李雯,肖小麗,龔藝,曲偉紅,趙建國,姜登釗,何剛

(九江學院 藥學與生命科學學院,江西 九江 332005)

香加皮和五加皮均為常用的具有利水消腫、祛風濕功效的傳統(tǒng)中藥。香加皮習稱“北五加皮”,來源于蘿藦科植物杠柳PeriplocasepiumPunge.的干燥根皮,五加皮習稱“南五加皮”,來源于五加皮來源于五加科細柱五加AcanthopanaxgracilistylusW.W.Smith 的干燥根皮[1]。二者來源不同,而且化學成分、功效和藥理作用不完全相同[2-3],但外形性狀觀彼此相似,容易混淆。而市場上人們?；煜慵悠?、五加皮和地骨皮,導致相互替代使用較為廣泛[4-5]。這對藥材的鑒別和臨床合理正確使用造成困難。文獻常采用鑒別方法有性狀鑒別、顯微鑒別、薄層色譜法[1]、高效液相色譜法[6-7]、DNA條形碼技術[8]和HS-SPME-GC-MS法[9]等,未見采用紅外光譜法鑒別香加皮和五加皮的文獻報道。紅外指紋圖譜能反映中藥中化學成分組成及其含量的整體信息,具有操作簡單、快速而無損傷等特點,現(xiàn)已廣泛用于藥材真?zhèn)舞b別、道地性識別和中藥配方顆粒的質量控制[10]等領域。擬采用紅外光譜結合聚類分析法和雙指標分析法對香加皮和五加皮樣品分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 儀器

傅立葉變換紅外光譜儀(VERTEX 70,Burker公司),手提式中藥粉碎機(SL-100,浙江省永康市松青五金工具廠),電熱恒溫干燥箱(DHG-9145A,上海一恒科學儀器有限公司),電子分析天平(BT-224S,賽多利斯科學儀器有限公司)。

1.1.2 材料

22批藥材(S1樣品為生藥學實驗室留存8年的樣品,其他樣品均購買于市場上不同的藥店和藥材公司,貯存時間在使用日期之內,樣品信息見表1,經(jīng)曲偉紅副教授生藥鑒定);溴化鉀(KBr,光譜純)。

表1 樣品來源信息

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備

取樣品于60 ℃干燥5 h后,粉碎,過200目篩(孔徑:0.074 mm)。取適量細粉與KBr粉末(質量比約為1∶150)壓片。

1.2.2 紅外光譜測定

掃描范圍4 000～400 cm-1,分辨率4 cm-1,靈敏度5,掃描次數(shù)32次,基線校正和歸一化處理,去除水分和CO2的干擾,得到一維紅外指紋圖譜和吸收峰數(shù)據(jù)。二階導數(shù)紅外光譜圖和吸收峰數(shù)據(jù)采用紅外光譜儀自帶OPUS紅外分析軟件獲得,平滑點為32,靈敏度為2。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 聚類分析法

提取1 800～400 cm-1范圍內吸收峰的位置和吸收強度明顯差異的波段區(qū)間透光率值,作為聚類分析的原始數(shù)據(jù),采用OriginPro.v8.6.SR3軟件進行系統(tǒng)聚類分析。

1.3.2 雙指標序列分析法[11]

共有峰率P=(Ng/Nd)×100%,變異峰率Pva=(Na/Ng)×100%,變異峰率Pvb=(Nb/Ng)×100%。其中:Ng是共有峰,紅外指紋圖譜中都出現(xiàn)的吸收峰;Nd是獨立峰:在紅外指紋圖譜中所有出現(xiàn)的不同吸收峰,Na和Nb分別是圖譜a和b的變異峰,指紋圖譜a或b中相對于其共有峰的非共有峰數(shù)。

2 實驗結果與討論

2.1 方法學考察

2.1.1 精密度試驗

分別取S1和S9樣品片,連續(xù)掃描5次,同一樣品所得圖譜基本一致,以共有峰波數(shù)計算,相關系數(shù)均大于0.999 8,RSD均小于1%。

2.1.2 重復性試驗

分別取S1和S9樣品,各制備5片樣品片進行掃描,同一樣品所得圖譜基本一致,以共有峰波數(shù)計算,相關系數(shù)均大于0.999,RSD均小于2%。

2.1.3 穩(wěn)定性試驗

分別取同一份S1和S9樣品片,每隔1 h測定一次,共4次,同一樣品所得圖譜基本一致,以共有峰波數(shù)計算,相關系數(shù)均大于0.999,RSD均小于5%,表明樣品片在4 h內穩(wěn)定。

2.2 樣品一維紅外指紋圖譜結果

各樣品的一維紅外指紋圖譜見圖1,看出樣品間紅外光譜圖整體的峰形和峰位較相似,但在1 800～400 cm-1范圍內指紋圖譜差異較明顯。

圖1 樣品的一維紅外指紋圖譜

所有樣品的共有峰高達10個(共有峰的確定見2.4.1項下),分別是3 422(3 386),2 924(2 937),1 622,1 375,1 318,1 264(1 243),1 152,1 025,778(781)和528(518)cm-1。香加皮正品還有3個共有峰,分別是2854,1 737和1 428 cm-1,除S1外均另有1 516,860和578 cm-1處3個吸收峰;五加皮正品還有5個共有峰,分別是1 514,1 080,859,662和577 cm-1;地骨皮正品還有4個共有峰,分別是3 348,3 070,1 444和666 cm-1。混偽品具有正品的部分或全部吸收峰。

3 500～3 200 cm-1的峰強而寬,為O-H、N-H伸縮振動峰。2 924 cm-1為亞甲基的C-H伸縮振動峰,1 622 cm-1可能是C=C(烯烴或苯環(huán)骨架)、C=O的伸縮振動峰或者酰胺I帶吸收峰,1 514 cm-1屬于苯環(huán)骨架振動,1 375 cm-1為甲基和亞甲基C-H的彎曲振動峰,1 318 cm-1屬于C-O或C-N伸縮振動的特征峰,1 264(1 243)cm-1屬于C-O(酚羥基、醇羥基等)的伸縮振動,或C-H的彎曲振動峰,1 152,1 025 cm-1屬于C-O(酚羥基、醇羥基、內酯和醚)的伸縮振動峰,860,778(781) cm-1為糖環(huán)振動和 C-H面外彎曲振動峰。1 622,1 318和778(781)cm-1三尖峰分別是草酸鈣中C-O反對稱、對稱伸縮振動和彎曲振動峰。1 152,1 080,1 025和860 cm-1處附近的階梯峰是淀粉中C-O伸縮振動和糖環(huán)振動吸收峰。表明各藥材化學成分組成具有相似性。

2 854,1 737,1 428cm-1處的3個吸收峰為香加皮正品的最重要的鑒別特征峰組,屬于脂肪酸酯類成分的亞甲基的C-H和C=O(內酯)的伸縮振動峰以及C-H彎曲振動;1 080,860和664 cm-1處的3個吸收峰為五加皮的最重要鑒別指紋峰組,為糖環(huán)振動、C-H面外彎曲振動峰和芳環(huán)C-OH面內彎曲,其中1 080cm-1為水溶性多糖的C-O-C的伸縮振動;而 3 345、3 070和1 444 cm-1附近出現(xiàn)3個特征吸收峰為地骨皮的最重要鑒別特征峰組,分別為O-H或N-H、烯烴或芳香環(huán)C=C-H伸縮振動、苯環(huán)骨架振動或酰胺II帶吸收峰[12]。由此可見,香加皮合格正品有機酸類、芳香化合物及其苷類成分特征明顯,不合格品芳香性成分則明顯降低。五加皮正品水溶性多糖(苷類)和有機酸類成分特征更明顯[3]。而地骨皮正品中生物堿、烯烴、酰胺類和芳香化合物特征更明顯[12]。此結果與文獻報道香加皮主要的化學成分為 C21 甾體苷、強心苷、萜類、醛類、有機酸等,五加皮主要含有揮發(fā)油、三萜皂苷類和有機酸等成分結果相符[13-14]。

2.3 二階導數(shù)紅外指紋圖譜結果

由于二階導數(shù)光譜分辨率提高,峰尖銳程度增大,能將一維圖譜中的肩峰和重疊峰區(qū)分,峰數(shù)量亦顯著增多。香加皮和五加皮在4 000～400 cm-1范圍內二階導數(shù)紅外指紋圖譜均有29個較明顯的吸收峰(見圖2和圖3)。盡管二者吸收峰的峰位很相似,但峰形差異明顯,尤其是3 000～2 800 cm-1(峰1和2)、1 800～1 600 cm-1(峰3至峰6)和720～520 cm-1(峰22至峰27)的峰形、峰位和峰強度差異更明顯,可作為鑒別依據(jù)。而S1缺乏1 664,1 600 cm-1,并1 578,1 027,1 006,593,551和442 cm-1處產(chǎn)生新吸收峰,進一步確認其芳香性成分含量明顯下降。

峰1～29的峰位依次:2 922,2 852,1 743,1 664,1 621,1 600,1 513,1 462,1 423,1 372,1 319,1 238,1 160,1 108,1 080,1 054,990,923,888,781,718,668,644,620,576,518,467和432 cm-1。

峰1～29的峰位依次為:2 927,2 852,1 743,1 694,1 664,1 621,1 513,1 462,1 423,1 372,1 319,1 238,1 160,1 108,1 080,1 054,990,923,888,781,718,668,638,610,576,518,467和432 cm-1。

混偽品的峰形和峰位與正品較為相似(見圖4),其中S22與香加皮正品圖譜峰形基本一致,S19與五加皮正品圖譜峰形基本一致,而S18、S20與地骨皮正品的圖譜峰形更接近。

圖4 樣品S16-S22的二階導數(shù)紅外指紋圖譜

2.4 聚類分析結果

由圖1可知,樣品中紅外指紋圖譜在1 800～400 cm-1范圍內差異較明顯,故提取該波段區(qū)間透光率值,作為聚類分析的原始數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)聚類分析,結果見圖5。當距離約為0.05時,可將樣品分成四類:S1和混偽品S21,混偽品S22和香加皮正品S2～S8,混偽品S19和五加皮正品S9～S15,混偽品S18和S20和地骨皮正品S16和S17分別聚成一類。由此可見,聚類分析大體上能夠將樣品進行區(qū)分。

圖5 樣品聚類分析結果

2.5 雙指標序列法結果

2.5.1 共有峰的確定

因為儀器的分辨率是4 cm-1,所以兩個峰位相差8 cm-1以內的一組峰即為共有峰。在表2中,多數(shù)情況明顯符合此原則,可以明確判斷為共有峰。3 500～3 200 m-1范圍的寬峰為N-H、O-H的伸縮振動峰,單峰的認為是同一個共有峰,出現(xiàn)雙峰的屬于兩個共有峰。另從各樣品指紋圖譜峰形和峰位來看,兩個峰位相差20 cm-1以上的一組峰屬于獨立峰。根據(jù)以上原則,確定表2中在同一列的吸收峰為共有峰。

表2 樣品的一維紅外光譜吸收峰數(shù)

2.5.2 共有峰率和變異峰率雙指標序列

分別以各樣品為參照,計算其他樣品相對該樣品的共有峰率和變異峰率,用(P,Pva,Pvb)表示,共有峰率越大,表示樣品間的親緣關系越近,而變異峰率越大,表示樣品間發(fā)生的變異越大。按照共有峰率值排序得到22批樣品的雙指標序列如表3。

表3 一維紅外指紋圖譜共有峰率和變異峰率雙指標序列分析結果 單位/%

香加皮正品(S1除外)間共有峰率為100%～83.33%,五加皮正品間共有峰率為100%～93.75%,而地骨皮正品間共有峰率為100%～82.3%[12]。香加皮、五加皮與地骨皮正品間共有峰率均小于72.22%。而混偽品與正品間的共有峰為93.75%～47.62%。

2.5.3 基本關系組、對及分析

根據(jù)建立的雙指標序列,可以對22批樣品進行基本的分組,在最相似樣品對、組中,按共有峰率高低將它們分成3組:

A組:S2:S7(100,0,0),S4:S6S22(100,0,0),S5:S8,S9:S10S11S12S13S15S19(100,0,0)。

B組:S2S5S7S8:S4S6S22(94.12,6.25,0.00),S2S7:S5S8(88.89,6.25,6.25),S2S7:S27(88.24,13.33,0.00),S3:S4S6S22(88.24,6.67,6.67),S3:S2 S5S7S8S21(83.33,6.67,13.33),S3:S27 (82.35,14.29,7.14),S9S10S11S12S13S15S19:S14 (93.75,0.00,6.67),S16:S20 (93.75,0.00,6.67),S16:S17S18 S26 (82.35,7.14,14.29),S20:S18S26 (88.24,6.67,6.67),S23:S24S27 (93.75,6.67,0.00),S23:S26 (88.24,6.67,6.67),S24:S26 (93.75,0.00,6.67),S24:S14S20 (82.35,7.14,14.29),S24S25:S27 (87.50,7.14,7.14),S25:S4S6S22S23 (82.35,7.14,14.29),S26:S27 (82.35,7.14,14.29)。

C組:S1:S14S20 (55.00,36.36,45.45),S1:S9S10S11S12S13S15S19 (50.00,50.00,50.00),S1:S18 (47.62,50.00,60.00),S2S7S21:S17 (50.00,54.55,45.45),S3:S17 (52.38,45.45,45.45),S4S6S22:S16 (55.00,45.45,36.36),S4S6S22:S17 (45.45,60.00,60.00),S5S8:S14S26 (57.14,41.67,33.33),S5S8:S17 (43.48,70.00,60.00),S9S10S11S12S13S15S16S19:S25 (57.89,36.36,36.36),S9S10S11S12 S13S15S19:S17 (55.00,36.36,45.45),S16:S2S5S7S8 (52.38,36.36,54.55),S20:S2S5S7S8 (57.14,33.33,41.67),S21:S14S18 (57.14,41.67,33.33)。

在A組中,此組中S2與S7,S4與S6S22,S5與S8,S9與S10S11S12S13S15S19間共有峰率為100%,變異峰率0%,表明該組樣品間共有峰率極高,變異峰率極低,樣品間親緣關系非常近。

在B組中,樣品間的共有峰率為80%～95%,變異峰率為0%～15%,表明樣品間的親緣關系較近。該組樣品主要來源于各正品樣品間、正品與混偽品、混偽品兩兩比較。表明各正品樣品可能受產(chǎn)地、氣候、生長環(huán)境的影響,發(fā)生了微小的變化?；靷纹放c某些正品相似度較高。

C組中,共有峰率均很低(<58%),且變異峰率均較高(30%～70%)。該組樣品主要是S1與其他樣品、香加皮正品與地骨皮正品、五加皮正品與地骨皮正品之間的共有峰率和變異峰率情況。

結果表明香加皮合格正品間、五加皮合格正品間的親緣關系很近,變異較小。但二者及其混偽品間的親緣關系較遠,發(fā)生了較大的變異。另外S1因為貯存時間長,其化學組成發(fā)生了明顯的變化,導致與正品間共有峰率大大降低(72.22%～60.00%)。

3 討論

在藥材市場上,五加皮、香加皮和地骨皮常被混用,但它們之間的化學成分與藥理作用有較大差別,香加皮甚至有毒。為確保藥材的準確性,應制定合理的鑒別方法,以提高中藥材的質控水平。本文首次采用傅里葉變換紅外光譜法結合聚類分析法和雙指標序列法比較了市售中藥香加皮、五加皮和地骨皮樣品,結果表明香加皮和五加皮合格正品的紅外指紋圖譜具有明顯的特征,可以作為鑒別正品及其是否合格的依據(jù)。本實驗建立的紅外光譜法具有簡便、快速和無損樣品等優(yōu)點,為香加皮、五加皮的鑒別提供了一種新方法,為其質量評價、制劑開發(fā)和臨床合理用藥提供參考。

根據(jù)香加皮、五加皮和地骨皮正品一維和二階紅外指紋圖譜的峰形和峰位、聚類分析和雙指標序列分析的結果,發(fā)現(xiàn)當作香加皮售賣的S18和S19的紅外光譜特征與分別與地骨皮和五加皮正品相符,而當作五加皮售賣的S20和S22的紅外光譜特征分別與地骨皮和香加皮正品相符,而S21的特征區(qū)域吸收峰則與香加皮正品特征符合,但指紋區(qū)的吸收峰發(fā)生了較大的變異。以上結果表明市售香加皮、五加皮與地骨皮有混用現(xiàn)象存在,與文獻報道[4-5]結果一致。

皮類藥材由于其藥用部位特殊,受產(chǎn)地、生長環(huán)境、采收時間等影響較小,因而本實驗所用的不同產(chǎn)地香加皮和五加皮的紅外指紋圖譜相似度很大。含揮發(fā)性成分較大的藥材在因貯存時間較長而發(fā)生“走油”現(xiàn)象,影響了藥品療效,在質量控制和臨床用藥中應高度重視中藥材的貯存時間,今后有待進一步研究貯存時間對光譜特征的影響。