曹 嫄，李 宇，張克英，盧 通，韓東暉，李程彬，何偉翔，趙曉龍，徐志成，秦衛(wèi)軍，楊力軍(空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院：門(mén)診部，泌尿外科，陜西 西安 7003)

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma，RCC)占所有惡性腫瘤的3%～5%，發(fā)病率居第16位，死亡率居第17位[1]。早期RCC患者主要以根治性手術(shù)治療為主且預(yù)后較好，而進(jìn)展期RCC預(yù)后較差且缺乏有效的治療方法[2]。研究表明，RCC的進(jìn)展與腫瘤免疫微環(huán)境密切相關(guān)，且總體免疫細(xì)胞浸潤(rùn)更豐富的患者預(yù)后更好[3]。然而，免疫細(xì)胞類(lèi)型多樣，不同免疫細(xì)胞在腫瘤惡性進(jìn)展中的作用存在差異[4]。闡明具體的免疫細(xì)胞類(lèi)型與腫瘤預(yù)后的相關(guān)性，并進(jìn)一步指導(dǎo)臨床決策意義重大。為此，本研究利用生物信息學(xué)方法，對(duì)檢索自癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)的RCC數(shù)據(jù)進(jìn)行免疫細(xì)胞浸潤(rùn)量化和預(yù)后分析，以揭示免疫微環(huán)境與RCC惡性進(jìn)展的相關(guān)性，為RCC預(yù)后預(yù)測(cè)和臨床決策提供可靠的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

895例RCC患者基因表達(dá)數(shù)據(jù)和相應(yīng)患者的臨床信息，檢索自TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，包括腎透明細(xì)胞癌、腎乳頭狀癌和腎嫌色細(xì)胞癌。臨床信息包括：生存時(shí)間、生存狀態(tài)、年齡、性別、病理分期、TNM分期等。通過(guò)Perl軟件將單個(gè)條目的TCGA數(shù)據(jù)整合成數(shù)據(jù)矩陣。利用R軟件的limma程序包將重復(fù)測(cè)量的基因數(shù)據(jù)取均值并替換，得到基因表達(dá)矩陣。

1.2 方法

1.2.1 基于CIBERSORT算法的免疫細(xì)胞量化 利用R軟件的CIBERSORT程序包和LM22特征基因表達(dá)矩陣，對(duì)上述RCC基因表達(dá)矩陣進(jìn)行分析，量化得到每個(gè)患者腫瘤組織中22種免疫細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)分?jǐn)?shù)。根據(jù)每種免疫細(xì)胞腫瘤浸潤(rùn)分?jǐn)?shù)的范圍，以中位數(shù)值作為截?cái)嘀?，將患者分為該免疫?xì)胞的高浸潤(rùn)組和低浸潤(rùn)組。將CIBERSORT算法循環(huán)運(yùn)行100次以提高量化分析的準(zhǔn)確性。以P<0.05為閾值，篩選量化合格的患者，繪制免疫細(xì)胞占比柱狀圖，并進(jìn)行后續(xù)分析。根據(jù)上述分析策略，我們分別構(gòu)建了3種分組策略：靜息樹(shù)突狀細(xì)胞高浸潤(rùn)組(285人)和低浸潤(rùn)組(286人)；靜息肥大細(xì)胞高浸潤(rùn)組(286人)和低浸潤(rùn)組(286人)；活化型CD4+記憶性T細(xì)胞高浸潤(rùn)組(285人)和低浸潤(rùn)組(284人)。

1.2.2 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)與RCC預(yù)后的相關(guān)性分析 利用R軟件基于患者ID號(hào)，將上述免疫細(xì)胞量化結(jié)果與臨床信息逐一匹配。利用R軟件的survival程序包分析不同類(lèi)型的免疫細(xì)胞腫瘤浸潤(rùn)程度與RCC患者生存時(shí)長(zhǎng)的相關(guān)性，并通過(guò)Kaplan-Meier生存曲線進(jìn)行可視化分析。

1.2.3 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)與RCC臨床特征的相關(guān)性分析 利用R軟件beeswarm程序包的Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，分析不同類(lèi)型的免疫細(xì)胞腫瘤浸潤(rùn)程度與RCC臨床特征，如病理分期、TNM分期等腫瘤惡性程度指標(biāo)的相關(guān)性。利用R軟件的barplot函數(shù)繪制小提琴圖。

2 結(jié)果

2.1 樹(shù)突狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞、活化型CD4+記憶性T細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)程度與患者生存相關(guān)

比較RCC組織中各類(lèi)免疫細(xì)胞腫瘤浸潤(rùn)程度較癌旁組織的差異發(fā)現(xiàn)，樹(shù)突狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞、活化型CD4+記憶性T細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)程度顯著增高(圖1A)。進(jìn)一步的生存分析結(jié)果提示，樹(shù)突狀細(xì)胞和肥大細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)程度與患者預(yù)后呈正相關(guān)(圖1B～C)，而活化型CD4+記憶性T細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)程度則與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)(圖1D)。

A：腎透明細(xì)胞癌及正常樣本中各種免疫細(xì)胞占比的柱狀圖；B～D：分別為靜息樹(shù)突狀細(xì)胞、靜息肥大細(xì)胞、活化型CD4+記憶性T細(xì)胞構(gòu)成水平的Kaplan-Meier生存曲線，3組生存曲線的P值均<0.05。圖1 靜息樹(shù)突狀細(xì)胞、靜息肥大細(xì)胞、活化型CD4+記憶性T細(xì)胞的浸潤(rùn)程度與患者生存率相關(guān)

2.2 靜息樹(shù)突狀細(xì)胞的浸潤(rùn)程度與腫瘤分期和分級(jí)均呈負(fù)相關(guān)

對(duì)靜息樹(shù)突狀細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)程度與RCC患者的臨床病理參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果提示：臨床分期越高，靜息樹(shù)突狀細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)程度越低，即高浸潤(rùn)靜息樹(shù)突狀細(xì)胞的RCC患者腫瘤主要為T(mén)1～T2期，而低浸潤(rùn)主要為T(mén)3～T4期(圖2A)。與之相一致的，病理分級(jí)越高，靜息樹(shù)突狀細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)程度越低，即高浸潤(rùn)的病理分級(jí)主要為Ⅰ和Ⅱ級(jí)，低浸潤(rùn)主要為Ⅲ和Ⅳ級(jí)(圖2B)。

A：T1～T4期RCC患者的靜息樹(shù)突狀細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)量；B：Ⅰ～Ⅳ級(jí)RCC患者的靜息樹(shù)突狀細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)量。 aP<0.05。圖2 靜息樹(shù)突狀細(xì)胞的浸潤(rùn)程度與腫瘤分期和分級(jí)均呈負(fù)相關(guān)

2.3 靜息肥大細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)程度與腫瘤分期和分級(jí)均呈負(fù)相關(guān)

對(duì)靜息肥大細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)程度與RCC患者的臨床病理參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果提示：腫瘤分期和分級(jí)評(píng)分越高，靜息肥大細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)程度越低，即從G1到G4期靜息肥大細(xì)胞腫瘤浸潤(rùn)量逐漸下降(P<0.05，圖3A)。與之相一致的，病理分級(jí)越高，靜息肥大細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)程度越低，即從Ⅰ級(jí)到Ⅳ級(jí)靜息肥大細(xì)胞腫瘤浸潤(rùn)量逐漸下降(P<0.05，圖3B)。靜息肥大細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)量與T分期、M分期具有相同的負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05，圖3C～D)。

A：G1～G4期RCC患者的靜息肥大細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)量；B：Ⅰ～Ⅳ級(jí)RCC患者的靜息肥大細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)量；C：T1～T4期RCC患者的靜息肥大細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)量；D：M0～M1期RCC患者的靜息肥大細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)量。aP<0.05。圖3 靜息肥大細(xì)胞的浸潤(rùn)程度與腫瘤分期和分級(jí)均呈負(fù)相關(guān)

2.4 活化型CD4+記憶性T細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)程度與腫瘤分期和分級(jí)均呈正相關(guān)

對(duì)活化型CD4+記憶性T細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)程度與RCC患者的臨床病理參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果提示：腫瘤分期和分級(jí)評(píng)分越高，CD4+活化記憶T細(xì)胞腫瘤浸潤(rùn)程度越高，即從G1到G4期活化型CD4+記憶性T細(xì)胞腫瘤浸潤(rùn)量逐漸升高(圖4A)。與之相一致的，病理分級(jí)越高，活化型CD4+記憶性T細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)程度越高，即從Ⅰ級(jí)到Ⅳ級(jí)活化型CD4+記憶性T細(xì)胞腫瘤浸潤(rùn)量逐漸升高(圖4B)?；罨虲D4+記憶性T細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)量與TNM分期具有相同的正相關(guān)關(guān)系(圖4C～E)。

A：G1～G4期RCC患者的活化型CD4+記憶性T細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)量；B：Ⅰ～Ⅳ期RCC患者的活化型CD4+記憶性T細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)量；C：T1～T4期RCC患者的活化型CD4+記憶性T細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)量；D：N0～N1期RCC患者的活化型CD4+記憶性T細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)量；E：M0～M1期RCC患者的活化型CD4+記憶性T細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)量。 aP<0.05。圖4 活化型CD4+記憶性T細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)程度與腫瘤分期和分級(jí)均呈正相關(guān)

3 討論

RCC是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率均較高且進(jìn)展期預(yù)后較差[5]。為了在疾病早期篩選出腫瘤進(jìn)展高風(fēng)險(xiǎn)的患者，需要找出具有臨床意義的預(yù)后指標(biāo)，從而對(duì)于此類(lèi)患者進(jìn)行更好的監(jiān)測(cè)和管理。目前臨床常用的仍是基于患者的影像學(xué)資料進(jìn)行臨床分期，根據(jù)術(shù)后病理檢查進(jìn)行病理分級(jí)[6]。然而RCC患者的個(gè)體差異大，即使是同一腫瘤的內(nèi)部也表現(xiàn)出顯著的區(qū)域性差異，因此我們需要更多更精細(xì)化的預(yù)后指標(biāo)來(lái)指導(dǎo)臨床工作[7]。

近年來(lái)，腫瘤免疫微環(huán)境的研究被廣泛展開(kāi)，RCC的腫瘤免疫微環(huán)境與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)[8]。本研究對(duì)腎細(xì)胞癌中免疫細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)特點(diǎn)進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，樹(shù)突狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞、活化的CD4+記憶性T細(xì)胞腫瘤浸潤(rùn)量與RCC患者的預(yù)后和臨床分級(jí)分期具有相關(guān)性，且這三種免疫細(xì)胞在腎細(xì)胞癌的進(jìn)展中發(fā)揮著完全不同的作用。腫瘤免疫微環(huán)境中的細(xì)胞串?dāng)_一直備受研究者的關(guān)注[9]，本研究不僅為RCC的早期篩查和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供參考，同時(shí)將為腎細(xì)胞腫瘤免疫微環(huán)境的研究提供新的思路。

樹(shù)突狀細(xì)胞主要發(fā)揮抗原呈遞的作用。在腫瘤微環(huán)境中，存在各種作用于樹(shù)突狀細(xì)胞的抑制性細(xì)胞因子，導(dǎo)致樹(shù)突狀細(xì)胞功能異常，進(jìn)而使腫瘤細(xì)胞逃脫免疫系統(tǒng)的監(jiān)視[10]。因此樹(shù)突狀細(xì)胞的免疫浸潤(rùn)增多有助于人體獲得性免疫系統(tǒng)的激活，產(chǎn)生更強(qiáng)的抗腫瘤作用，這解釋了本研究關(guān)于高浸潤(rùn)樹(shù)突狀細(xì)胞與預(yù)后呈正相關(guān)的發(fā)現(xiàn)。

肥大細(xì)胞是固有免疫細(xì)胞的重要組成部分[11]。研究表明瘤內(nèi)肥大細(xì)胞在非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)的癌巢基質(zhì)細(xì)胞中占有優(yōu)勢(shì)，并與NSCLC患者生存率相關(guān)[12]。人體內(nèi)肥大細(xì)胞具有兩種表型，其中一種含有類(lèi)胰蛋白酶，而另一種包含類(lèi)胰蛋白酶及糜酶。類(lèi)胰蛋白酶主要位于黏膜上皮及固有層中，而類(lèi)胰蛋白酶及糜酶主要位于皮膚及結(jié)締組織中。瘤內(nèi)的此兩種表型對(duì)于NSCLC的生存率均有改善，提示肥大細(xì)胞能參與到抗腫瘤免疫過(guò)程中。肥大細(xì)胞可通過(guò)分泌腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖，而通過(guò)TNF促進(jìn)生長(zhǎng)的T淋巴細(xì)胞又可正反饋促進(jìn)肥大細(xì)胞增殖，兩者共同發(fā)揮抗腫瘤作用。另外，肥大細(xì)胞可通過(guò)脫顆粒釋放蛋白酶破壞腫瘤基質(zhì)，腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到破壞，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)浸潤(rùn)[13]。

受到抗原刺激后，CD4+T細(xì)胞主要識(shí)別外源性抗原肽并分化為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞[14]。本研究發(fā)現(xiàn)活化的CD4+記憶性T細(xì)胞所占比例隨著臨床分期的增加呈上升趨勢(shì)，表明隨著疾病進(jìn)展，患者的免疫功能在不斷惡化，機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用也在逐漸減弱。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在高分化、中分化和低分化患者中的表達(dá)水平有顯著差異，提示機(jī)體對(duì)低分化的腫瘤細(xì)胞殺傷作用弱，對(duì)高分化的腫瘤細(xì)胞殺傷作用強(qiáng)[15]。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析方法，分析22種腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞亞群與臨床的分級(jí)分期和預(yù)后具有重要關(guān)聯(lián)，這些關(guān)聯(lián)能夠幫助篩選出腫瘤進(jìn)展高風(fēng)險(xiǎn)的RCC患者，并給予早期干預(yù)和臨床指導(dǎo)。3種與預(yù)后密切相關(guān)的免疫細(xì)胞，不僅提供診斷和預(yù)測(cè)價(jià)值，同時(shí)可能是良好的治療靶點(diǎn)。本研究進(jìn)一步揭示構(gòu)成腫瘤微環(huán)境的臨床和生物學(xué)意義，但是對(duì)于RCC的具體作用機(jī)制及臨床預(yù)后價(jià)值的探討仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。