 菌株，占比為52.94%。經(jīng)藥敏試驗(yàn)得知，青霉烯類（厄他培南、亞胺培南）、β- 內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)方制劑（哌拉西林/ 他唑巴坦）對(duì)產(chǎn)ESBLs 菌株的抗菌作用最強(qiáng)，氨基糖苷類（阿米卡星）、硝基呋喃類的抗菌活性較強(qiáng)，磺胺類、喹諾酮類（環(huán)丙沙星、左氧氟沙星）抗菌藥的抗菌活性較弱。見表2。

表2 45 株產(chǎn)ESBLs 大腸埃希菌菌株對(duì)各抗菌藥的耐藥情況（%）

2.2 基因分型

對(duì)45 株產(chǎn)ESBLs 大腸埃希菌開展ESBLs 基因分型檢測(cè)操作，PCR 后行1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定（見圖1），挑選有條帶的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果顯示，產(chǎn)ESBLs 大腸埃希菌中攜帶CTX-M型基因的有45 株，攜帶TEM 型基因的有43 株，攜帶OXA 型基因的有32 株，攜帶SHV 型基因的有14 株，見表3。

圖1 PCR 擴(kuò)增電泳圖

表3 45 株產(chǎn)ESBLs 大腸埃希菌的基因分布情況[株(%)]

3 討論

大腸埃希菌是一種在臨床中較為常見的條件致病菌，是造成醫(yī)院感染的典型致病菌。近年來，隨著抗菌藥種類的日漸增多，相關(guān)用藥量的不斷增大，以及用藥時(shí)間的持續(xù)增加，使得大腸埃希菌的耐藥性也呈現(xiàn)出隨之增加的趨勢(shì)[5]。產(chǎn)生ESBLs 是大腸埃希菌耐藥的典型機(jī)制。ESBLs 作為一類酶，可以對(duì)多種類型的抗菌藥進(jìn)行水解，比如單酰胺環(huán)類、頭孢菌素類、青霉素類等[6-7]。產(chǎn)ESBLs 菌株早在1983 年便已經(jīng)被成功分離檢出，自此之后，其在醫(yī)院感染當(dāng)中的檢出率呈現(xiàn)出逐年且快速增加的趨勢(shì)[8]。產(chǎn)ESBLs 菌株的出現(xiàn)增加了抗感染治療的難度，受此影響，不僅會(huì)延長病人的住院時(shí)間，而且還會(huì)增加其治療費(fèi)用及痛苦，升高死亡率[9]。本研究的結(jié)果顯示，產(chǎn)ESBLs 大腸埃希菌的檢出率是52.94%，此結(jié)果高于某學(xué)者[10]的研究數(shù)據(jù)，與某報(bào)道[11]的結(jié)論相一致。究其原因，可能與地區(qū)不同、使用抗菌藥的劑量、種類等存在一定差異相關(guān)。從藥敏結(jié)果得知，對(duì)于頭孢曲松、氨芐西林等β- 內(nèi)酰胺環(huán)類藥物而言，產(chǎn)ESBLs 菌株對(duì)其耐藥率均為100%，故臨床上在選藥時(shí)，應(yīng)注意避免使用此類藥；產(chǎn)ESBLs 菌株對(duì)氨基糖苷類以及硝基呋喃類藥物的耐藥率均小于50%，臨床上可視情況使用此類藥物進(jìn)行相關(guān)治療。需要注意的是，產(chǎn)ESBLs 菌株對(duì)氨芐西林/ 舒巴坦這一β- 內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合制劑存在顯著耐藥情況，但對(duì)哌拉西林/ 他唑巴坦卻比較敏感。究其原因，可能與他唑巴坦在抑酶方面的效果較舒巴坦好、本院較少使用哌拉西林/ 他唑巴坦相關(guān)[12]。有研究指出，產(chǎn)ESBLs 菌株除了對(duì)β- 內(nèi)酰胺環(huán)類抗菌藥物的耐藥率較不產(chǎn)ESBLs 菌株高之外，對(duì)磺胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類藥物的耐藥率也較不產(chǎn)ESBLs 菌株高。究其原因，可能與編碼ESBLs的質(zhì)粒能夠同時(shí)攜帶其他多種耐藥基因有關(guān)[13]。碳青霉烯類抗菌藥主要有厄他培南、亞胺培南等。此類藥物是對(duì)多重耐藥革蘭陰性桿菌所致感染進(jìn)行治療時(shí)最佳的藥物選擇。但有研究發(fā)現(xiàn)，耐碳青霉烯類抗生素細(xì)菌的檢出率目前呈逐年上升的趨勢(shì)，需要引起重視。

現(xiàn)階段，ESBLs 的基因分型較多，除了有OXA、GES、TLA、SFO 之 外， 還 有PER、VEB、BES、TEM、SHV 及CTX-M 等[14]。本 文 圍 繞 常 見 的4 個(gè)基因分型實(shí)施檢測(cè)，即OXA、SHV、CTX-M、TEM。結(jié)果得知，檢出最多的是CTX-M 基因型，其次是TEM 基因型，此結(jié)果與相關(guān)研究[15]的結(jié)論相同。CTX-M 酶又被稱作頭孢噻肟酶，其可對(duì)頭孢曲松、頭孢噻肟進(jìn)行高度的水解，本文所得到的產(chǎn)ESBLs 基因型主要是CTX-M，原因與頭孢曲松、頭孢噻肟在臨床中被廣泛應(yīng)用相關(guān)。

綜上，畢節(jié)地區(qū)產(chǎn)ESBLs 大腸埃希菌基因型多為TEM、CTX-M 型，且還存在SHV、OXA 型；產(chǎn)ESBLs 菌株對(duì)于多種抗菌藥均存在較高的耐藥性，臨床上在選擇抗菌藥時(shí)，應(yīng)注意避免選擇上述藥物，以提高用藥的準(zhǔn)確性、合理性與有效性。