李雯,肖小麗,龔藝,曲偉紅,趙建國,姜登釗,何剛

(九江學(xué)院 藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,江西 九江 332005)

香加皮和五加皮均為常用的具有利水消腫、祛風(fēng)濕功效的傳統(tǒng)中藥。香加皮習(xí)稱“北五加皮”,來源于蘿藦科植物杠柳PeriplocasepiumPunge.的干燥根皮,五加皮習(xí)稱“南五加皮”,來源于五加皮來源于五加科細(xì)柱五加AcanthopanaxgracilistylusW.W.Smith 的干燥根皮[1]。二者來源不同,而且化學(xué)成分、功效和藥理作用不完全相同[2-3],但外形性狀觀彼此相似,容易混淆。而市場上人們常混淆香加皮、五加皮和地骨皮,導(dǎo)致相互替代使用較為廣泛[4-5]。這對藥材的鑒別和臨床合理正確使用造成困難。文獻(xiàn)常采用鑒別方法有性狀鑒別、顯微鑒別、薄層色譜法[1]、高效液相色譜法[6-7]、DNA條形碼技術(shù)[8]和HS-SPME-GC-MS法[9]等,未見采用紅外光譜法鑒別香加皮和五加皮的文獻(xiàn)報道。紅外指紋圖譜能反映中藥中化學(xué)成分組成及其含量的整體信息,具有操作簡單、快速而無損傷等特點,現(xiàn)已廣泛用于藥材真?zhèn)舞b別、道地性識別和中藥配方顆粒的質(zhì)量控制[10]等領(lǐng)域。擬采用紅外光譜結(jié)合聚類分析法和雙指標(biāo)分析法對香加皮和五加皮樣品分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 儀器

傅立葉變換紅外光譜儀(VERTEX 70,Burker公司),手提式中藥粉碎機(SL-100,浙江省永康市松青五金工具廠),電熱恒溫干燥箱(DHG-9145A,上海一恒科學(xué)儀器有限公司),電子分析天平(BT-224S,賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

1.1.2 材料

22批藥材(S1樣品為生藥學(xué)實驗室留存8年的樣品,其他樣品均購買于市場上不同的藥店和藥材公司,貯存時間在使用日期之內(nèi),樣品信息見表1,經(jīng)曲偉紅副教授生藥鑒定);溴化鉀(KBr,光譜純)。

表1 樣品來源信息

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備

取樣品于60 ℃干燥5 h后,粉碎,過200目篩(孔徑:0.074 mm)。取適量細(xì)粉與KBr粉末(質(zhì)量比約為1∶150)壓片。

1.2.2 紅外光譜測定

掃描范圍4 000～400 cm-1,分辨率4 cm-1,靈敏度5,掃描次數(shù)32次,基線校正和歸一化處理,去除水分和CO2的干擾,得到一維紅外指紋圖譜和吸收峰數(shù)據(jù)。二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜圖和吸收峰數(shù)據(jù)采用紅外光譜儀自帶OPUS紅外分析軟件獲得,平滑點為32,靈敏度為2。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 聚類分析法

提取1 800～400 cm-1范圍內(nèi)吸收峰的位置和吸收強度明顯差異的波段區(qū)間透光率值,作為聚類分析的原始數(shù)據(jù),采用OriginPro.v8.6.SR3軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。

1.3.2 雙指標(biāo)序列分析法[11]

共有峰率P=(Ng/Nd)×100%,變異峰率Pva=(Na/Ng)×100%,變異峰率Pvb=(Nb/Ng)×100%。其中:Ng是共有峰,紅外指紋圖譜中都出現(xiàn)的吸收峰;Nd是獨立峰:在紅外指紋圖譜中所有出現(xiàn)的不同吸收峰,Na和Nb分別是圖譜a和b的變異峰,指紋圖譜a或b中相對于其共有峰的非共有峰數(shù)。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 精密度試驗

分別取S1和S9樣品片,連續(xù)掃描5次,同一樣品所得圖譜基本一致,以共有峰波數(shù)計算,相關(guān)系數(shù)均大于0.999 8,RSD均小于1%。

2.1.2 重復(fù)性試驗

分別取S1和S9樣品,各制備5片樣品片進(jìn)行掃描,同一樣品所得圖譜基本一致,以共有峰波數(shù)計算,相關(guān)系數(shù)均大于0.999,RSD均小于2%。

2.1.3 穩(wěn)定性試驗

分別取同一份S1和S9樣品片,每隔1 h測定一次,共4次,同一樣品所得圖譜基本一致,以共有峰波數(shù)計算,相關(guān)系數(shù)均大于0.999,RSD均小于5%,表明樣品片在4 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2 樣品一維紅外指紋圖譜結(jié)果

各樣品的一維紅外指紋圖譜見圖1,看出樣品間紅外光譜圖整體的峰形和峰位較相似,但在1 800～400 cm-1范圍內(nèi)指紋圖譜差異較明顯。

圖1 樣品的一維紅外指紋圖譜

所有樣品的共有峰高達(dá)10個(共有峰的確定見2.4.1項下),分別是3 422(3 386),2 924(2 937),1 622,1 375,1 318,1 264(1 243),1 152,1 025,778(781)和528(518)cm-1。香加皮正品還有3個共有峰,分別是2854,1 737和1 428 cm-1,除S1外均另有1 516,860和578 cm-1處3個吸收峰;五加皮正品還有5個共有峰,分別是1 514,1 080,859,662和577 cm-1;地骨皮正品還有4個共有峰,分別是3 348,3 070,1 444和666 cm-1?；靷纹肪哂姓返牟糠只蛉课辗濉?/p>

3 500～3 200 cm-1的峰強而寬,為O-H、N-H伸縮振動峰。2 924 cm-1為亞甲基的C-H伸縮振動峰,1 622 cm-1可能是C=C(烯烴或苯環(huán)骨架)、C=O的伸縮振動峰或者酰胺I帶吸收峰,1 514 cm-1屬于苯環(huán)骨架振動,1 375 cm-1為甲基和亞甲基C-H的彎曲振動峰,1 318 cm-1屬于C-O或C-N伸縮振動的特征峰,1 264(1 243)cm-1屬于C-O(酚羥基、醇羥基等)的伸縮振動,或C-H的彎曲振動峰,1 152,1 025 cm-1屬于C-O(酚羥基、醇羥基、內(nèi)酯和醚)的伸縮振動峰,860,778(781) cm-1為糖環(huán)振動和 C-H面外彎曲振動峰。1 622,1 318和778(781)cm-1三尖峰分別是草酸鈣中C-O反對稱、對稱伸縮振動和彎曲振動峰。1 152,1 080,1 025和860 cm-1處附近的階梯峰是淀粉中C-O伸縮振動和糖環(huán)振動吸收峰。表明各藥材化學(xué)成分組成具有相似性。

2 854,1 737,1 428cm-1處的3個吸收峰為香加皮正品的最重要的鑒別特征峰組,屬于脂肪酸酯類成分的亞甲基的C-H和C=O(內(nèi)酯)的伸縮振動峰以及C-H彎曲振動;1 080,860和664 cm-1處的3個吸收峰為五加皮的最重要鑒別指紋峰組,為糖環(huán)振動、C-H面外彎曲振動峰和芳環(huán)C-OH面內(nèi)彎曲,其中1 080cm-1為水溶性多糖的C-O-C的伸縮振動;而 3 345、3 070和1 444 cm-1附近出現(xiàn)3個特征吸收峰為地骨皮的最重要鑒別特征峰組,分別為O-H或N-H、烯烴或芳香環(huán)C=C-H伸縮振動、苯環(huán)骨架振動或酰胺II帶吸收峰[12]。由此可見,香加皮合格正品有機酸類、芳香化合物及其苷類成分特征明顯,不合格品芳香性成分則明顯降低。五加皮正品水溶性多糖(苷類)和有機酸類成分特征更明顯[3]。而地骨皮正品中生物堿、烯烴、酰胺類和芳香化合物特征更明顯[12]。此結(jié)果與文獻(xiàn)報道香加皮主要的化學(xué)成分為 C21 甾體苷、強心苷、萜類、醛類、有機酸等,五加皮主要含有揮發(fā)油、三萜皂苷類和有機酸等成分結(jié)果相符[13-14]。

2.3 二階導(dǎo)數(shù)紅外指紋圖譜結(jié)果

由于二階導(dǎo)數(shù)光譜分辨率提高,峰尖銳程度增大,能將一維圖譜中的肩峰和重疊峰區(qū)分,峰數(shù)量亦顯著增多。香加皮和五加皮在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)二階導(dǎo)數(shù)紅外指紋圖譜均有29個較明顯的吸收峰(見圖2和圖3)。盡管二者吸收峰的峰位很相似,但峰形差異明顯,尤其是3 000～2 800 cm-1(峰1和2)、1 800～1 600 cm-1(峰3至峰6)和720～520 cm-1(峰22至峰27)的峰形、峰位和峰強度差異更明顯,可作為鑒別依據(jù)。而S1缺乏1 664,1 600 cm-1,并1 578,1 027,1 006,593,551和442 cm-1處產(chǎn)生新吸收峰,進(jìn)一步確認(rèn)其芳香性成分含量明顯下降。

峰1～29的峰位依次:2 922,2 852,1 743,1 664,1 621,1 600,1 513,1 462,1 423,1 372,1 319,1 238,1 160,1 108,1 080,1 054,990,923,888,781,718,668,644,620,576,518,467和432 cm-1。

峰1～29的峰位依次為:2 927,2 852,1 743,1 694,1 664,1 621,1 513,1 462,1 423,1 372,1 319,1 238,1 160,1 108,1 080,1 054,990,923,888,781,718,668,638,610,576,518,467和432 cm-1。

混偽品的峰形和峰位與正品較為相似(見圖4),其中S22與香加皮正品圖譜峰形基本一致,S19與五加皮正品圖譜峰形基本一致,而S18、S20與地骨皮正品的圖譜峰形更接近。

圖4 樣品S16-S22的二階導(dǎo)數(shù)紅外指紋圖譜

2.4 聚類分析結(jié)果

由圖1可知,樣品中紅外指紋圖譜在1 800～400 cm-1范圍內(nèi)差異較明顯,故提取該波段區(qū)間透光率值,作為聚類分析的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析,結(jié)果見圖5。當(dāng)距離約為0.05時,可將樣品分成四類:S1和混偽品S21,混偽品S22和香加皮正品S2～S8,混偽品S19和五加皮正品S9～S15,混偽品S18和S20和地骨皮正品S16和S17分別聚成一類。由此可見,聚類分析大體上能夠?qū)悠愤M(jìn)行區(qū)分。

圖5 樣品聚類分析結(jié)果

2.5 雙指標(biāo)序列法結(jié)果

2.5.1 共有峰的確定

因為儀器的分辨率是4 cm-1,所以兩個峰位相差8 cm-1以內(nèi)的一組峰即為共有峰。在表2中,多數(shù)情況明顯符合此原則,可以明確判斷為共有峰。3 500～3 200 m-1范圍的寬峰為N-H、O-H的伸縮振動峰,單峰的認(rèn)為是同一個共有峰,出現(xiàn)雙峰的屬于兩個共有峰。另從各樣品指紋圖譜峰形和峰位來看,兩個峰位相差20 cm-1以上的一組峰屬于獨立峰。根據(jù)以上原則,確定表2中在同一列的吸收峰為共有峰。

表2 樣品的一維紅外光譜吸收峰數(shù)

2.5.2 共有峰率和變異峰率雙指標(biāo)序列

分別以各樣品為參照,計算其他樣品相對該樣品的共有峰率和變異峰率,用(P,Pva,Pvb)表示,共有峰率越大,表示樣品間的親緣關(guān)系越近,而變異峰率越大,表示樣品間發(fā)生的變異越大。按照共有峰率值排序得到22批樣品的雙指標(biāo)序列如表3。

表3 一維紅外指紋圖譜共有峰率和變異峰率雙指標(biāo)序列分析結(jié)果 單位/%

香加皮正品(S1除外)間共有峰率為100%～83.33%,五加皮正品間共有峰率為100%～93.75%,而地骨皮正品間共有峰率為100%～82.3%[12]。香加皮、五加皮與地骨皮正品間共有峰率均小于72.22%。而混偽品與正品間的共有峰為93.75%～47.62%。

2.5.3 基本關(guān)系組、對及分析

根據(jù)建立的雙指標(biāo)序列,可以對22批樣品進(jìn)行基本的分組,在最相似樣品對、組中,按共有峰率高低將它們分成3組:

A組:S2:S7(100,0,0),S4:S6S22(100,0,0),S5:S8,S9:S10S11S12S13S15S19(100,0,0)。

B組:S2S5S7S8:S4S6S22(94.12,6.25,0.00),S2S7:S5S8(88.89,6.25,6.25),S2S7:S27(88.24,13.33,0.00),S3:S4S6S22(88.24,6.67,6.67),S3:S2 S5S7S8S21(83.33,6.67,13.33),S3:S27 (82.35,14.29,7.14),S9S10S11S12S13S15S19:S14 (93.75,0.00,6.67),S16:S20 (93.75,0.00,6.67),S16:S17S18 S26 (82.35,7.14,14.29),S20:S18S26 (88.24,6.67,6.67),S23:S24S27 (93.75,6.67,0.00),S23:S26 (88.24,6.67,6.67),S24:S26 (93.75,0.00,6.67),S24:S14S20 (82.35,7.14,14.29),S24S25:S27 (87.50,7.14,7.14),S25:S4S6S22S23 (82.35,7.14,14.29),S26:S27 (82.35,7.14,14.29)。

C組:S1:S14S20 (55.00,36.36,45.45),S1:S9S10S11S12S13S15S19 (50.00,50.00,50.00),S1:S18 (47.62,50.00,60.00),S2S7S21:S17 (50.00,54.55,45.45),S3:S17 (52.38,45.45,45.45),S4S6S22:S16 (55.00,45.45,36.36),S4S6S22:S17 (45.45,60.00,60.00),S5S8:S14S26 (57.14,41.67,33.33),S5S8:S17 (43.48,70.00,60.00),S9S10S11S12S13S15S16S19:S25 (57.89,36.36,36.36),S9S10S11S12 S13S15S19:S17 (55.00,36.36,45.45),S16:S2S5S7S8 (52.38,36.36,54.55),S20:S2S5S7S8 (57.14,33.33,41.67),S21:S14S18 (57.14,41.67,33.33)。

在A組中,此組中S2與S7,S4與S6S22,S5與S8,S9與S10S11S12S13S15S19間共有峰率為100%,變異峰率0%,表明該組樣品間共有峰率極高,變異峰率極低,樣品間親緣關(guān)系非常近。

在B組中,樣品間的共有峰率為80%～95%,變異峰率為0%～15%,表明樣品間的親緣關(guān)系較近。該組樣品主要來源于各正品樣品間、正品與混偽品、混偽品兩兩比較。表明各正品樣品可能受產(chǎn)地、氣候、生長環(huán)境的影響,發(fā)生了微小的變化?；靷纹放c某些正品相似度較高。

C組中,共有峰率均很低(<58%),且變異峰率均較高(30%～70%)。該組樣品主要是S1與其他樣品、香加皮正品與地骨皮正品、五加皮正品與地骨皮正品之間的共有峰率和變異峰率情況。

結(jié)果表明香加皮合格正品間、五加皮合格正品間的親緣關(guān)系很近,變異較小。但二者及其混偽品間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn),發(fā)生了較大的變異。另外S1因為貯存時間長,其化學(xué)組成發(fā)生了明顯的變化,導(dǎo)致與正品間共有峰率大大降低(72.22%～60.00%)。

3 討論

在藥材市場上,五加皮、香加皮和地骨皮常被混用,但它們之間的化學(xué)成分與藥理作用有較大差別,香加皮甚至有毒。為確保藥材的準(zhǔn)確性,應(yīng)制定合理的鑒別方法,以提高中藥材的質(zhì)控水平。本文首次采用傅里葉變換紅外光譜法結(jié)合聚類分析法和雙指標(biāo)序列法比較了市售中藥香加皮、五加皮和地骨皮樣品,結(jié)果表明香加皮和五加皮合格正品的紅外指紋圖譜具有明顯的特征,可以作為鑒別正品及其是否合格的依據(jù)。本實驗建立的紅外光譜法具有簡便、快速和無損樣品等優(yōu)點,為香加皮、五加皮的鑒別提供了一種新方法,為其質(zhì)量評價、制劑開發(fā)和臨床合理用藥提供參考。

根據(jù)香加皮、五加皮和地骨皮正品一維和二階紅外指紋圖譜的峰形和峰位、聚類分析和雙指標(biāo)序列分析的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)當(dāng)作香加皮售賣的S18和S19的紅外光譜特征與分別與地骨皮和五加皮正品相符,而當(dāng)作五加皮售賣的S20和S22的紅外光譜特征分別與地骨皮和香加皮正品相符,而S21的特征區(qū)域吸收峰則與香加皮正品特征符合,但指紋區(qū)的吸收峰發(fā)生了較大的變異。以上結(jié)果表明市售香加皮、五加皮與地骨皮有混用現(xiàn)象存在,與文獻(xiàn)報道[4-5]結(jié)果一致。

皮類藥材由于其藥用部位特殊,受產(chǎn)地、生長環(huán)境、采收時間等影響較小,因而本實驗所用的不同產(chǎn)地香加皮和五加皮的紅外指紋圖譜相似度很大。含揮發(fā)性成分較大的藥材在因貯存時間較長而發(fā)生“走油”現(xiàn)象,影響了藥品療效,在質(zhì)量控制和臨床用藥中應(yīng)高度重視中藥材的貯存時間,今后有待進(jìn)一步研究貯存時間對光譜特征的影響。