任德豪,趙湲湲,高慶英,伊海晨,羅濤,劉義

(煙臺大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,山東 煙臺 264006)

噻唑是一種典型的五元雜環(huán)類化合物。噻唑環(huán)中含有一個硫原子和氮原子,可以通過氫鍵、弱相互作用、螯合等方式與蛋白質(zhì)、DNA、RNA、金屬離子及其他分子相互作用[1]。事實上,噻唑結(jié)構(gòu)不僅在活性天然產(chǎn)物中廣泛存在,也在藥物開發(fā)中扮演了重要作用。如市售抗艾滋病藥物——利托那韋[2],分子結(jié)構(gòu)中包含兩個噻唑結(jié)構(gòu),其被發(fā)現(xiàn)可以有效地抑制人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)中天冬氨酸蛋白酶的活性。近來,利托那韋被發(fā)現(xiàn)也可以用于新冠病毒的殺滅和治療。噻唑呋林是另一個含有噻唑雜環(huán)的市售藥物[3],它被發(fā)現(xiàn)是一種有效的核苷類似物,可以在體內(nèi)有效抑制次黃嘌呤核苷酸脫氫酶,進而抑制癌細胞的增殖。噻唑呋林還作為孤兒藥物,被用于治療慢性骨髓性白血病。達沙替尼也是一種含有噻唑結(jié)構(gòu)的抗腫瘤市售藥物。達沙替尼是一種重要的酪氨酸激酶抑制劑,在粒細胞白血病治療中扮演了重要角色。達沙替尼不僅可以有效抑制慢性粒細胞白血病向急性白血病的轉(zhuǎn)化,而且被發(fā)現(xiàn)可以有效延長白血病患者的生存期[4]。

噻唑氨基酸作為一種特殊的噻唑化合物,還被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于活性天然產(chǎn)物中。例如:2008年,瑞士科學(xué)家 Friedrich Jüttner等人從銅綠微囊藻PCC 7806中分離出了一個名為Aerucyclamide A的環(huán)肽類天然產(chǎn)物[5],其分子結(jié)構(gòu)中不僅包含一個甘氨酸衍生的噻唑,還包含一個噁唑啉和一個噻唑啉結(jié)構(gòu)。對Aerucyclamide A的生物活性分析表明,它具有較好的抗瘧疾功效,其對惡性瘧原蟲(K1菌株)的IC50值可以達到0.7 μmol/L。Luesch及其同事于2008年,也報道了一種從美國佛羅里達州海洋藍藻Symplocasp中分離出一種環(huán)肽類天然產(chǎn)物,并命名為Largazole[6]。如圖1所示,Largazole結(jié)構(gòu)中除了含有一個纈氨酸殘基和一個長鏈硫酯片段,還含有一個甘氨酸衍生的噻唑片段和一個噻唑啉結(jié)構(gòu)。有研究表明,甘氨酸噻唑片段對Largazole分子內(nèi)大環(huán)結(jié)構(gòu)的剛性保持起到了重要作用。生物活性研究發(fā)現(xiàn),Largazole對乳腺癌細胞株具有優(yōu)良的殺滅活性,特別是對非轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺上皮細胞(NMuMG)的GI50可以達到122 nmol/L。目前,眾多以Largazole為模板的新化合物被不斷開發(fā)出來,其作為新型抗癌藥物開發(fā)中一個重要潛力分子,受到越來越多的關(guān)注。

圖1 幾個典型的含噻唑市售藥物和含噻唑甘氨酸天然產(chǎn)物

從Largazole和Aerucyclamide A的分子結(jié)構(gòu)中,不難發(fā)現(xiàn)甘氨酸衍生噻唑結(jié)構(gòu),是合成目標分子的重要前體和原料。因此,開展甘氨酸衍生噻唑類化合物的合成,對完成Largazole等活性天然產(chǎn)物的合成和新藥開發(fā),都具有重要的實際應(yīng)用價值。目前甘氨酸衍生噻唑類化合物的合成方法主要有:以經(jīng)典Hantzsch噻唑環(huán)化為關(guān)鍵反應(yīng)的合成路線[7]和以氰基縮合反應(yīng)為關(guān)鍵反應(yīng)合成路線[8]。我們在開展Largazole及類似含噻唑天然產(chǎn)物全合成的研究過程中,發(fā)現(xiàn)兩條合成方法之間存在較大差異,不同路線的選擇會進一步影響噻唑產(chǎn)物的合成效率。于是,我們分別通過兩條合成路線完成了目標Boc-甘氨酸噻唑乙酯的合成,并對兩條合成路線的具體實施方法和優(yōu)劣進行了比較。該工作可以為含噻唑氨基酸的大規(guī)模制備,提供實驗參考和技術(shù)支持。

1 實驗材料及方法

1.1 試劑

布魯克AVANCE NEO-400M核磁共振波譜儀 (Germany,布魯克公司);RE2000-旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(中國,鄭州科泰實驗設(shè)備有限公司);手持式紫外熒光分析儀(中國,上海豫明儀器有限公司);磁力攪拌器(中國,鄭州科泰實驗設(shè)備有限公司);Thermo Scientific Q Exactive-高分辨質(zhì)譜儀(賽默飛中國科技有限公司)。

1.2 儀器

Boc-甘氨酸(98%,CAS:4530-20-5,上海麥克林試劑有限公司);勞森試劑(Lawesson reagent)(97%,CAS:19172-47-5,中國百靈威科技有限公司);3-溴代丙酮酸乙酯(97%,CAS:70-23-5,中國百靈威科技有限公司);碳酸銫(99%,CAS:534-17-8,上海麥克林生化科技有限公司);三氟乙酸酐(99%,CAS:407-25-0,上海麥克林生化科技有限公司);1,8-二氮雜二環(huán)十一碳-7-烯(97%,CAS:6647-22-2,中國百靈威科技有限公司);溴代三氯甲烷(98%,CAS:75-62-7,中國百靈威科技有限公司);碳酸鈣、碳酸鉀、無水硫酸鈉等均購買自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.3 實驗步驟

1.3.1N-Boc-甘酰胺(2)的制備

將875 mg市售Boc-L-甘氨酸(5.0 mmol)與1.06 g HOBt(5.0 mmol)溶于40 mL二氯甲烷中,攪拌至完全溶解后,加入955 mg EDCI(5.0 mmol),常溫攪拌30 min后,冰浴冷卻至0 ℃,加入15 mL氨水,緩慢升至室溫,繼續(xù)攪拌30 min后,TLC監(jiān)測反應(yīng)完畢。后處理向體系中加入飽和氯化銨溶液淬滅反應(yīng)后二氯甲烷萃取三次,合并有機相,無水硫酸鈉干燥,旋干后分離得到718 mg白色固體,產(chǎn)率82.9%。

1.3.2 (2-氨基-2-硫代乙基)氨基甲酸叔丁酯(3)的制備

將4.0 g Boc-L-甘氨酰胺(22.7 mmol)溶于100 mL干燥二氯甲烷中,攪拌至完全溶解后,加入5.3 g勞森試劑(13 mmol),常溫攪拌過夜后,TLC監(jiān)測反應(yīng),反應(yīng)完全后,旋干溶劑,柱色譜分離得到3.0 g黃色固體,產(chǎn)率68.7%。1H NMR (400 MHz,CD3OD)δ:4.01 (s,2H),1.46 (s,9H)。

1.3.3 Boc-甘氨酸噻唑乙酯(5)的制備——Hantzsch噻唑合成法

取190 mg(1.0 mmol)上一步得到的(2-氨基-2-硫代乙基)氨基甲酸叔丁酯溶解到20 mL乙醇中,將3-溴代丙酮酸乙酯181 mg(1.1 mmol)和碳酸鈣200 mg(2.0 mmol)依次加入到反應(yīng)體系中,常溫反應(yīng)過夜,TLC監(jiān)測反應(yīng)結(jié)束后,加水淬滅反應(yīng),常規(guī)后處理后柱色譜分離得到白色固體271 mg,產(chǎn)率76%。1H NMR (400 MHz,CDCl3)δ:8.12 (s,1H),4.66 (s,br,1H),4.64 (s,br,1H),4.42 (q,J=7.2 Hz,2H),1.47 (s,9H),1.40 (t,J=7.2 Hz,3H)。

1.3.4 氰基甘氨酸衍生物(6)的制備

將174 mgN-Boc-甘酰胺(1.0 mmol)溶于3 mL THF,加入320 mg吡啶(4.0 mmol),冷卻至零度后加入280 μL三氟乙酸酐(2.0 mmol),常溫反應(yīng)攪拌3 h后旋干,加入稀鹽酸和乙酸乙酯萃取,合并有機相,無水硫酸鈉干燥、過濾、旋干、色譜柱分離得到褐色固體128 mg,產(chǎn)率82.0%。1H NMR (400 MHz,CD3OD)δ:4.00 (s,2H),1.47 (s,9H)。

1.3.5 Boc-甘氨酸噻唑乙酯(5)的制備——氰基縮合法

將156 mg(1.0 mmol)化合物6、300 mg(2.0 mmol)半胱氨酸乙酯和606 mg三乙胺(6.0 mmol)溶解到10 mL甲醇中,加熱回流5 h后,TLC監(jiān)測化合物6消失,旋去溶劑,柱色譜分離得到225 mg 噻唑啉中間體。繼續(xù)將其溶解在5 mL二氯甲烷中,加入296 mg(1.5 mmol)溴代三氯甲烷和301 mg(2.0 mmol)的1,8-二氮雜二環(huán)十一碳-7-烯,常溫反應(yīng)0.5 h后,旋去溶劑柱色譜分離得到206 mg化合物5,產(chǎn)率72%。1H NMR (400 MHz,CDCl3)δ:8.12 (s,1H),4.66 (s,br,1H),4.64 (s,br,1H),4.42 (q,J=7.2 Hz,2H),1.47 (s,9H),1.40 (t,J=7.2 Hz,3H)。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 Hantzsch噻唑合成路線

如圖2該路線選取市售Boc-甘氨酸為原料,首先在EDCI/DIPEA的縮合條件下與氨水以83%的產(chǎn)率制備得到Boc-干氨酰胺,實驗發(fā)現(xiàn)新購氨水更有利于提高反應(yīng)產(chǎn)率。勞森試劑(Lawesson reagent)制備硫酰胺是制備噻唑前體的重要反應(yīng),勞森試劑的添加量和二氯甲烷溶液的水含量都會影響產(chǎn)率,二氯甲烷含水量高,會出現(xiàn)硫代不完全的狀況,而且硫代物3具有較強烈的氣味,只適合在通風櫥完成反應(yīng)及后處理。盡管重復(fù)多次,硫代的產(chǎn)率最高仍只有69%。隨后,本課題組對漢斯噻唑形成反應(yīng)進行了細致的條件優(yōu)化。本課題組選用了四種無機堿在乙醇做溶劑的條件下,進行了條件摸索(表1),發(fā)現(xiàn)碳酸鈣會以最高82%的產(chǎn)率得到目標噻唑產(chǎn)物,碳酸銫作為堿的條件下產(chǎn)率會急劇下降,選擇碳酸鉀作為無機堿的條件下,只得到了合成前體羥基噻唑啉。

表1 Hantzsch噻唑合成條件摸索*

圖2 Hantzsch噻唑合成路線

2.2 基于氰基縮合反應(yīng)的噻唑合成路線

如圖3該路線同樣選取市售Boc-甘氨酸為原料,在EDCI/DIPEA的同樣的縮合條件下與氨水反應(yīng)得到Boc-干氨酰胺。接著,在三氟乙酸酐和吡啶的共同存在下脫水,以82%的產(chǎn)率制備得到氰基化合物6,本課題組實驗發(fā)現(xiàn),該反應(yīng)體系需要嚴格的除水處理,水殘余會引起大量的原料剩余。氰基底物與半胱氨酸乙酯7在有機堿存在下,加熱回流即可制備得到噻唑啉前體,最后經(jīng)過DBU/BrCCl3氧化即可得到目標噻唑化合物5。氰基與半胱氨酸的縮合是這條路線的關(guān)鍵反應(yīng)步驟。

圖3 氰基縮合噻唑合成路線

如表2所示,本課題組選取了四種有機堿(二異丙基乙基胺、三乙胺、N-甲基嗎啉、1,8-二氮雜二環(huán)十一碳-7-烯)和無機堿碳酸氫鈉的條件對縮合反應(yīng)進行了摸索,發(fā)現(xiàn)碳酸氫鈉無論常溫或者加熱條件下都只得到了痕量的目標噻唑啉產(chǎn)物。強堿1,8-二氮雜二環(huán)十一碳-7-烯同樣也沒有得到目標產(chǎn)物,分析是強堿加熱的條件下引起了半胱氨酸的消除,進而造成了極低的產(chǎn)率結(jié)果。大位阻的二異丙基乙基胺和N-甲基嗎啉同樣效果不佳,只有三乙胺取得了80%的收率。實驗中發(fā)現(xiàn),半胱氨酸過量是氰基底物完全轉(zhuǎn)化為噻唑啉的一個關(guān)鍵因素,考慮可能是反應(yīng)并未進行惰性氣體保護,長時間暴露空氣的加熱條件下,半胱氨酸可能被氧化為胱氨酸,從而無法進行下一步親核反應(yīng)得到噻唑啉產(chǎn)物。最后如圖3所示,通過DBU/BrCCl3參與的氧化反應(yīng),完成了目標噻唑化合物的合成。

表2 氰基縮合反應(yīng)條件摸索*

2.3 噻唑產(chǎn)物核磁表征及兩條合成路線比較

2.3.1 噻唑產(chǎn)物5的核磁氫譜表征

合成化合物的核磁氫譜結(jié)果也與文獻報道的結(jié)果一致[9]。從圖4可以看出,獲得的噻唑產(chǎn)物純度良好,選用氘代氯仿作為溶劑,噻唑5-位的氫以單峰的形式出現(xiàn)在化學(xué)位移8.12位置,甘氨酸的CH2峰出在4.64～4.66,乙酯結(jié)構(gòu)中的CH2以典型的四重峰的形式出現(xiàn)在4.42,耦合常數(shù)為7.2 Hz。叔丁氧羰基的九個氫出現(xiàn)在1.47,而乙酯末端的甲基峰以三重峰,耦合常數(shù)7.2 Hz的形式出現(xiàn)在1.40。

圖4 噻唑產(chǎn)物5的氫譜

2.3.2 兩條合成路線的比較

綜合比較兩條合成路線,基于漢斯合成法的合成路線從市售Boc-甘氨酸出發(fā),通過三步反應(yīng),可以43.5%的總收率得到目標噻唑產(chǎn)物,整條路線除了硫代酰胺產(chǎn)物和勞森試劑氣味較大的缺點外,所用試劑價格成本較低、路線較為簡捷、產(chǎn)率較好。

同樣以甘氨酸為起始原料的氰基縮合路線,則通過線性步驟4步,以49%的總收率得到了目標Boc-甘氨酸衍生噻唑化物5。綜合比較發(fā)現(xiàn):這條路線的產(chǎn)率相對漢斯反應(yīng)合成路線較高,但該反應(yīng)路線需要使用價格較昂貴的三氟乙酸酐,對反應(yīng)體系的除水要求較高,合成路線較長且操作相對繁瑣。因此,基于漢斯反應(yīng)的制備路線更適合大規(guī)模、工業(yè)制備Boc-甘氨酸噻唑及其衍生物。以上結(jié)果也將為Largazole等抗癌天然產(chǎn)物中,噻唑氨基酸原料的高效制備提供一定參考。

3 結(jié)論

(1)氨基酸衍生噻唑化物在Largazole等抗癌天然產(chǎn)物和藥物分子中廣泛存在,本論文對兩條噻唑氨基酸合成路線進行了合成嘗試及比較。

(2)以市售Boc-甘氨酸為原料,通過氨化、硫代、漢斯反應(yīng)三步反應(yīng),以43.5%的總收率得到Boc-甘氨酸衍生的噻唑產(chǎn)物5。同樣以市售Boc-甘氨酸為原料,經(jīng)過氨化、氰基化、縮合和氧化反應(yīng)4步,以49%的總產(chǎn)率同樣完成了目標噻唑化合物5的合成。

(3)對關(guān)鍵漢斯反應(yīng)和氰基縮合反應(yīng)的最優(yōu)條件進行了摸索,最終通過路線比較發(fā)現(xiàn),漢斯合成法路線更簡捷、原料價格更低廉、操作更簡便,而氰基縮合反應(yīng)的路線則產(chǎn)率更高。