周學(xué)麗, 史德軍, 劉漢江, 丁建昭, 馬 軍, 張海娟, 顏琿璘, 王英成, 金 鑫, 祁鶴興, 蘆光新*

(1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院, 青海 西寧 810016; 2.青海省草原改良試驗(yàn)站, 青海 共和 813099)

飼草是青海省草食畜牧業(yè)發(fā)展與牧民生計(jì)提升的特色產(chǎn)業(yè),是生態(tài)文明建設(shè)、打造青海成為全國綠色有機(jī)農(nóng)畜產(chǎn)品輸出地和實(shí)現(xiàn)全省高原特色綠色高質(zhì)量發(fā)展的核心和重要物質(zhì)基礎(chǔ)。面臨生態(tài)環(huán)境保護(hù)和社會(huì)經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展的雙重壓力,建植人工草地是解決草地資源縮減和草食畜牧業(yè)發(fā)展受限等問題的最佳手段[1-2]?！丁笆奈濉比珖暡莓a(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃》也明確指出“青藏高原地區(qū)統(tǒng)籌推進(jìn)人工種草和天然草原利用,建設(shè)高標(biāo)準(zhǔn)人工飼草料地,打造專業(yè)化飼草生產(chǎn)加工基地,保障區(qū)域內(nèi)優(yōu)質(zhì)飼草均衡供應(yīng)”。由此可見,加強(qiáng)飼草種植模式、促進(jìn)飼草提質(zhì)增效對(duì)于解決高寒地區(qū)草畜不平衡的矛盾、保護(hù)草地資源和促進(jìn)草牧業(yè)持續(xù)發(fā)展具有重要意義。然而,建植的人工草地因草種單一、群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較差,無法維持生產(chǎn)和生態(tài)功能的可持續(xù)性[3]。施肥是草地改良和恢復(fù)的有效的措施之一,鑒于青海省高寒草地生態(tài)保護(hù)價(jià)值,探索施用有機(jī)肥對(duì)退化草地改良以及保護(hù)好青海這片凈土的生態(tài)環(huán)境、實(shí)現(xiàn)農(nóng)牧業(yè)持續(xù)健康發(fā)展具有十分重要的意義[4]。肥料對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展,特別是糧食生產(chǎn)的發(fā)展具有重要作用。但近年由于化肥使用過量,肥料施用不合理,導(dǎo)致部分環(huán)境受到污染農(nóng)業(yè)生產(chǎn)生態(tài)條件惡化,肥料使用效果下降[5]。有機(jī)肥為土壤微生物的活動(dòng)提供所需的碳源、氮源和能量,并改善土壤微生態(tài)環(huán)境的理化性狀,促進(jìn)微生物的生長和繁殖,增加微生物數(shù)量和活性,優(yōu)化土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能[6-7]。朱瑞芬等[8]研究認(rèn)為施氮可以調(diào)控微生物群落網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵物種,進(jìn)而改變其分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。該課題組前期的研究表明,施有機(jī)肥能夠促進(jìn)高寒地區(qū)牧草生物量的增加[9],同時(shí),施有機(jī)肥能夠改善土壤根際微生物群落結(jié)構(gòu),進(jìn)一步改善土壤健康狀況,是一項(xiàng)高寒地區(qū)草地恢復(fù)的有效措施[10-11]。因此,本文嘗試通過施有機(jī)肥改良人工退化草地,從微生物互作網(wǎng)絡(luò)的角度探索微生物對(duì)施有機(jī)肥的響應(yīng),以期獲得外源有機(jī)肥添加條件下土壤微生物動(dòng)態(tài)變化的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)和規(guī)律,為退化人工草地的恢復(fù)提供科學(xué)依據(jù),對(duì)于推動(dòng)草食畜牧業(yè)提檔升級(jí)以及保障國家糧食安全具有重要意義。

植物和土壤生物的互作是農(nóng)學(xué)和生態(tài)學(xué)的一個(gè)研究熱點(diǎn),植物-土壤-微生物反饋理論的提出和發(fā)展,加深了對(duì)微生物調(diào)節(jié)物種多樣性-生產(chǎn)力關(guān)系等作用的理解,在高寒地區(qū)牧草種植研究中發(fā)現(xiàn),細(xì)菌群落網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和復(fù)雜性與禾/豆混播牧草生物量的增加是一致的[12]?；谏鲜鱿嚓P(guān)理論,本文以環(huán)青海湖地區(qū)的退化人工草地為研究對(duì)象,探究施有機(jī)肥對(duì)植被、土壤理化性質(zhì)及土壤微生物群落的影響。采用高通量測序技術(shù)和分子網(wǎng)絡(luò)分析技術(shù),分析草地土壤微生物的多樣性、群落組成和與環(huán)境因子之間的相關(guān)性,旨在從土壤微生物角度,評(píng)價(jià)施用有機(jī)肥后土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)以及潛在的功能變化,探索微生物對(duì)推進(jìn)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、綠色高效現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于青海省草原改良試驗(yàn)站的人工草地,海拔3 270 m,經(jīng)緯度為37°03′ N,99°33′ E,年平均氣溫-0.7℃,絕對(duì)無霜期為20 d。年平均降水量為368.11 mm,相對(duì)濕度58%,年蒸發(fā)量1 495.3 mm,土壤為暗栗鈣土。該人工草地于2016年5月份建植,播種草種為‘青海’冷地早熟禾(Poapratensis‘Qinghai’),每年秋季收獲種子,冬季適度放牧,2019年實(shí)施草場封育,無采取任何田間管理措施,開始出現(xiàn)優(yōu)勢牧草減少、植被覆蓋度降低和毒雜草增多等草地退化現(xiàn)象,主要伴生物種有:車前(Plantagoasiatica)、鵝絨委陵菜(Potentillaanserina)、黃芪(Astragalusmembranaceus)、豬毛蒿(Artemisiascoparia)和密花香薷(Elsholtziadensa)等物種。為改良草場并提高草地資源利用率,于2020年6月中旬免耕補(bǔ)播的同時(shí)進(jìn)行施有機(jī)肥試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在試驗(yàn)區(qū)選擇牧草生長狀況基本一致的樣區(qū)(50 m×50 m),分別設(shè)置施有機(jī)肥與不施肥2個(gè)處理,每個(gè)處理為3 m×5 m小區(qū),隨機(jī)排列,重復(fù)5次。每個(gè)小區(qū)間均設(shè)1.5 m的緩沖帶,緩沖帶上不做任何處理。施肥量為800 kg·hm-2(有機(jī)質(zhì)含量≥45%,N+P2O5+K2O≥5%),撒施。試驗(yàn)設(shè)計(jì)如圖1所示:

圖1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)圖

1.3 研究方法

1.3.1植被群落結(jié)構(gòu)調(diào)查 2020年8月中旬,采用樣方法進(jìn)行植被群落調(diào)查,在所設(shè)定的10個(gè)小區(qū)內(nèi)進(jìn)行植物種類、物種數(shù)、群落總蓋度和物種自然高度測定,群落總蓋度的測定采用針刺法;生物量測定采用刈割法:齊地面剪取植被的地上部分,裝于信封袋中并稱取鮮質(zhì)量。

1.3.2土壤樣品的采集與處理 在取過地上生物量的樣方內(nèi)將土壤表層的殘留物和雜質(zhì)清理干凈,然后用7.5 cm直徑土鉆按S型在一個(gè)樣方內(nèi)隨機(jī)取0-20 cm鉆取5鉆混合后裝入帶有樣品編號(hào)的自封袋中(每個(gè)樣方做兩遍),帶回實(shí)驗(yàn)室,過40目土篩并剔除所有雜質(zhì)。將采集的土壤樣品分成兩部分,一部分保存于4℃用于土壤理化參數(shù)測定,其余部分保存在-80℃冰箱準(zhǔn)備提取DNA。

1.3.3土壤理化性質(zhì)測定 測定的土壤指標(biāo)有:土壤全氮、有機(jī)質(zhì)、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮,各指標(biāo)均采用常用化學(xué)分析法進(jìn)行測定[13]。土壤全氮含量使用凱氏定氮法,有機(jī)質(zhì)含量使用重鉻酸鉀-油浴加熱法,銨態(tài)氮含量采用靛酚藍(lán)比色法,硝態(tài)氮含量采用紫外分光光度法[14],土壤水分(Soil moisture,SM)、土壤電導(dǎo)率用便攜式土壤三參數(shù)儀測定(型號(hào)TDR-350,Spectrum,德國)在樣品采集時(shí)直接測定,重復(fù)3次,記錄數(shù)據(jù)。

1.3.4土壤微生物DNA提取、PCR擴(kuò)增和測序 采用土壤DNA提取試劑盒(MOBIO Laboratories,Carlsbad,CA,美國)提取土壤微生物總DNA。采用NanoDrop-ND1000 測定DNA濃度,并經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)DNA樣品質(zhì)量進(jìn)行檢測,合格后用于構(gòu)建文庫;以土壤樣品微生物總DNA為模板,分別用16SrDNA V4區(qū)(515F:5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′;806R:5′-GGACTACHVG-GGTWTCTAAT-3′);ITS2區(qū)5.8F,5′-AACTTTYRRCAAYGGATCWCT-3′ 和4R,5′-AGCCTCCGCTTATTGATATGCTTAART-3′[15]且?guī)в?0 bp長的barcode序列的特異引物為擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,采用KAPA HyperPrep Kit DNA文庫構(gòu)建測序文庫,在Illumina Miseq平臺(tái)進(jìn)行測序(深圳,美格基因)。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

1.4.1植被數(shù)據(jù)處理及分析 采用SPSS26.0軟件做T檢驗(yàn),以確定植被、土壤和微生物相關(guān)因子在兩組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),利用Excel軟件整理數(shù)據(jù)并用Origin 21.0作圖。

1.4.2微生物數(shù)據(jù)處理及分析 將所有原始數(shù)據(jù)以FASTQ格式以及樣本對(duì)應(yīng)的Barcode信息上傳到中科院生態(tài)環(huán)境研究中心鄧曄老師課題組的Galaxy分析平臺(tái)上(http://mem.rcees.ac.cn:8080)進(jìn)行分析。測序數(shù)據(jù)采用Btrim和FLASH進(jìn)行過濾優(yōu)化和雙端序列連接,優(yōu)質(zhì)序列利用UPARSE[16]基于97%的相似水平進(jìn)行OTU(Operational taxonomic units)聚類,并且通過RDP分類數(shù)據(jù)庫對(duì)OTU表進(jìn)行注釋?；贠TU豐度信息,利用R語言工具制作Venn圖和群落柱形圖,利用Mothur軟件[17]計(jì)算微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性用物種豐富度(Richness)、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)、以及Pielou均勻度指數(shù)表示,采用PCA法對(duì)不同施肥處理和對(duì)照中土壤微生物群落的差異進(jìn)行研究分析;通過ANOSIM,MRPP以及PERMANOVA三種方法進(jìn)行不相似性檢驗(yàn)(Dissimilarity test),基于FAROTAX[18]對(duì)細(xì)菌群落功能進(jìn)行預(yù)測,基于FUNGuild對(duì)真菌群落功能進(jìn)行預(yù)測。

1.4.3分析生態(tài)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 為了闡明施肥對(duì)土壤中微生物相互作用,我們通過隨機(jī)矩陣構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育的(Molecular ecological networks)MENs?；诶碚?RMT)的單邊網(wǎng)絡(luò)分析方法(MENA,http://ieg2.ou.edu/MENA),得到4個(gè)網(wǎng)絡(luò)。對(duì)于細(xì)菌和真菌,少于4個(gè)樣本中出現(xiàn)的OTU不會(huì)進(jìn)入到網(wǎng)絡(luò)中。通過設(shè)置合適的閾值(未刪除低豐度的和未知的OTU),構(gòu)建分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)MENs[19]。對(duì)單邊網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(節(jié)點(diǎn)(node)、邊(edge)、平均度(avgK)、平均聚類系數(shù)(avgCC))進(jìn)行了分析。單邊網(wǎng)絡(luò)圖使用Gephi進(jìn)行可視化。對(duì)網(wǎng)絡(luò)的核心物種進(jìn)行分析,依據(jù)節(jié)點(diǎn)的拓?fù)涮卣骺蓪⒐?jié)點(diǎn)屬性分為4種類型,包括:Module hubs (模塊中心點(diǎn)Zi >2.5且Pi<0.62),Connectors (連接節(jié)點(diǎn),Zi<2.5且Pi >0.62),Network hubs (網(wǎng)路中心點(diǎn),Zi >2.5且Pi >0.62)以及Peripherals (外圍節(jié)點(diǎn),Zi<2.5且Pi <0.62)。

2 結(jié)果與分析

2.1 植被群落結(jié)構(gòu)功能

如表1所示,施有機(jī)肥處理后,植被蓋度與對(duì)照相比差異極顯著(P<0.01),而高度、地上生物量及物種數(shù)與對(duì)照相比均有升高,但差異不顯著。

表1 植被群落結(jié)構(gòu)功能

2.2 土壤理化性質(zhì)分析

由表2可以看出,施有機(jī)肥處理后,土壤全氮、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、有機(jī)質(zhì)分別提高 17.28%,5.24%,0.97%,28.69%,但差異不顯著。土壤濕度含量則顯著高于對(duì)照(P<0.05),土壤電導(dǎo)率和有機(jī)質(zhì)含量均極顯著高于對(duì)照(P<0.01)。

表2 土壤因子的差異比較

2.3 土壤微生物差異分析

2.3.1微生物物種組成 為研究退化人工草地土壤細(xì)菌群落和真菌群落組成成分,分別在門水平和屬水平對(duì)其進(jìn)行比較(圖2)。在門水平上,退化人工草地土壤細(xì)菌群落(圖2a)中變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimomadetes)為主要優(yōu)勢菌門,其相對(duì)豐度超過1%。施有機(jī)肥處理的細(xì)菌群落中變形菌門和厚壁菌門(Firmicutes)相對(duì)豐度高于對(duì)照,相對(duì)豐度分別為30.02%,8.13%;在細(xì)菌門水平上,綠彎菌門(Chloroflexi)、巴紐爾斯菌門(Balneolaeota)、螺旋體門(Spirochaetes)豐度在施有機(jī)肥組與不施有機(jī)肥組間差異顯著(P<0.05),念珠菌(CandidatusSaccharibacteria)豐度在兩組間差異極顯著(P<0.01);細(xì)菌群落在屬水平上(圖2b),主要優(yōu)勢菌門由微小桿菌屬(Exiguobacterium)、Gp6、Pseudomonas、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)組成。其中,Exiguobacterium在施肥處理時(shí)豐度最高,達(dá)到了7.42%;Gp6,Sphingomonas以及Gp4平均豐度分別是6.55%,4.09%和3.22%。在細(xì)菌屬水平上,Gp7的豐度在施有機(jī)肥組與對(duì)照組間差異顯著(P<0.05)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)的豐度在兩組間存在極顯著差異(P<0.01)。

圖2 土壤中細(xì)菌群落(2a)和真菌群落(2c)門水平組成分析,細(xì)菌群落(2b)和真菌群落(2 d)屬水平組成分析

真菌群落組成中,在門水平上,真菌群落(圖2c)中子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)為主要優(yōu)勢菌門,其相對(duì)豐度超過1%。在真菌門中Basidiomycota的相對(duì)豐度高于對(duì)照,相對(duì)豐度為20.78%。在真菌屬水平上(圖2d)排在前四位的屬有光黑殼屬(Preussia)、白冬胞酵母屬(Leucosporidium)、梭菌屬(Cristinia)、粉孢菌屬(Podospora)。Podospora和Pyrenophora在施肥處理后分別下降了55.69%和27.66%。

2.3.2細(xì)菌和真菌α多樣性 在施有機(jī)肥和對(duì)照的10個(gè)樣本中,檢測到土壤細(xì)菌4 371 890條序列,真菌2 652 449條序列,在97%的相似性水平下,10個(gè)樣本得到11 890個(gè)細(xì)菌OTU,2 313個(gè)真菌OTU。對(duì)土壤細(xì)菌的α多樣性進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)退化人工草地中土壤細(xì)菌和真菌的Observed Richness指數(shù)、Shannon指數(shù)、Inverse-simpson指數(shù)、Pielou-evenness指數(shù)、Simpson-evenness指數(shù)和Chao1指數(shù)在兩組間差異均不顯著(表3)。

表3 細(xì)菌和真菌α多樣性

2.3.3細(xì)菌和真菌β多樣性 為研究施有機(jī)肥與對(duì)照樣地土壤細(xì)菌群落和真菌群落的β多樣性,基于Bray-curtis和Jaccard距離及MRPP,ANOSIM,PERMANOVA三種方法的檢驗(yàn),結(jié)果表明組間差異顯著(P<0.05)。Dissimilarity分析(表4)得出相同的結(jié)論,且真菌群落用ANOSIM方法檢驗(yàn)結(jié)果顯示,在施有機(jī)肥和對(duì)照之間差異極顯著(P<0.01),這一結(jié)果說明施有機(jī)肥改變了土壤細(xì)菌和真菌群落的β多樣性。

表4 人工草地土壤細(xì)菌和真菌群落的不相似性檢驗(yàn)

2.4 環(huán)境因子與細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)相關(guān)性

土壤是土壤微生物的基質(zhì),土壤的理化性質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)對(duì)于土壤中微生物的群落變化具有重要的作用[20],為研究人工草地施有機(jī)肥后土壤細(xì)菌群落與環(huán)境因子之間的相關(guān)關(guān)系,采用Partial Mantel test進(jìn)行檢驗(yàn),結(jié)果(表5)表明,在細(xì)菌群落中發(fā)現(xiàn)地上生物量、全氮、硝態(tài)氮與細(xì)菌顯著相關(guān)關(guān)系(P<0.05),相關(guān)系數(shù)分別為r=0.702,r=0.233,r=0.433。在真菌群落中發(fā)現(xiàn)植被高度和銨態(tài)氮與真菌存在顯著相關(guān)關(guān)系(P<0.05),相關(guān)系數(shù)分別為r=0.725,r=0.041。

表5 土壤細(xì)菌和真菌群落差異與環(huán)境因子的Partial Mantel檢驗(yàn)

2.5 土壤細(xì)菌和真菌群落功能預(yù)測

土壤微生物群落功能直接影響著生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定與功能的發(fā)揮,本研究使用FAPROTAX對(duì)人工草地中細(xì)菌和真菌群落的功能進(jìn)行預(yù)測,并用TBtools軟件做熱圖。圖3a顯示了所測樣本中細(xì)菌群落功能注釋結(jié)果,統(tǒng)計(jì)分析了相對(duì)豐度較高的13類預(yù)測功能。結(jié)果顯示施用有機(jī)肥和對(duì)照處理在功能預(yù)測結(jié)果顯示,除硝化作用(Nitrification)和好氧氨氧化作用(Aerobic ammonia oxidation)相對(duì)豐度較高外,其他預(yù)測功能相對(duì)豐度均較低,且差異不顯著。圖3b顯示了所測樣本中真菌群落功能注釋結(jié)果,統(tǒng)計(jì)分析了相對(duì)豐度較高的20類預(yù)測功能,其中有6類被標(biāo)記為腐生營養(yǎng)型、9類為共生營養(yǎng)型、5類為病理營養(yǎng)型。由圖3b可知,與對(duì)照相比,施用有機(jī)肥后未定義腐生真菌(Undefined saprotrophs)的相對(duì)豐度提高,而排泄物腐生真菌(Dung saprotroph)、植物病原真菌(Plant pathogen)的相對(duì)豐度降低,其他真菌群落的相對(duì)豐度變化均呈現(xiàn)較低水平,且差異均不顯著。這表明,在退化人工草地上,施有機(jī)肥可能減弱細(xì)菌群落的硝化作用和好氧氨氧化作用,增強(qiáng)真菌群落的腐生營養(yǎng)型真菌作用。

圖3 土壤細(xì)菌和真菌群落功能預(yù)測

2.6 施有機(jī)肥對(duì)土壤微生物單邊網(wǎng)絡(luò)的特征

做土壤微生物單邊網(wǎng)絡(luò)時(shí),為達(dá)到網(wǎng)絡(luò)分析的要求,每個(gè)樣方采土樣2次,分別為10個(gè)生物學(xué)重復(fù)。對(duì)施有機(jī)肥和對(duì)照的16S,ITS測序結(jié)果構(gòu)建了單邊網(wǎng)絡(luò)(圖4),研究施有機(jī)肥對(duì)人工草地土壤微生物群落相互作用的影響,采用相似的閾值構(gòu)建不同處理土壤細(xì)菌和真菌的單邊網(wǎng)絡(luò),比較網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)系數(shù)。從表6可知,細(xì)菌群落中,施有機(jī)肥(F)的處理(節(jié)點(diǎn)=610,連接=10 703)相較對(duì)照(CK)(節(jié)點(diǎn)=1793,連接=49 728)網(wǎng)絡(luò)規(guī)模更小,這表明施有機(jī)肥后細(xì)菌群落網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性可能更低,而對(duì)于真菌網(wǎng)絡(luò),施有機(jī)肥(F)的處理(節(jié)點(diǎn)=317,連接=1 289)相較對(duì)照CK(節(jié)點(diǎn)=297,連接=645)網(wǎng)絡(luò)規(guī)模更大,這說明施有機(jī)肥后真菌群落網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性較高(表7)。此外在細(xì)菌群落網(wǎng)絡(luò)中,施有機(jī)肥的正相關(guān)關(guān)系是88.65%,負(fù)相關(guān)關(guān)系11.37%;對(duì)照的正相關(guān)關(guān)系是55.72%,負(fù)相關(guān)關(guān)系44.28%。在真菌群落網(wǎng)絡(luò)中,施有機(jī)肥的正相關(guān)關(guān)系64%,負(fù)相關(guān)關(guān)系36%;對(duì)照的正相關(guān)關(guān)系66.38%,負(fù)相關(guān)關(guān)系33.63%。

表6 單邊網(wǎng)絡(luò)屬性

圖4 單邊網(wǎng)絡(luò)可視化

用Zi-Pi圖顯示了基于模塊的拓?fù)浣巧瞻?CK)和施有機(jī)肥(F)處理土壤中OTUs的分布(圖5)。根據(jù)簡化分類,在閾值Zi = 2.5,Pi = 0.62處,網(wǎng)絡(luò)內(nèi)所有節(jié)點(diǎn)都屬于模塊中心點(diǎn)(Module hubs)、連接節(jié)點(diǎn)(Connectors)、網(wǎng)絡(luò)中心點(diǎn)(Network hubs)、外圍節(jié)點(diǎn)(Peripherals)四個(gè)子類別。來自CK和F處理網(wǎng)絡(luò)的許多節(jié)點(diǎn)(> 97%)被歸類為外圍節(jié)點(diǎn),它們只有很少的交互,通常連接到自己模塊中的節(jié)點(diǎn)。在細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)中,CK處理的變形菌門(OTU_1611和OTU_1456),未識(shí)別類(OTU_778和OTU_883)為模塊中心點(diǎn)。施有機(jī)肥(F)處理后,芽單胞菌門(OTU_488和OTU_588)為模塊中心點(diǎn)。在真菌群落的網(wǎng)絡(luò)中,CK處理的擔(dān)子菌門(OTU_2497)為模塊中心點(diǎn),而有機(jī)肥(F)處理后網(wǎng)絡(luò)中無模塊中心點(diǎn)。

圖5 OTU根據(jù)其拓?fù)渥饔玫腪i-Pi分布圖

3 討論

在退化人工草地施有機(jī)肥后,對(duì)植被蓋度、高度、生物量、物種數(shù)、重要值和植物群落物種多樣性等指標(biāo)都有一定的影響。研究顯示,施有機(jī)肥刺激了植物的生長,提高草地生產(chǎn)力[21],提高草地生物量水平[22]。宋君祥等[23]研究發(fā)現(xiàn)施有機(jī)肥能提高植株高度、蓋度,增加物種數(shù)量,改善植物群落結(jié)構(gòu)并提高群落穩(wěn)定性。施有機(jī)肥后,退化人工草地的蓋度、高度、生物量、物種數(shù)均增高,這與陳積山等[24]的研究結(jié)果一致。另外,土壤濕度在施有機(jī)肥后有所增加,原因可能是有機(jī)肥施用提高土壤的保水保肥能力,土壤結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定,利于土壤水肥協(xié)調(diào)供應(yīng)[25-26],進(jìn)而增加了土壤濕度。土壤電導(dǎo)率在施有機(jī)肥后增加顯著,是因?yàn)槭┯袡C(jī)肥改善了退化人工草地植被狀況,植被高度、蓋度和地上生物量有所增加[27]。土壤有機(jī)質(zhì)在施有機(jī)肥后顯著增加,原因是施用有機(jī)肥可增加土壤微生物群落和多樣性,提高土壤有機(jī)質(zhì)(SOM)及溶解性有機(jī)質(zhì)(DOM)含量[28]。表明有機(jī)肥施用對(duì)退化草地植被和土壤具有一定的改良作用,長期施用后對(duì)培肥地力具有重要意義。

施有機(jī)肥當(dāng)年土壤細(xì)菌群落組成以變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)等為主要優(yōu)勢菌門,這與張杰雪等[29]的研究結(jié)果相似。真菌群落組成以子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)為主要優(yōu)勢菌門,這與高雪峰等[30-31]的研究結(jié)果相一致。本研究檢測出的細(xì)菌OTU數(shù)以及種類均高于真菌的,表明高寒地區(qū)退化人工草地土壤微生物類群以細(xì)菌為主,這與楊希智等[32]有關(guān)高寒草地土壤微生物的研究結(jié)果一致。真菌多樣性和豐富度分析結(jié)果顯示,施用有機(jī)肥高于對(duì)照草地,這與植物群落多樣性對(duì)土壤微生物的影響結(jié)果相同,植物群落多樣性增加可以提高土壤微生物多樣性[33]。土壤微生物數(shù)量和多樣性的大小是表征土壤肥力狀況的重要生物學(xué)指標(biāo)之一,土壤養(yǎng)分與微生物生物量呈正相關(guān)[34]。薛凱等[35]的研究發(fā)現(xiàn),銨態(tài)氮和速效磷與土壤微生物的多樣性有顯著的相關(guān)性,齊文娟等[36]的研究也證實(shí)了總氮與速效磷對(duì)土壤微生物影響顯著,這與本文的結(jié)果相一致。

運(yùn)用FAPROTAX對(duì)土壤細(xì)菌功能類群進(jìn)行研究,結(jié)果顯示比例較高的功能類群有好氧氨氧化型、硝化作用等。施用有機(jī)肥與對(duì)照處理下的土壤細(xì)菌功能之間差異不顯著。這與郭城[37]的研究結(jié)果相似,有機(jī)肥可以為土壤提供更均衡和穩(wěn)定的營養(yǎng)供應(yīng),促進(jìn)它們生長繁殖[38],促進(jìn)土壤中氮素養(yǎng)分的維持[39]。用FUNGuild對(duì)土壤真菌群落功能進(jìn)行預(yù)測分析,主要以腐生營養(yǎng)型和病理營養(yǎng)型為主,這與Nguyen等[40]的相關(guān)研究結(jié)果相似。本研究中,施有機(jī)肥后人工草地中,病理營養(yǎng)型真菌群落的豐度有所降低,表明土壤的養(yǎng)分管理實(shí)踐對(duì)增加有益共生真菌的相對(duì)豐度有積極影響,同時(shí)降低了潛在病原真菌群落的相對(duì)豐度[41]。施有機(jī)肥改善了土壤微生物群落功能組成,改善土壤微生物有益菌群比例,提高土壤恢復(fù)質(zhì)量。

利用單邊網(wǎng)絡(luò)對(duì)施有機(jī)肥后土壤微生物群落的相互作用關(guān)系進(jìn)行了分析,網(wǎng)絡(luò)中存在的節(jié)點(diǎn)和邊代表了網(wǎng)絡(luò)的規(guī)模以及關(guān)系復(fù)雜程度[42]。網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中微生物間正相關(guān)代表著互惠關(guān)系,而負(fù)相關(guān)則代表著競爭關(guān)系[43]。施有機(jī)肥后,細(xì)菌的網(wǎng)絡(luò)規(guī)模減少了,但是與對(duì)照相比,其正相關(guān)關(guān)系顯著增加,說明細(xì)菌群落內(nèi)部的互利共生關(guān)系顯著增強(qiáng)。對(duì)于真菌群落,施有機(jī)肥增加了網(wǎng)絡(luò)規(guī)模,網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)和連接數(shù)更高,說明真菌群落間的關(guān)系更復(fù)雜,網(wǎng)絡(luò)更穩(wěn)定。模塊中心點(diǎn)被認(rèn)為是土壤微生物網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)[44]。在施有機(jī)肥條件下,不同的OTU被分配到不同的模塊中,表明施有機(jī)肥會(huì)改變土壤微生物群落的網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵微生物種群。在細(xì)菌群落中,施肥后的核心微生物由不施肥的變形菌門轉(zhuǎn)換成芽單胞菌門,芽單胞菌門能夠適應(yīng)各類干旱環(huán)境,能夠參與基本的生物過程[45],這表明微生物的改變可能會(huì)改善土壤的生態(tài)功能。

4 結(jié)論

施有機(jī)肥對(duì)退化人工草地的植被恢復(fù)有促進(jìn)作用,顯著增加了植被蓋度的同時(shí),群落的高度、地上生物量及物種數(shù)也有所增加。施有機(jī)肥當(dāng)年,改變了土壤真菌和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和潛在功能,降低了具有硝化作用和好氧氨氧化作用能力的細(xì)菌群落相對(duì)豐度和病理營養(yǎng)型真菌群落的相對(duì)豐度,促進(jìn)了土壤有益菌群的發(fā)展,改良了土壤理化性質(zhì),改善了退化人工草地的植被狀況。同時(shí)也增大了退化草地土壤微生物生態(tài)網(wǎng)絡(luò)的規(guī)模,增進(jìn)了正相關(guān)關(guān)系,改變了組成微生物網(wǎng)絡(luò)的核心物種,因此施有機(jī)肥是修復(fù)退化人工草地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、微生物群落多樣性及微生物間互作關(guān)系的有效措施,這可能對(duì)監(jiān)測退化人工草地的生態(tài)系統(tǒng)功能具有重要意義。