李 樂, 李丹寧, 楊葉研, 潘新雅, 萬懿琦, 張國云, 席杰軍, 王亞芳*, 楊培志*

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院, 陜西 楊凌 712100; 2. 西北農(nóng)林科技大學(xué)旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室,陜西 楊凌 712100)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)不僅產(chǎn)量高、適應(yīng)性強、分布廣,而且營養(yǎng)價值高、固氮效果好,被譽為“牧草之王”[1-2]。自然環(huán)境下,苜蓿根部與根瘤菌共生固氮,可以將大氣中游離的氮轉(zhuǎn)化為植物生長發(fā)育所需的氮素,為苜蓿提供氮肥,減少氮肥大量施加帶來的污染,研究報道,增加植物氮肥攝入能提高植物對干旱等環(huán)境脅迫的抵抗力[3]。另外,苜蓿根系發(fā)達,在改善生態(tài)環(huán)境、水土保持方面也具有天然優(yōu)勢[4]。

苜蓿是高耗水類型牧草,每形成1 g干物質(zhì)需水900～1 000 g[5]。然而,我國苜蓿種植區(qū)主要分布在西北、華北、東北以及黃淮海等地區(qū),其中70%屬于干旱或半干旱的地區(qū)[6]。雖然苜蓿有一定的抗旱能力,但是在灌溉條件下才能獲得高產(chǎn)量高品質(zhì)苜蓿。我國是淡水資源緊缺的國家,隨著全球氣候變暖,土壤和水分環(huán)境逐漸惡化,干旱脅迫也日趨嚴重[7]。干旱脅迫降低了苜蓿的品質(zhì)及產(chǎn)量,影響了苜蓿的種植分布,是制約紫花苜蓿產(chǎn)業(yè)發(fā)展的最主要環(huán)境因子[4,8-9]。

干旱作為一種多維脅迫,能夠引起植物從表型、生理、生化再到分子水平的一系列變化[10]。干旱脅迫首先引起植物葉片細胞水分虧缺,水分信號轉(zhuǎn)變?yōu)橹参锛に孛撀渌?Abscisic aid,ABA)信號[11],能通過減小氣孔開度的方式以降低干旱導(dǎo)致的葉片蒸騰作用,調(diào)節(jié)植物水分平衡[12]。同時植物產(chǎn)生復(fù)雜的代謝變化響應(yīng)維持細胞穩(wěn)態(tài)平衡[13],以避免植物水分失衡、代謝紊亂最終導(dǎo)致的萎蔫死亡,其中涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、滲透調(diào)控、激素和次生代謝產(chǎn)物等多種途徑的調(diào)控[14-16]。ABA對提高植物抗旱能力效果明顯,是重要的抗蒸騰劑或抗旱誘導(dǎo)因子[17-18],ABA誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉是緩解干旱脅迫的重要途徑[15,19]。一方面ABA誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉,提高水分利用效率(WUE:通過蒸騰作用損失的每單位水所獲取的碳量)[20],減弱蒸騰作用。另一方面,ABA的積累激發(fā)植物的滲透調(diào)節(jié)、抗氧化系統(tǒng)等代謝變化[21],最終緩解植物遭受干旱脅迫引起的滲透脅迫[22-23]與氧化脅迫等代謝功能障礙[17]。因此,ABA是植物應(yīng)答干旱脅迫的重要激素[17],也是有效的抗蒸騰劑[20],另外研究發(fā)現(xiàn)水楊酸鈉(Sodium salicylate,NaSA)、乙烯(Ethylene,ET)、茉莉酸(Jasmonic acid,JA)等代謝物質(zhì)對氣孔也有調(diào)控作用。然而,對于干旱脅迫下紫花苜蓿葉片的代謝變化以及外源差異代謝物對氣孔的調(diào)控作用缺少相關(guān)報道。因此,本研究闡明干旱脅迫下紫花苜蓿葉片的代謝物變化,從中篩選影響葉片蒸騰和氣孔開度的物質(zhì),為開發(fā)苜蓿氣孔調(diào)節(jié)物質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紫花苜?！走_克之星’(MedicagosativaL. ‘Ladak+’)和苜蓿專用根瘤菌制劑多萌(Rhizobiummelilotistrain Dormal)購買自北京克勞沃種業(yè)有限公司。

1.2 試驗處理

1.2.1種子萌發(fā) 種子萌發(fā)采用暗發(fā)芽。挑選飽滿的紫花苜蓿種子用70%乙醇溶液浸泡消毒15 min,蒸餾水沖洗5次后置于鋪有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中,用錫紙完全包裹培養(yǎng)皿進行暗發(fā)芽,4℃春化2 d后置于人工氣候室中(溫度25℃,空氣相對濕度40%)培養(yǎng)5 d,種子萌發(fā)期間,每隔12 h適當補充蒸餾水,以保證濾紙持續(xù)濕潤、種子正常吸脹[24]。

1.2.2苜蓿苗期培養(yǎng)與根瘤菌接種 將子葉完全展開的健康幼苗移栽到裝有100 目無菌石英砂的培養(yǎng)缽(高18 cm×上直徑10 cm×下直徑8 cm,已滅菌)中,放置人工氣候室中培養(yǎng),生長環(huán)境為溫度25℃,空氣相對濕度40%,16 h光照,光照強度為122.4 μmol·m-2·s-1。為模擬自然狀態(tài)下紫花苜蓿與根瘤菌共生固氮的生長狀態(tài),苜蓿移栽后7 d(苜蓿幼苗生長約3 cm)接種一次根瘤菌,30 d二次接種根瘤菌。每天澆灌無氮Hoagland營養(yǎng)液以激活根瘤固氮作用[24-25]。生長期間在60 d刈割一次,苜蓿培養(yǎng)至90 d進行干旱處理,此時苜蓿根部形成具有固氮活性的粉紅色根瘤[26-27]。

1.2.3苜蓿干旱處理 采用埋干砂脫水法對苜蓿進行模擬干旱處理。以前期研究[28]為依據(jù),采用0 h,3 h,8 h埋干砂脫水處理模擬干旱脅迫前(D0),輕度干旱(D1),重度干旱(D2)。待苜蓿生長至90 d,將苜蓿盡量無損傷地從培養(yǎng)缽中拔出,然后將根部的沙子用緩流水沖洗干凈,根部輕柔地包裹在吸水紙(18 cm×18 cm)中吸干水分(此時為D0的采樣時間點),將D1,D2處理組的苜蓿根部放入培養(yǎng)缽并將其裝滿無菌100目干燥石英砂,分別進行3 h,8 h的脫水處理,并且在脫水脅迫后3 h(D1),8 h(D2)采樣。

在每個處理組中隨機選取3株苜蓿葉片混合成1個重復(fù),每組5個重復(fù),每個處理組15株苜蓿。將采集的苜蓿葉片迅速放入液氮中,所有樣品均保存在—80℃,用于葉片代謝組檢測。

1.3 苜蓿葉片代謝組測定

通過采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(Ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)方法分析對苜蓿葉片進行廣泛非靶向代謝組鑒定。代謝組檢測方法采用Waters ACQUITY超高效液色譜(UPLC)和Thermo Scientific Q-Exactive高分辨率/精確質(zhì)譜儀,該質(zhì)譜儀與加熱電噴霧電離(HESI-II)源和Orbitrap質(zhì)譜儀連接,以35 000質(zhì)量分辨率運行。將樣品提取物干燥,然后按照以下四種方法的需要準備樣品溶液,準備標準品以確保注射和色譜一致性。(1)第一份等分試樣使用酸性正離子條件分析,色譜優(yōu)化以獲得更多親水性化合物。在該方法中,使用含有0.05%全氟辛酸(PFPA)和0.1%甲酸(FA)的水和甲醇從C18柱(Waters UPLC BEH C18-2.1 mm×100 mm,1.7 μm)梯度洗脫提取物。(2)第二份等分試樣使用酸性正離子條件進行分析,并且對其進行色譜優(yōu)化,以獲得更疏水的化合物。在該方法中,使用甲醇、乙腈、水、0.05% PFPA和0.01% FA從上述相同的C18柱梯度洗脫提取物,并在總體較高的有機含量下操作。(3)第三份等分試樣使用基本負離子優(yōu)化條件分析,使用甲醇和水以及pH為8.0的6.5 mmol·L-1碳酸氫銨從單獨的專用C18柱中梯度洗脫堿性提取物。(4)第四份等分試樣通過負電離分析。使用由水和乙腈與10 mmol·L-1甲酸銨(pH 10.8)組成的梯度,從HILIC柱(Waters UPLC BEH Amide 2.1 mm×150 mm,1.7 μm)洗脫提取物。

1.4 外源施加差異代謝物

通過外源施加差異代謝物,測定苜蓿離體葉片的蒸騰量和氣孔開度,快速探索代謝組篩選的差異代謝物對氣孔開閉的影響。測定的差異代謝物有:脫落酸、棉子糖(Raffinose,RAF)、維生素B6(Pyridoxate,VB6)、煙酰胺(Nicotinamide,VB3)、脫氫抗壞血酸(Dehydroascorbate,DHA)、熊果苷(Hydroquinone beta-D-glucopyranoside,Arb)、組氨酸(Histidine,His)和脯氨酸(Proline,Pro)。苜蓿生長至90 d左右(方法同1.2.1和1.2.2),在試驗前2～3 h確保充足水分供給,選擇苜蓿頂端向下完全展開的第3～6片完整復(fù)葉,在水中剪取以防止在小葉柄處產(chǎn)生氣泡,迅速轉(zhuǎn)移到盛滿水的圓錐體塑料小容器中(高3.3 cm×上直徑6.2 cm×下直徑5 cm),容器頂部用塑料膜密封,塑料膜上扎6個小孔,并將合適孔徑的槍頭插在小孔中以支撐苜蓿葉柄,使苜蓿葉片完全展開并立于小容器內(nèi)。將裝載好的葉片放置在恒溫恒濕無風(fēng)的試驗條件(光照強度為122.4 μmol·m-2·s-1,濕度40%,溫度25℃)下3 h使氣孔完全打開(采用顯微鏡觀察測定),再將葉片轉(zhuǎn)移到裝有代謝組篩選的差異代謝物溶液的容器中進行蒸騰量測定和電鏡取樣。

1.5 苜蓿葉片蒸騰量測定

根據(jù)以下公式計算單位葉面積的蒸騰量(Transpiration),每個處理的苜?？偯娣e為18個小葉片的掃描面積(每個處理6個復(fù)葉,剪去復(fù)葉小葉柄),剪取小葉片平置在A4紙上,用透明文件夾(帶有標尺)夾住,放置在掃描儀中掃描葉片圖像,后用ImageJ測量葉面積。

(1)

式中,Tn是試驗第1,2,3,4 h時刻測定的單位葉面積蒸騰量(μg·cm-2);Mn是蒸騰測定1,2,3,4 h后的稱重量;M0是裝載6個葉片和處理液的裝置的初始稱重量;LA指每個處理(6個葉片)的總?cè)~面積。

1.6 苜蓿葉片氣孔開度的觀測

1.6.1電鏡生物樣品制作 取經(jīng)過外源差異代謝物處理4 h(同1.4)的苜蓿葉片,置于預(yù)冷的4%戊二醛溶液中,4℃過夜固定,經(jīng)過乙醇梯度脫水,丙酮置換浸透放入二氧化碳臨界點干燥儀中進行干燥,粘臺噴金后,在S-4800掃描電鏡下觀察葉片表皮氣孔形態(tài)特征,選取3 500倍及500倍視野照相。每片葉隨機觀察5個視野,每個處理重復(fù)5次。

1.6.2氣孔開度測定 觀察500 倍電鏡視野范圍內(nèi)的氣孔開度,用imageJ隨機測量每個處理的30個細胞的氣孔長和寬,按照電鏡視野標尺的大小換算出實際氣孔的數(shù)值,將氣孔開度定義為寬/長。

1.7 統(tǒng)計數(shù)據(jù)及分析

使用Metabolon的硬件和軟件提取代謝組原始數(shù)據(jù),采用(FDR)計算統(tǒng)計顯著性(P值),P<0.05,P<0.01的代謝物被認為是不同比較組間的顯著,極顯著的差異代謝物,后續(xù)進行主成分分析(PCA)、維恩圖(venny3.1.0)等統(tǒng)計分析。

利用照度計TES1330A測量光照強度,采用掃描儀(SONY FDR-AX60)掃描葉片圖像,利用ImageJ測量軟件測定葉面積、氣孔開度,用SPSS 24分析軟件進行單因素方差分析,多重比較采用LSD檢驗,采用Excel整理數(shù)據(jù)、做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 苜蓿葉片代謝組分析

2.1.1樣本質(zhì)控分析 對不同程度干旱脅迫下紫花苜蓿葉片進行廣泛非靶向代謝組檢測。依據(jù)紫花苜蓿葉片代謝組主成分分析(PCA)可知(圖1),主成分1和主成分2能夠?qū)⒉煌潭鹊母珊堤幚斫M分開,說明干旱脅迫引起苜蓿葉片代謝組發(fā)生變化;而每個處理的5個重復(fù)聚成一簇,說明樣品的重復(fù)性較好。

圖1 不同程度干旱脅迫下紫花紫花苜蓿葉片主成分分析(PCA)

2.1.2干旱脅迫下苜蓿葉片代謝物變化 代謝組檢測出211種代謝物,分為以下8類(圖2):氨基酸類(Amino acid)(68種,32.23%),脂類(Lipids)(44種,20.85%),糖類(Carbohydrate)(43種,20.38%),核苷酸類(Nucleotide)(16種,7.58%),輔因子、輔基、電子載體類(Cofactorsor Prosthetic Groups or Electron Carriers)(15種,7.11%),肽類(Peptide)(12種,5.69%),次生代謝類(Biosynthesis of secondary metabolites)(11種,5.21%),激素代謝類(Hormone metabolites)(2種,0.95%)。

圖2 不同程度干旱脅迫下紫花苜蓿葉片代謝組鑒定出的代謝物分類

對211個代謝物依據(jù)P<0.05篩選出99個差異代謝物。與輕度干旱(D1)相比,重度干旱(D2)脅迫下鑒定出更多的差異代謝物,且干旱脅迫下含量升高的(上調(diào))差異代謝物數(shù)量高于含量降低的(下調(diào))差異代謝物(表1)。

表1 不同程度干旱脅迫下紫花苜蓿葉片差異代謝物數(shù)量

代謝途徑分析表明,這些差異代謝物參與了苜蓿葉片的碳氮代謝。光呼吸(Photorespiration)是植物碳氮代謝的重要過程,而光呼吸的碳主要以氨基酸的方式輸出。氨基酸代謝是干旱脅迫下苜蓿葉片中產(chǎn)生差異代謝物質(zhì)最多的途徑(圖3),83%的氨基酸顯著上調(diào)(P<0.05),大量氨基酸積累,其中絲氨酸(Serine)、組氨酸等物質(zhì)的含量隨著干旱脅迫程度的加深不斷升高。

圖3 不同程度干旱脅迫下紫花苜蓿葉片差異代謝物分類

干旱導(dǎo)致植物體糖酵解(Lycolysis,EMP)水平降低,糖酵解途徑的關(guān)鍵物質(zhì)葡萄糖(Glucose)、6-磷酸葡萄糖(Glucose-6-phosphate,G6P)、丙酮酸鹽(Pyruvate)的含量均顯著降低(P<0.05)(圖3)。因此,干旱脅迫引起了苜蓿葉片的“碳饑餓”。干旱脅迫下,氨同化代謝(Ammonia assimilation metabolism)的關(guān)鍵代謝物質(zhì)谷氨酰胺(Glutamine)、脯氨酸以及鳥氨酸(Ornithine)含量顯著上調(diào)(P<0.05),說明干旱脅迫加劇植物體內(nèi)氨同化途徑代謝。代謝產(chǎn)物鳥氨酸上調(diào)進而導(dǎo)致多胺(Polyamines,PA)物質(zhì)精氨酸(Arginine)和5′-甲硫基腺苷(5′-methylthio adenosine,MTA)含量顯著上調(diào)(P<0.05)。干旱脅迫下苜蓿葉片的氮積累增加。因此,干旱脅迫引起苜蓿葉片中糖酵解、碳反應(yīng)(Calvin cycle)水平降低,氨同化和多胺水平上升,從而導(dǎo)致碳氮代謝失衡。

干旱引起苜蓿葉片激素含量變化。輕度(D1)、重度干旱(D2)處理下,苜蓿葉片中脫落酸鹽均顯著上調(diào)(P<0.05),說明干旱脅迫誘導(dǎo)ABA含量的積累。愈傷酸(Traumatic acid,TA)是植物體內(nèi)由磷脂類(Phospholipids)產(chǎn)生的一種非生物脅迫應(yīng)激反應(yīng)激素,其含量在干旱脅迫下不斷積累,在重度干旱處理下達到顯著差異(P<0.05)。

干旱脅迫下,植物葉片谷胱甘肽循環(huán)(GSH Cycle)以及抗氧化物質(zhì)含量增加,以緩解干旱脅迫引起的氧化損傷。GSH代謝中的關(guān)鍵物質(zhì)5-氧代脯氨酸(5-oxoproline)、絲氨酸上調(diào),乙酰絲氨酸(O-acetyl-serine)顯著下調(diào)(P<0.05),說明干旱脅迫下谷胱甘肽循環(huán)加劇。另外,干旱引起苜蓿葉片中維生素E(Alpha-tocopherol)、脫氫抗壞血酸、VB6等抗氧化劑顯著上調(diào)(P<0.05)。

干旱脅迫下,棉子糖家族低聚糖(RFOs)代謝增強以緩解干旱脅迫引起的滲透脅迫。干旱脅迫導(dǎo)致苜蓿葉片中大部分的糖類物質(zhì)含量顯著上調(diào)(P<0.05)(圖3),RFOs包括甜菜苷(Galactinol)、棉子糖(Raffinose)、山梨醇(Sorbitol)含量顯著上調(diào)(P<0.05),肌醇(Myo-inositol)含量顯著上調(diào)(P<0.05),說明干旱脅迫下,植物細胞不斷積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)保持膨壓維持細胞活性和膜運輸?shù)恼＿\轉(zhuǎn),提高植物抗性。然而,這些RFOs的積累是以降低其它碳循環(huán)的關(guān)鍵物質(zhì)含量為代價的,例如糖酵解途徑的葡萄糖(Glucose)、G6P(Glucose 6-phosphate)、草酰乙酸途徑的天冬氨酸(Aspartate)、谷胱甘肽循環(huán)的甜菜堿(Betaine)、碳反應(yīng)中的關(guān)鍵代謝物甘油酸鹽(Glycerate)等含量的顯著降低(P<0.05)。

總之,干旱脅迫引起苜蓿葉片中碳缺乏、氮積累繼而導(dǎo)致碳氮代謝失衡;干旱脅迫引起苜蓿葉片中ABA、愈傷酸的含量顯著增加,并隨著脅迫程度的加深而加劇(P<0.05);干旱脅迫增強苜蓿葉片中谷胱甘肽循環(huán),促進棉子糖家族低聚糖(RFOs)明顯積累,從而提高苜蓿的抗氧化能力和滲透調(diào)節(jié)能力。

2.2 外源施加差異代謝物對苜蓿葉片蒸騰和氣孔開度的影響

依據(jù)代謝物的理化性質(zhì)和在干旱脅迫下的含量變化,并通過文獻查閱這些代謝物對植物的作用,本研究初步篩選了顯著變化的差異代謝物質(zhì)(脫落酸、棉子糖、VB6、煙酰胺、脫氫抗壞血酸、熊果苷、組氨酸和脯氨酸),通過分析外源施加以上差異代謝物對離體苜蓿葉片的蒸騰量和氣孔開度的影響,篩選紫花苜蓿的氣孔調(diào)節(jié)物質(zhì)。

2.2.1ABA對苜蓿葉片蒸騰和氣孔開度的影響 代謝組結(jié)果顯示,輕度和重度干旱脅迫下植物激素ABA含量顯著增加,分別對照組的3.80和4.55倍(圖3)。因此,本研究首先分析了外源施加ABA對苜蓿葉片單位面積蒸騰量和氣孔開度的影響。

隨著外源施加ABA濃度的增大,苜蓿葉片單位面積蒸騰量逐漸減小,并隨著處理時間的增加更為明顯(圖4)。ABA濃度達到0.05 μmol·L-1時,苜蓿葉片蒸騰量顯著低于對照組(CK,蒸餾水)(P<0.05);ABA濃度達到0.1 μmol·L-1時,葉片蒸騰量顯著低于CK及0.05 μmol·L-1ABA處理(P<0.05)。

圖4 外源施加脫落酸(ABA)對紫花苜蓿離體葉片的蒸騰量的影響

隨著外源施加ABA濃度的增大,苜蓿葉片氣孔逐漸關(guān)閉(圖5a)。外源施加ABA濃度達到0.05 μmol·L-1時,葉片氣孔明顯關(guān)閉,氣孔開度顯著低于對照組(P<0.05)(圖5b)。外源施加ABA濃度達到0.1 μmol·L-1時,氣孔幾乎完全關(guān)閉,氣孔開度與CK,0.05 μmol·L-1ABA處理均有顯著差異(P<0.05)。因此,外源施加ABA能夠誘導(dǎo)苜蓿氣孔關(guān)閉,降低葉片單位面積蒸騰量。

2.2.2棉子糖協(xié)同ABA誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉 輕度和重度干旱脅迫下的紫花苜蓿對比對照組,葉片中的棉子糖含量分別提高了5.37和8.28倍(圖3),然而外源施加1 μmol·L-1或1 mmol·L-1RAF 4 h后,單位面積葉片的蒸騰量與對照均無顯著差異,說明外源施加RAF對苜蓿葉片蒸騰量無顯著影響(圖6)。然而,掃描電鏡結(jié)果顯示,外源施加 1 mmol·L-1RAF時,葉片氣孔開度顯著降低(P<0.05)(圖7),表明1 mmol·L-1RAF具有促進葉片氣孔關(guān)閉的作用,但其促進氣孔關(guān)閉的效果低于0.05 μmol·L-1ABA。

圖6 外源施加棉子糖(RAF)對紫花苜蓿離體葉片的蒸騰量的影響

圖7 外源施加棉子糖(RAF)對紫花苜蓿離體葉片氣孔開度的影響

為了闡明RAF是否能夠協(xié)同ABA促進氣孔的關(guān)閉的作用,測定了外源同時施加RAF和ABA對葉片蒸騰量及氣孔開度的影響。結(jié)果表明,外源同時施加1 mmol·L-1RAF和0.05 μmol·L-1ABA 3 h后,葉片蒸騰量顯著低于0.05 μmol·L-1ABA(P<0.05)(圖6)。掃描電鏡結(jié)果顯示,外源同時施加RAF和ABA時,苜蓿葉片氣孔完全關(guān)閉,氣孔開度顯著低于單獨施加ABA與單獨施加1 mmol·L-1的RAF(P<0.05)。因此,RAF促進了ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉。

2.2.3VB6抑制ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉 輕度和重度干旱脅迫下的紫花苜蓿對比對照組,葉片中的VB6含量分別提高了1.89和2.71倍(圖3),然而外源施加1 μmol·L-1,10 μmol·L-1VB64 h后,單位面積葉片的蒸騰量與對照均無顯著差異,說明外源施加VB6對苜蓿葉片蒸騰量無顯著影響(圖8)。掃描電鏡結(jié)果表明,外源施加10 μmol·L-1VB6時,葉片氣孔開度顯著高于對照(P<0.05)(圖9),表明VB6具有促進苜蓿葉片氣孔打開的作用。

圖8 外源施加維生素B6(VB6)對紫花苜蓿離體葉片蒸騰量的影響

圖9 外源施加維生素B6 (VB6)對紫花苜蓿離體葉片氣孔開度的影響

外源同時施加10 μmol·L-1VB6和0.1 μmol·L-1ABA時,葉片蒸騰量顯著高于單獨施加0.1 μmol·L-1ABA(P<0.05)。掃描電鏡結(jié)果表明同時施加VB6和ABA時,氣孔開度顯著大于單獨施加ABA處理(P<0.05)。因此,外源施加VB6能夠抑制ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉,增加氣孔開度,提高葉片的蒸騰量。

通過對苜蓿離體葉片外源施加差異代謝物質(zhì)發(fā)現(xiàn),外源ABA誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉;外源RAF能夠促進氣孔關(guān)閉,與ABA具有協(xié)同作用;外源VB6能夠促進氣孔打開,抑制ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉。此外,我們還分析了外源施加其它差異代謝物質(zhì)對苜蓿葉片單位面積蒸騰量的影響,發(fā)現(xiàn)煙酰胺、熊果苷、脫氫抗壞血酸、脯氨酸、組氨酸等對苜蓿離體葉片蒸騰量無顯著影響。

3 討論

研究表明,干旱脅迫下,植物產(chǎn)生復(fù)雜的代謝動態(tài)響應(yīng),以減少水分散失來維持植物的生長發(fā)育[14,16],其中涉及激素代謝、碳氮代謝、RFOs積累及其它物質(zhì)代謝、滲透調(diào)節(jié)等多種途徑的調(diào)控[12,15]。本研究結(jié)果顯示,在干旱脅迫下,紫花苜蓿葉片中大量代謝物積累,引起碳代謝相關(guān)的糖酵解水平降低、碳反應(yīng)減弱,氮代謝相關(guān)的氨同化代謝加劇、多胺水平上升,導(dǎo)致植物體內(nèi)碳氮代謝失衡,這與以往研究一致[12,14-16]。干旱脅迫下,植物的生存和生長均依賴于葉片氣孔對碳獲取和蒸騰的調(diào)控[29],其中植物維持碳平衡的能力與代謝物含量的變化相關(guān)[30]。研究表明,脫落酸[22-23]等激素、脯氨酸[25]等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)能提高苜?？购的芰12],本研究結(jié)果顯示,干旱脅迫下,紫花苜蓿葉片中ABA、愈傷酸等激素含量,滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(棉子糖、脯氨酸等)以及抗氧化物質(zhì)(VB6等)不斷積累,對提高苜蓿的抗旱能力積極作用。

干旱誘導(dǎo)ABA積累調(diào)控植物氣孔開度以減少水分蒸騰從而提高植物抗旱性[10]。大量的分子生物學(xué)和生理學(xué)研究已經(jīng)闡明了ABA調(diào)控氣孔開閉的機制[31]。研究表明,氣孔運動實際上可能由抗逆誘導(dǎo)因子ABA[17-18]與多種物質(zhì)例如赤霉素(Gibberellin,GA)、乙烯、水楊酸等共同控制[32-33],而干旱引起的差異代謝物質(zhì)與ABA在調(diào)控氣孔方面是否有關(guān)系值得討論。本研究探討了苜蓿葉片中的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)RAF、脯氨酸以及抗氧化物質(zhì)VB6等在干旱脅迫下顯著積累的差異代謝物對苜蓿葉片蒸騰和氣孔開度的影響及其與ABA的關(guān)系。植物在干旱脅迫下積累各種有機物質(zhì)、無機物質(zhì),調(diào)節(jié)體內(nèi)代謝物質(zhì)的變化以降低細胞滲透勢即滲透調(diào)節(jié),緩解細胞滲透壓失衡導(dǎo)致的代謝活動紊亂[34-36],對于保持植物葉片的含水量,保持膨壓,維持細胞活性和膜運輸?shù)恼＿\轉(zhuǎn),在維持氣孔開度、穩(wěn)定光合速率以及保持細胞繼續(xù)生長有重要作用[37-38],本研究結(jié)果顯示,苜蓿葉片不斷積累脯氨酸、棉子糖、甜菜堿等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以緩解干旱導(dǎo)致的滲透脅迫。代謝組分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),干旱脅迫下,紫花苜蓿葉片中多種RFOs物質(zhì)含量升高,且重度干旱下RFOs含量升高較輕度干旱更為顯著。研究表明,RFOs是植物體在脅迫下產(chǎn)生的一類不影響細胞正常代謝過程的保護性滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[34],同時RFOs也參與了碳的運輸和儲存[38],RFOs物質(zhì)的積累不僅參與苜蓿葉片的滲透調(diào)節(jié),而且可能與緩解干旱導(dǎo)致的碳氮代謝失衡有關(guān)。研究表明,棉子糖是RFOs中的一種功能性低聚糖,普遍存在于所有植物中,在干旱脅迫下迅速積累[34]。本試驗的結(jié)果顯示,外源RAF能夠促進苜蓿葉片氣孔關(guān)閉,并且與ABA具有協(xié)同作用。研究表明,在干旱脅迫下,植物體內(nèi)過度產(chǎn)生活性氧(ROS),對植物造成氧化應(yīng)激,從而破壞植物的光合機制[13],而植物體內(nèi)的谷胱甘肽循環(huán)加劇、抗氧化物積累能夠緩解干旱脅迫引起的氧化損傷[39-41],本試驗的結(jié)果顯示,苜蓿葉片中谷胱甘肽循環(huán)加劇,VB6積累等抗氧化物質(zhì)積累,其中VB6是植物中的有效抗氧化劑,其抗氧化活性甚至高于維生素C或E[42],VB6還是氨基酸生物合成中的重要輔因子[43],在植物生長發(fā)育和應(yīng)對干旱脅迫起著重要作用[24,44-45],同時VB6與ABA途徑以及氮代謝之間還存在重要聯(lián)系[45-46],因此VB6不僅參與苜蓿葉片的抗氧化,而且可能與ABA途徑調(diào)控氣孔運動緊密相關(guān)[45]。本試驗的結(jié)果顯示,VB6含量隨著干旱脅迫程度的加深不斷積累,而且外源VB6能夠促進苜蓿葉片氣孔打開,抑制ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉,與ABA有拮抗作用。本研究以干旱脅迫下苜蓿葉片代謝組分析為基礎(chǔ),進一步證實差異代謝物質(zhì)RAF,VB6在氣孔調(diào)控方面有不同作用,并且與ABA有關(guān),對提高苜?？购敌匝芯刻峁┝艘恍┧伎?然而,RAF和VB6調(diào)控苜蓿氣孔的機制尚不清楚,對于氣孔調(diào)節(jié)劑的開發(fā)缺乏更加深入的產(chǎn)品研究及推廣實踐。

4 結(jié)論

干旱脅迫引起紫花苜蓿葉片碳氮代謝失衡,脫落酸、愈傷酸含量顯著增加,并隨著脅迫程度的加深而加劇;干旱脅迫增強谷胱甘肽循環(huán),促進棉子糖家族低聚糖(RFOs)等物質(zhì)明顯積累,從而提高苜蓿的抗氧化能力和滲透調(diào)節(jié)能力。外源棉子糖能夠促進紫花苜蓿葉片氣孔關(guān)閉,并且棉子糖與脫落酸具有協(xié)同作用,能夠促進脫落酸誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉;維生素B6能夠促進氣孔打開,并且維生素B6與脫落酸具有拮抗作用,能夠抑制脫落酸誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉。