馮朋飛，畢吻吻，沈 翔，陳 辰，李乃強，b

(東華大學 a.化學化工與生物工程學院,b.紡織科技創(chuàng)新中心, 上海 201620)

堿性果膠酶一般指果膠酸裂解酶(編號為EC 4.2.2.2),可通過反式消去作用來斷裂聚半乳糖醛酸鏈的α-1,4糖苷鍵,并在非還原端生成4,5-不飽和低聚糖半乳糖醛酸鹽[1-3]。堿性果膠酶的基因序列可分為胞外pelADE家族、胞外pelBC家族以及Yersiniapseudotuberculosis和Erwiniacarotovora菌株的周質(zhì)果膠酸裂解酶4類亞家族,還有一些相對分子質(zhì)量為24 kDa的真菌果膠裂解酶[2]。以上4個家族的果膠酸裂解酶基因序列相似度在50%以上,但只有pelBC和pelADE亞家族在進化上有親緣關(guān)系[2]。對細胞外的堿性果膠酶序列同源物進行多重比對發(fā)現(xiàn),所有亞家族可能共享平行的β螺旋折疊,不同堿性果膠酶之間的差異主要在于平行的β螺旋的核心和環(huán)數(shù)量不同[3],這些差異導致堿性果膠酶等電點(pI)不同,其中PelA的pI為4.7、PelB的pI為7.7、PelC的pI為8.3、PelD和PelE的pI均大于9.5[4-5]。目前許多堿性果膠酶的晶體結(jié)構(gòu)已得到解析[6],如Erwiniachrysanthemi的PelC[7]、Azospirillumirakense的PelA[8]、Cellvibriojaponicus的Pel10Acm[9]等。

自1972年首次發(fā)現(xiàn)堿性果膠酶[10]以來,對堿性果膠酶的異源表達和應用逐漸成為研究熱點。產(chǎn)生堿性果膠酶的菌株主要有Bacillussp.[11-12]、Erwinia.sp.[13]、Aspergillus.sp.[14]、Aspergillus.sp.[15-16]等。近年對堿性果膠酶表達和分子改造的研究也越來越多,如桂習武[17]對短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)中堿性果膠酶基因進行克隆表達,利用定點突變和易錯聚合酶鏈式反應(PCR)技術(shù)對酶進行分子改造得到良好的突變體,并用于提取枸杞多糖。史文敬[18]將Bacillussubtilis7-3-3的堿性果膠酶PelA和PelC應用于苧麻脫膠中,發(fā)現(xiàn)這兩種酶共表達具有一定的協(xié)同作用,不僅可以提高木聚糖酶、甘露聚糖酶的活力,而且在處理苧麻纖維過程中提高了脫膠率,并改善了纖維的分散性和白度。

雖然堿性果膠酶的研究較多,但是針對地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)的堿性果膠酶PelA的研究較少,如:劉連成等[19]在大腸埃希菌中表達了B.licheniformisDG-3的pelA基因;Zhou等[20]對比了Bacilluslicheniformis91的PelA與其他芽孢桿菌的氨基酸差異,用大腸埃希菌異源表達pelA基因,探索了其耐堿、耐熱特性。大腸埃希菌雖然是蛋白表達的理想宿主,但是在工業(yè)應用時,尤其在過表達重組酶時,需要破碎細胞,工序繁瑣,這限制了其工業(yè)應用?？莶菅挎邨U菌與Bacilluslicheniformis同為芽孢桿菌屬,屬于非致病菌,兩者均具有遺傳背景清晰、分子操作工具成熟、分泌蛋白能力突出的優(yōu)點,是理想的重組蛋白表達宿主。此外,地衣芽孢桿菌堿性果膠酶PelC的氨基酸序列和PelA幾乎無同源性,它們的酶學性質(zhì)可能具有較大差異,目前未見相關(guān)研究報道?；谝陨涎芯勘尘凹安煌腹脖磉_具有協(xié)同增效的特點,以筆者實驗室保存的B.licheniformisX-01的堿性果膠酶基因pelA和pelC為研究對象,對相關(guān)的質(zhì)粒載體、表達元件和宿主進行優(yōu)化,以提高其異源表達的水平和堿性果膠酶酶活。對堿性果膠酶在不同宿主中的酶學性質(zhì)差異進行對比,挖掘堿性果膠酶的耐溫、耐熱工業(yè)應用屬性,為其后續(xù)在高表達酶活和大麻脫膠方面的應用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

筆者實驗室保存的B.licheniformisX-01用于提取全基因組作為目的基因擴增模板,E.coliBL21和B.subtilis168分別作為宿主。質(zhì)粒載體pUC57,穿梭質(zhì)粒載體pHY-P43用于重組酶的構(gòu)建。E.coliBL21、B.subtilis168和pUC57均為筆者實驗室保存的菌株和質(zhì)粒,pHY-P43購自湖南豐暉生物科技有限公司,聚半乳糖醛酸購自上海凜恩科技發(fā)展有限公司,DNA提取試劑盒、NormalRunTM250bp-IV DNA ladder ready-to-use、2×PCR Master Mix、10×buffer、Taq DNA Polymerase購自上海捷瑞生物工程有限公司,ClonExpress?II One Step Cloning Kit購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司,瓊脂糖購自上海生工生物工程股份有限公司,酵母粉、胰蛋白胨、氯化鈉等常用試劑均為國產(chǎn)化分析純試劑。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2 試驗方法

1.2.1 堿性果膠酶pelA和pelC基因的擴增

利用NCBI網(wǎng)上BacilluslicheniformisATCC 14580[21]的pelA(GenBank No. AAU42942.1)和pelC(GenBank No. AAU40308.1)基因序列設計引物,以B.licheniformisX-01全基因組為模板,通過PCR擴增pelA和pelC基因。PCR程序條件:98 ℃預變性5 min;98 ℃變性10 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸75 s,30個循環(huán);72 ℃再延伸7 min,4 ℃保存。用質(zhì)量分數(shù)為1%的瓊脂糖凝膠對上述PCR程序的產(chǎn)物電泳進行檢測,并交予上海生工生物有限公司進行測序。

1.2.2pelA和pelC重組質(zhì)粒的構(gòu)建

按照一步法克隆試劑盒說明書的操作步驟構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC57-pelA、pUC57-pelC、pHY-P43-pelA、pHY-P43-pelC。通過菌落PCR、酶切驗證和測序驗證重組質(zhì)粒構(gòu)建是否成功。

1.2.3pelA和pelC重組質(zhì)粒的表達

將pUC57-pelA、pUC57-pelC分別轉(zhuǎn)化至E.coliBL21中進行表達;然后挑取陽性單菌落至5 mL的LB(Luria-Bertani)液體培養(yǎng)基(含100 μg/mL的氨芐西林)試管中,于旋轉(zhuǎn)式搖床進行過夜培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為37 ℃,搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min,并設一組pUC57空載體轉(zhuǎn)化子E.coliBL21-pUC57作為對照。取1 mL過夜培養(yǎng)物置于裝有100 mL的LB液體培養(yǎng)基(含100 μg/mL的氨芐西林)的搖瓶中,于旋轉(zhuǎn)式搖床進行發(fā)酵培養(yǎng)24 h,發(fā)酵溫度37 ℃,搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min。將培養(yǎng)后的發(fā)酵液進行離心(離心溫度為4 ℃,離心速度為6 000 r/min,離心時間為20 min),棄掉離心后的上清液,用10 mL濃度為0.2 mol/L的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH=9.0)重懸,超聲破碎細胞20 min后,再離心20 min,測定上清液的堿性果膠酶酶活。

將質(zhì)粒pHY-P43-pelA用BamHI單酶切,按第1.2.2節(jié)中步驟進行重組質(zhì)粒的構(gòu)建。通過菌落PCR、酶切、測序驗證后,轉(zhuǎn)入B.subtilis168中進行表達。挑取陽性單克隆裝于含有5 mL的LB液體培養(yǎng)基(含5 μg/mL的四環(huán)素)的試管中,置于旋轉(zhuǎn)式搖床進行過夜培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為37 ℃,搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min。用過夜培養(yǎng)的種子液按體積分數(shù)為4%的接種量接入裝有50 mL的LB培養(yǎng)基(含5 μg/mL的四環(huán)素)的搖瓶中,置于旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)24 h,培養(yǎng)溫度為37 ℃,搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min,發(fā)酵結(jié)束后,按照第1.2.3節(jié)對發(fā)酵液進行處理,測定發(fā)酵液的堿性果膠酶酶活,并進行SDS-PAGE凝膠電泳鑒定。

1.2.4 重組質(zhì)粒pHY-P43-pelA-pelC的共表達

將pHY-P43-pelA、pHY-P43-pelC分別轉(zhuǎn)化至B.subtilis168中,轉(zhuǎn)化方法參照Berensmeier等[22]的轉(zhuǎn)化方法:挑取單克隆裝于含有5 mL的LB液體培養(yǎng)基(含有5 μg/mL的四環(huán)素)的試管中,將試管置于旋轉(zhuǎn)式搖床過夜培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為37 ℃,搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min,并設置一組pHY-P43空載體轉(zhuǎn)化子B.subtilis168-pHY-P43作為對照組。取1 mL過夜培養(yǎng)液置于裝有100 mL的LB液體培養(yǎng)基(含5 μg/mL的四環(huán)素)的搖瓶中,于旋轉(zhuǎn)式搖床進行發(fā)酵培養(yǎng)24 h,發(fā)酵溫度為37 ℃,搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min。將培養(yǎng)后的發(fā)酵液進行離心(離心溫度為4 ℃,離心速度為6 000 r/min,離心時間為20 min),得到上清液,測定上清液的堿性果膠酶酶活(胞外酶酶活);將沉淀溶液用10 mL濃度為0.2 mol/L的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH=9.0)重懸,利用超聲破碎細胞20 min后,再離心20 min,取上清液,測定上清液的堿性果膠酶酶活(胞內(nèi)酶酶活),并進行SDS-PAGE凝膠電泳鑒定。

1.2.5 堿性果膠酶活力測定

用濃度為0.2 mol/L的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH=9.0)溶解聚半乳糖醛酸配置底物溶液,其中聚半乳糖醛酸的質(zhì)量分數(shù)為0.2%。取2 mL底物溶液于溫度為45 ℃的恒溫水浴鍋中預熱5 min,隨后取20 μL稀釋的發(fā)酵液和底物溶液混合均勻,并置于溫度為45 ℃的恒溫水浴鍋中反應15 min,再加入3 mL濃度為0.03 mol/L的磷酸溶液以終止反應,用紫外-可見光分光光度計測定反應液235 nm處的吸光度。以滅活酶液作為空白對照。一個標準酶活單位(1 U)定義為1 min使聚半乳糖醛酸裂解產(chǎn)生1.0 μmol/L 的不飽和半乳糖醛酸的酶量。

1.2.6 酶學性質(zhì)研究

在pH 值為9.0、溫度為35～90 ℃條件下測定堿性果膠酶酶活,確定酶的最適反應溫度;在溫度為45 ℃時,用pH值為7～12的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液測定酶活,確定酶的最適反應pH值;將發(fā)酵液分別置于35～60 ℃下保溫60 min,測定發(fā)酵液殘留酶活,確定酶的熱穩(wěn)定性。選擇最適反應溫度和最適反應釜pH值,并分別添加濃度為0.1 mmol/L的不同金屬離子于發(fā)酵液中,測定發(fā)酵液的堿性果膠酶酶活,考察不同金屬離子對酶活的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 pelA和pelC基因的擴增及重組質(zhì)粒的構(gòu)建

B.licheniformis的pelA和pelC基因的測序結(jié)果表明,所測序列與GenBank中報道的B.licheniformisATCC 14 580菌株pelA和pelC基因序列同源性為99%[21]。B.licheniformis的pelA和pelC對應的酶蛋白為一個完整的開放閱讀框,長度分別為1.0和1.3 kb,pelA和pelC基因分別編碼一個含341和435個氨基酸殘基的蛋白酶,相對分子質(zhì)量分別為34.5和45.2 kDa,信號肽預測表明PelA和PelC分別含有27和24個氨基酸的分泌信號肽。通過Blast比對發(fā)現(xiàn),B.licheniformisX-01的PelA與芽孢桿菌屬的PelA具有高同源性,與嗜堿芽孢桿菌的BliPelA(GenBank No. KX 440 958)、Bacilluslicheniformis(GenBank No. WP_144 654 533)、Bacillushaynesii(GenBank No. WP_182 069 822.1)、Bacillusparalicheniformis(GenBank No. WP_043 926 874.1)、Bacillussubtilis(GenBank No. WP_186 438 738.1)的相似性分別為98.24%、99.7%、98.53%、97.95%、97.96%。地衣芽孢桿菌的PelC與枯草芽孢桿菌的PelC無明顯同源性。

PCR擴增產(chǎn)物如圖1(a)所示。重組質(zhì)粒pUC57-pelA、pUC57-pelC、pHY-P43-pelA、pHY-P43-pelC雙酶切鑒定結(jié)果如圖1(b)和1(c)所示。PCR擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳圖(見圖1(a))上于1.1和1.3 kb的位置有一明顯條帶,與預期基因大小一致。由圖1(b)可看出:泳道1和泳道2處均有約1 kb的條帶分別為pelA和pelC,約2 kb的條帶為酶切的質(zhì)粒骨架,兩者電泳條帶均與理論位置一致。由圖1(c)可看出:泳道1為重組質(zhì)粒pHY-P43-pelA的酶切片段,在1.1和5.0 kb處有2個明顯條帶;泳道2為重組質(zhì)粒pHY-P43-pelC的酶切片段,在1.3和5.0 kb處有2個明顯條帶。兩者電泳條帶均與理論位置一致。菌落PCR鑒定所選轉(zhuǎn)化子為陽性轉(zhuǎn)化子。pHY-P43-pelA、pHY-P43-pelC在B.subtilis168中表達的SDS-PAGE電泳圖如圖1(d)所示。由圖1(d)可看出:泳道1、2均在33.0 kDa左右有一明顯條帶,說明pelA得到很好的表達;泳道5、6則均未在45.0 kDa處看到明顯條帶,可能是因為pelC表達過弱。

圖1 pelA和pelC基因的鑒定與表達Fig.1 Identification and expression of pelA and pelC genes

2.2 重組質(zhì)粒pHY-P43-pelA-pelC的共表達

重組質(zhì)粒啟動子P43為枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)的常用強啟動子,通過BamHI單酶切后,利用試劑盒將pelC基因連接至pelA基因后面,使穿梭質(zhì)粒載體在B.subtilis168中共表達(見圖2)。對陽性克隆進行菌落PCR鑒定,圖3(a)為菌落PCR驗證結(jié)果,在2 400 bp處有一明顯條帶,與理論pelA-pelC(2 378 bp)基因大小一致。由于pelC基因內(nèi)部有1處BamHI酶切位點,因此通過BamHI單酶切理論上有3個條帶(見圖3(b)),泳道2的3個條帶均符合BamHI酶切后片段數(shù)目和大小。通過上海生工生物有限公司測序驗證pHY-P43-pelA-pelC基因正確,表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將重組質(zhì)粒pHY-P43-pelA-pelC基因轉(zhuǎn)入B.subtilis168中共表達,利用搖瓶發(fā)酵測定發(fā)酵液堿性果膠酶活。從圖3(c)可以看出,重組酶BsPelA和BsPelC蛋白均已表達。發(fā)酵液堿性果膠酶的總酶活為14.6 U/mL,與僅表達pHY-P43-pelA的重組菌發(fā)酵液相比,總酶活提高了24.8%。

圖2 重組質(zhì)粒pHY-P43-pelA-pelC構(gòu)建Fig.2 Construction of recombinant plasmid pHY-P43-pelA-pelC

圖3 pHY-P43-pelA-pelC基因的鑒定和表達Fig.3 Identification and expression of pHY-P43-pelA-pelC gene

2.3 不同宿主的重組堿性果膠酶PelA和PelC的酶學性質(zhì)

2.3.1E.coliBL21為宿主的重組堿性果膠酶的酶學性質(zhì)

按照第1.2.5節(jié)中步驟測定重組菌E.coliBL21-pUC57-pelA發(fā)酵液的酶活,折合到發(fā)酵液中的堿性果膠酶酶活為10.5 U/mL,說明pelA基因可在大腸成功表達并具備活性,該結(jié)果與劉連成等[19]采用大腸埃希菌異源表達BacilluslicheniformisDG-3的重組酶PelA酶活(12 U/mL)相近。E.coliBL21-pUC57-pelC與含有空質(zhì)粒的對照菌株E.coliBL21-pUC57均無堿性果膠酶活性。對宿主為E.coliBL21的堿性果膠酶EcPelA酶學性質(zhì)進行研究,結(jié)果如圖4～7所示。由圖4可知,重組堿性果膠酶EcPelA的最適反應溫度為75 ℃,高于現(xiàn)有研究中的嗜堿地衣芽孢桿菌的PelA(溫度為70 ℃)[20]和B.licheniformis14A的PelA(溫度為65 ℃)[21],這對于需要高溫、高pH值環(huán)境進行大麻脫膠是非常有利的。由圖5可知,重組酶EcPelA在溫度為35～50 ℃時具有良好的熱穩(wěn)定性,酶活均保持在90%以上,但當溫度為60 ℃時,該酶迅速失活。由圖6可知,重組菌E.coliBL21中重組堿性果膠酶EcPelA的最適反應pH值為11,與BliPelA和B.licheniformis14A的PelA相似。由圖7可知,Mg2+對重組酶具有激活作用,相對酶活達到110%。Cu2+、Fe2+、Zn2+、Mn2+對重組酶EcPelA均有不同程度的抑制作用,其中Fe2+對重組酶PelA抑制效果最為顯著。

圖4 溫度對重組酶EcPelA的影響Fig.4 The effect of temperature on recombinase EcPelA

圖5 重組酶EcPelA的熱穩(wěn)定性Fig.5 Thermal stability of recombinase EcPelA

圖6 pH值對重組酶EcPelA的影響Fig.6 The effect of pH on recombinase EcPelA

圖7 金屬離子對重組酶EcPelA的影響Fig.7 The effect of metal ions on recombinase EcPelA

2.3.2B.subtilis168為宿主的重組堿性果膠酶的酶學性質(zhì)

采用強啟動子P43,將pelA和pelC基因分別和穿梭質(zhì)粒pHY進行Gibson無縫重組,并轉(zhuǎn)化至B.subtilis168中進行發(fā)酵,重組堿性果膠酶BsPelA的胞外酶活和胞內(nèi)酶活分別為7.0和 4.7 U/mL,重組堿性果膠酶BsPelC的胞外酶活為4.1 U/mL,表明pelA和pelC基因在B.subtilis168成功表達并具備活性。發(fā)酵液的堿性果膠酶的酶學性質(zhì)分析如圖8～11所示。

圖8 溫度對重組酶BsPelA和BsPelC的影響Fig.8 The effect of temperature on recombinase BsPelA and BsPelC

重組酶BsPelA和BsPelC在枯草芽孢桿菌中最適反應溫度均為60 ℃(見圖8)。熱穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明,BsPelA和BsPelC在溫度為35～55 ℃保溫1 h,相對酶活均在90%以上(見圖9)。在溫度為55～60 ℃時,重組酶BsPelC酶活下降比BsPelA慢,說明BsPelC的熱穩(wěn)定性比BsPelA好。堿性果膠酶在不同表達系統(tǒng)中酶學性質(zhì)不同,這可能是由大腸埃希菌和枯草芽孢桿菌的蛋白修飾系統(tǒng)不同所導致的。

圖9 重組酶BsPelA和BsPelC的熱穩(wěn)定性Fig.9 Thermal stability of recombinase BsPelA and BsPelC

重組酶BsPelA和BsPelC的最適pH值分別為11和10(見圖10),Mg2+、Ca2+對BsPelA和BsPelC均有激活作用,其中Ca2+使相對酶活達到了116%和141%,這與在大腸埃希菌表達系統(tǒng)中Ca2+對EcPelA沒有促進作用是不同的,相關(guān)機制需要進一步研究。Cu2+、Zn2+對BsPelA和BsPelC的酶活有明顯的抑制作用,相對酶活分別下降到30%和47%。

圖11 金屬離子對重組酶PelA和PelC的影響Fig.11 The effect of metal ions on recombinase PelA and PelC

3 結(jié) 論

本研究通過選擇合適的質(zhì)粒載體、強啟動子和遺傳背景清晰的表達宿主,實現(xiàn)pelA和pelC基因的異源表達和共表達,提高了堿性果膠酶的酶活,并研究了不同宿主的堿性果膠酶的酶學性質(zhì)。

(1)構(gòu)建的強啟動子共表達穿梭質(zhì)粒pHY-P43-pelA-pelC轉(zhuǎn)化至B.subtilis168,使堿性果膠酶的酶活比對照提高了24.8%。

(2)以大腸埃希菌為表達宿主時,B.licheniformisX-01的重組堿性果膠酶 PelA最適溫度為75 ℃,高于嗜堿地衣芽孢桿菌的PelA最適溫度(70 ℃)[20]和B.licheniformis14A的PelA最適溫度(65 ℃)[22],這和大麻脫膠要求的高溫、高堿性的應用環(huán)境是相符合的,具有一定的應用價值。

(3)宿主分別為E.coliBL21和B.subtilis168兩種重組酶PelA的最適溫度為75和60 ℃,且以B.subtilis168為宿主時,Ca2+對重組酶PelA和PelC的酶活均有明顯促進作用。

(4)地衣芽孢桿菌的PelC的酶學性質(zhì)和地衣芽孢桿菌的PelA類似,其熱穩(wěn)定性優(yōu)于PelA。

目前,來自地衣芽孢桿菌的堿性果膠酶酶活低是普遍存在的問題,后續(xù)研究將進一步對其表達系統(tǒng)和發(fā)酵工藝進行優(yōu)化,并控制兩種基因的表達水平,以更好地滿足其工業(yè)應用。