焦俊萍，鮑軍強，史慧敏，高超，田書娟

目的 探討漆酶基因LACC1對腦梗死后缺血再灌注損傷的影響及其機制。

方法 ①采購C57BL/6J LACC1基因敲除（LACC1-/-）小鼠20只，野生型小鼠20只，建立大腦中動脈閉塞/再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R）模型各15只，比較兩組小鼠的腦梗死體積。采用蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測腦組織中磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（phosphorylate AMP-activated protein kinase，p-AMPK）及NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）水平，采用微陣列分析外周血中長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）表達譜及探討可能涉及的信號轉導通路。②制備小鼠小膠質(zhì)細胞氧糖剝奪/再灌注（oxygen glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）模型，并通過小干擾RNA（siRNA）轉染技術上調(diào)及抑制LACC1的表達，明確LACC1對腦梗死體外模型炎癥和氧化應激的調(diào)節(jié)作用。采用蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測p-AMPK、NLRP3水平，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測血清過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）、IL-1β、IL-6、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、TNF-α水平。

結果 MCAO/R模型野生型小鼠組腦梗死體積比例為（21.38%±4.06%），LACC1-/-小鼠組腦梗死體積比例為（19.07%±2.86%），差異有統(tǒng)計學意義（P=0.041），同時LACC1-/-小鼠腦組織中p-AMPK的蛋白表達水平增加，NLRP3蛋白表達水平受到抑制。OGD/R細胞模型中，LACC1的下調(diào)抑制了NLRP3蛋白的表達、增加了p-AMPK蛋白的表達。OGD/R細胞模型中，LACC1的過度表達增加了IL-1β、IL-6、INF-γ、TNF-α、MDA和ROS生成，降低了CAT和SOD的水平（P＜0.05）。

結論 LACC1可能通過AMPK/NLRP3途徑加重小鼠缺血再灌注后的炎癥反應，這可能為腦梗死或其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病及其相關并發(fā)癥提供一種新的治療方案。

腦梗死的發(fā)病率及致殘率均較高，神經(jīng)免疫炎癥、氧自由基及細胞內(nèi)鈣超載、自噬等均參與了缺血再灌注損傷的發(fā)生、發(fā)展[1]。闡明腦梗死的發(fā)病機制，尋找有效的治療干預措施，是臨床亟須解決的問題。漆酶基因LACC1與脂質(zhì)代謝、NOD2復合物、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和嘌呤核苷酸循環(huán)有關[2]，有研究顯示LACC1可以調(diào)節(jié)TNF、IL-17等細胞因子的水平[3]，LACC1的切割和降解導致巨噬細胞自噬阻滯。有研究證實LACC1對促進腺苷酸活化蛋白激酶（phosphorylate AMPactivated protein kinase，AMPK）下游巨噬細胞的自噬通量很重要[4]。對于缺血性卒中患者，AMPK的上調(diào)不但能減輕氧化應激、抑制神經(jīng)炎癥，而且能調(diào)節(jié)神經(jīng)元的自噬和凋亡、改善線粒體的功能、抑制谷氨酸興奮毒性，并且促進新生血管形成。在腦梗死的發(fā)生、發(fā)展過程中，腸道菌群及IL-17發(fā)揮了重要作用[5]，LACC1是保持腸道穩(wěn)態(tài)的重要基因[6]。因此，本研究設計推斷LACC1對腦梗死急性期的缺血再灌注損傷有一定的影響，其機制可能與參與炎癥與免疫調(diào)節(jié)有關。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 大腦中動脈閉塞/再灌注模型建立及分組 選擇8周齡雄性C57BL/6J小鼠（購于河北醫(yī)科大學實驗動物中心）和8周齡C57BL/6JLACC1基因敲除（LACC1-/-）小鼠[購于賽業(yè)（廣州）生物科技有限公司]建立大腦中動脈閉塞/再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R）模型，小鼠質(zhì)量為18～22 g。向小鼠腹腔內(nèi)注射水合氯醛溶液進行麻醉，將右側頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈進行分離，結扎頸總動脈近心端及頸外動脈，夾閉頸內(nèi)動脈的遠心端。在頸總動脈距離分叉約0.2 cm處剪一“V”形小口，將栓塞線從切口處插入頸總動脈，將線栓推進至頸內(nèi)動脈，縫合皮膚傷口。閉塞60 min后，緩慢回撤線栓以實現(xiàn)血流的再灌注。MCAO/R術后24 h，采用Longa評分系統(tǒng)對小鼠進行神經(jīng)行為檢查。0分：無神經(jīng)功能障礙；1分：完全無法伸展左前爪；2分：向左側轉圈；3分：向左側傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識喪失。Longa評分為1～3分的小鼠是成功的MCAO/R模型。20只野生型小鼠MCAO/R造模成功15只，作為對照組；20只LACC1-/-小鼠MCAO/R造模成功15只，作為實驗組。本研究經(jīng)過河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院倫理委員會批準（倫理批號：20220221）。

1.1.2 細胞模型建立及分組 將小鼠BV-2小膠質(zhì)細胞（購于武漢普諾賽生命科技有限公司）在杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）（購于美國猶他州洛根Hyclone公司）中進行培養(yǎng)。DMEM含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素，培養(yǎng)溫度為37 ℃，CO2濃度為5%。根據(jù)不同轉染序列將細胞模型分為4組：陰性組、LACC1上調(diào)組、LACC1下調(diào)組及Si陰性組。

1.1.3 試劑 RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司，單克隆抗體NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（phosphorylate AMP-activated protein kinase，p-AMPK）、腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）和羊抗小鼠IgG購自美國Cell Signaling Technology公司，放射免疫沉淀（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液購自北京索萊寶科技有限公司，谷胱甘肽（glutathione，GSH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、IL-1β、IL-6、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自美國Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 動物實驗 （1）微陣列分析：造模4周后，采集兩組小鼠外周血，采用高通量長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）芯片進行檢測，經(jīng)分數(shù)值標準化，去除低質(zhì)量探針（保留20個樣品中至少10個樣品標記為表達或未表達的探針），得到腦梗死lncRNA表達譜。將鑒別出的mRNAs[P＜0.05，錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.05]進行通路富集分析，推斷腦梗死發(fā)生過程中可能涉及的信號轉導通路。

（2）TTC染色：造模4周后，取小鼠腦組織，由視交叉平面開始向后連續(xù)切取2 mm冠狀切片5張。配制1%的2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色液，37 ℃避光浸染15 min后拍照，通過顏色不同評定小鼠的腦梗死體積，紅色、白色分別為正常組織、梗死區(qū)。使用Image J軟件進行梗死區(qū)體積統(tǒng)計分析，腦梗死體積比例=總梗死體積/各腦切片體積之和×100%。

（3）蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測小鼠腦組織中的蛋白表達：造模4周后，取小鼠腦組織剪碎經(jīng)RIPA裂解緩沖液處理，離心后取上清液通過二喹啉甲酸法（bicinchoninic acid，BCA）分析蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)通過10%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離并轉移到聚偏氟乙烯膜上，在室溫下采用5%脫脂乳封閉膜封閉1 h，并在4 ℃下采用LACC1、AMPK、p-AMPK、NLRP3和β-肌動蛋白一級抗體孵育過夜，將膜與二級抗體——辣根過氧化物酶結合的山羊抗小鼠二級抗體在室溫下孵育2 h。采用電化學發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）法測定蛋白質(zhì)條帶，并采用Image J軟件進行評估。

1.2.2 細胞模型 （1）細胞復蘇、培養(yǎng)與傳代：從液氮中取出BV-2小膠質(zhì)細胞，37 ℃水浴快速復蘇后采用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，在完全培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清，1%雙抗（抗青霉素/鏈霉素）培養(yǎng)BV-2小膠質(zhì)細胞。將BV-2置于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，待細胞生長至密度為90%左右時進行傳代培養(yǎng)。

（2）siRNA轉染序列：①細胞鋪板，每孔30萬，6孔板，過夜，使轉染前密度達到3～5×。②按照說明書，配制轉染儲存液。③轉染終濃度選用50 nM，嚴格按照Lipofectamine試劑盒說明書，將化學合成的LACC1模擬物、模擬陰性對照物（NC）、si-LACC1和si-NS（廣州市銳博生物科技有限公司）利用LipofectamineTM2000工具包瞬時轉染到細胞中[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]。對LACC1基因和內(nèi)參基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）設計特異性引物，將LACC1進行擴增（引物由深圳華大基因科技有限公司合成）：LACC1-F：5′-CCATTCGCTCACCGTCATC-3′，LACC1-R：5′-CCTTTGCCTTCGTTGTTGTTC-3′，GAPDH-F：5′-CGCTCAACAAGAACTTCGTCAA-3′，GAPDH-R：5′-GTAGACAAGGAGGTCACAGA-3′。Si-LACC1基因序列[3]（Dharmacon On-Target Plus SMARTpool? siRNA試劑，北京北方同正生物技術發(fā)展有限公司）：CGAAAGAUGUAGAGGUUUU（J-015653-17），CUAGAUAAGAGGCGAUCAA（J-015653-18），AGACAUUGUUGUUGUACUU（J-015653-19），GGAGAAAUUUUACCGAAUA（J-015653-20）。④按說明書配制轉染復合物，加入無雙抗培養(yǎng)基中，混勻。⑤將孔板放入37 ℃孵箱培養(yǎng)。⑥24 h后用磷酸鹽緩沖液沖洗孔板，更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，其間可進行加藥操作。⑦換液24 h后，進行糖氧剝奪（oxygen and glucose deprivation，OGD）處理及后續(xù)操作。

（3）建立OGD/R模型：取對數(shù)生長期的BV-2細胞，棄去培養(yǎng)基，用1 mL高糖DMEM沖洗2次，加入胰酶消化細胞，在顯微鏡下確認細胞已被消化，再加入3 mL DMEM多次吹打，收取細胞懸液。離心后，用1 mL胎牛血清重懸沉淀細胞。將細胞接種于培養(yǎng)板中，加入無糖DMEM（96孔板每孔100 μL，12孔板每孔1 mL）。將細胞培養(yǎng)板和氧濃度檢測儀同時放入缺氧小室中，連接缺氧裝置與備用氣瓶，用含95% N2和5% CO2的混合氣體通氣，流量為20 L/min，氧濃度監(jiān)測儀顯示缺氧小室內(nèi)氧濃度≤0.2%時，快速關緊進、出氣閥，將缺氧裝置放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。除去培養(yǎng)板中培養(yǎng)液，以高糖DMEM沖洗2次，再加入完全培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，模擬再灌注損傷。

（4）蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測蛋白表達：通過ECL法測定4組模型中LACC1、p-AMPK、NLRP3的蛋白表達，采用凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描膠片后進行吸光度分析，通過計算目的條帶與其對應的內(nèi)參條帶的比值來表示目的蛋白的表達水平。

（5）ELISA檢測炎性因子水平：對細胞上清液中的GSH、SOD、MDA、IL-1β、IL-6、INF-γ和TNF-α水平采用ELISA法進行定量檢測。使用微孔板讀取器（Bio-Rad）測定450 nm處的吸光密度。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prime 8.0進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布、方差齊的計量資料以表示，兩組間比較采用Turkey法，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 動物實驗

2.1.1 微陣列分析結果 對LACC1-/-小鼠進行微陣列分析，顯示其LACC1基因表達水平上調(diào)，對靶基因進行通路富集分析得到AMPK/NLRP3信號通路（圖1）。

圖1 微陣列分析結果Figure 1 Microarray analysis results

2.1.2LACC1基因敲除后的腦梗死體積TTC染色結果顯示，野生型小鼠組腦梗死體積比例為（21.38%±4.06%），LACC1-/-小鼠組腦梗死體積比例為（19.07%±2.86%），野生型小鼠組腦梗死體積比例高于LACC1-/-小鼠組，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.041），結果提示基因敲除對小鼠的腦梗死體積有顯著影響（圖2）。

圖2 LACC1基因敲除后小鼠腦梗死體積的變化Figure 2 Changes in cerebral infarction volume of mice after LACC1 gene knockout

2.1.3 兩組小鼠炎性指標分析 與野生型小鼠相比，LACC1-/-小鼠腦組織中GSH和SOD表達水平增加，MDA、IL-1β、IL-6、INF-γ、TNF-α、I型膠原、E-鈣黏蛋白和α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）mRNA表達水平受到抑制，差異有統(tǒng)計學意義（表1）。

表1 兩組小鼠炎性指標比較Table 1 Comparison of inflammatory indicators between two groups of mice

2.1.4 p-AMPK、NLRP3在LACC1-/-小鼠中的表達LACC1-/-小鼠腦組織中p-AMPK蛋白為（3.014±0.817），高于野生型小鼠的（1.277±0.254），差異有統(tǒng)計學意義（F=10.346，P＜0.001）；LACC1-/-小鼠腦組織中NLRP3蛋白為（0.295±0.058），低于野生型小鼠的（1.782±0.442），差異有統(tǒng)計學意義（F=0.017，P＜0.001）。蛋白質(zhì)免疫印跡實驗結果見圖3。

圖3 兩組小鼠p-AMPK蛋白、NLRP3蛋白的表達Figure 3 Protein expression of p-AMPK and NLRP3 between two groups of mice

2.2 細胞模型

2.2.1 細胞模型ELISA檢測結果LACC1上調(diào)組MDA、ROS、IL-1β、IL-6、TNF-α和INF-γ水平高于陰性組，CAT和SOD水平低于陰性組，差異有統(tǒng)計學意義（表2）。LACC1下調(diào)組MDA、SOD、IL-1β、IL-6、TNF-α和INF-γ水平低于Si陰性組，CAT和SOD水平高于Si陰性組，差異有統(tǒng)計學意義（表3）。

表2 LACC1上調(diào)組與陰性組炎性指標比較Table 2 Comparison of inflammatory indicators between the LACC1 up-regulated group and the negative group

表3 LACC1下調(diào)組與Si陰性組炎性指標比較Table 3 Comparison of inflammatory indicators between the LACC1 down-regulated group and the Si-negative group

2.2.2 蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測結果 蛋白質(zhì)免疫印跡實驗結果顯示，LACC1下調(diào)組p-AMPK蛋白量為（2.204±0.632），高于Si陰性組的（0.913±0.226），差異有統(tǒng)計學意義（F=7.820，P＜0.001）；NLRP3蛋白量為（0.445±0.078），低于Si陰性組的（0.917±0.245），差異有統(tǒng)計學意義（F=0.033，P＜0.001），蛋白質(zhì)免疫印跡實驗結果見圖4A。LACC1上調(diào)組p-AMPK蛋白量為（0.352±0.113），低于陰性組的（1.092±0.284），差異有統(tǒng)計學意義（F=0.158，P＜0.001）；NLRP3蛋白量為（0.883±0.226），高于陰性組的（0.237±0.062），差異有統(tǒng)計學意義（F=0.075，P＜0.001），蛋白質(zhì)免疫印跡實驗結果見圖4B。免疫熒光顯示LACC1上調(diào)后p-AMPK蛋白的表達較陰性組降低（圖4C）。

圖4 LACC1調(diào)節(jié)AMPK/NLRP3通路Figure 4 LACC1 regulates the AMPK/NLRP3 pathway

3 討論

卒中患者會遺留功能殘障、社會功能和心理健康受損，嚴重影響患者的生活質(zhì)量和生存時間[7]。相關的炎癥和免疫反應是腦梗死病理生理學中的關鍵因素[8]。急性腦梗死患者中氧自由基含量升高，增加了抗氧化酶的降解，因此，機體中的SOD會減少，同時MDA水平會升高，增加了氧自由基對機體的損傷。在缺血開始數(shù)小時內(nèi)，小膠質(zhì)細胞會對改變的內(nèi)環(huán)境做出反應，表現(xiàn)為形態(tài)學改變和與神經(jīng)元接觸的增加，受累神經(jīng)元會出現(xiàn)興奮毒性鈣超載跡象[9]。伴隨著小膠質(zhì)細胞上模式識別受體的激活，炎癥小體所介導的IL-1β釋放和TNF水平增加，誘導星形膠質(zhì)細胞與血管內(nèi)皮細胞中的趨化因子和細胞因子產(chǎn)生，進而反饋到炎性級聯(lián)反應。免疫系統(tǒng)在損傷部位發(fā)揮免疫抑制參與腦損傷，還會削弱機體抵抗力，導致致命的細菌感染，使卒中患者的預后受到影響，甚至會危及生命[10]。

AMPK在調(diào)節(jié)全身細胞能量代謝的內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起著至關重要的作用[11]。在正常生理條件下，AMPK可促進大腦發(fā)育并調(diào)節(jié)神經(jīng)元極化。在腦梗死患者中，AMPK的上調(diào)可減輕氧化應激、抑制神經(jīng)炎癥、調(diào)節(jié)神經(jīng)元自噬和凋亡、改善線粒體功能、抑制谷氨酸興奮毒性和促進新生血管形成，AMPK還可促進缺血性卒中的功能恢復[12]。氧化呼吸鏈在腦缺血期間受損，可產(chǎn)生ROS[13]。ROS使硫氧還蛋白相互作用蛋白與NLRP3受體結合，從而激活NLRP3，NLRP3炎癥小體可使caspase-1發(fā)生自剪切并產(chǎn)生酶活性，引起細胞凋亡[14-15]。本研究在腦梗死患者及腦梗死模型小鼠的血清中發(fā)現(xiàn)AMPK的表達水平降低，NLRP3的表達水平升高，從另一方面證實了AMPK在抗炎、保護神經(jīng)細胞方面的作用。

LACC1具有下調(diào)感染和免疫炎癥反應的功能[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，LACC1可影響TNF及IL-17的水平[3]。LACC1缺乏降低了原代巨噬細胞的自噬通量，而脂蛋白相關磷脂酶A2、巨噬細胞集落刺激因子在急性腦梗死過程中起著重要的作用，二者由血管壁成熟的巨噬細胞和T細胞等分泌而來[4]。在腦梗死的發(fā)生、發(fā)展中，腸道菌群及IL-17發(fā)揮了重要作用[5]。LACC1是保持腸道穩(wěn)態(tài)的重要基因[6]。腸道微生物群與卒中后認知功能障礙的多種危險因素相關，推測二者存在某種聯(lián)系[17]。本研究證實LACC1基因敲除后，小鼠的梗死體積明顯減小，AMPK表達水平升高，NLRP3表達水平降低，顯示LACC1可能加重腦梗死后的神經(jīng)損傷。接下來，研究進一步通過上調(diào)及下調(diào)LACC1的水平尋找該基因的作用通路，證實AMPK/NLRP3受LACC1的調(diào)節(jié)，因此推斷LACC1可能通過AMPK/NLRP3通路發(fā)揮作用，并促進炎癥因子IL-1β、IL-6、INF-γ、TNF-α等的表達，加重腦梗死后炎癥反應，導致缺血再灌注損傷。

4 結論

本研究結果顯示LACC1基因促進炎性因子的表達，抑制AMPK及增加NLPR3表達，從而增加炎癥反應和ROS誘導的氧化應激。因此推測LACC1基因可能通過AMPK/NLPR3途徑加重缺血再灌注損傷后的炎癥反應。這項工作有助于深入理解腦梗死及缺血再灌注的發(fā)病機制，通過進一步研究，該通路中的重要蛋白亦可能成為腦梗死急性期新的疾病標志物或治療靶點。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。

【點睛】LACC1基因通過調(diào)控AMPK/NLRP3通路，加重炎癥及氧化應激反應，導致腦梗死后的缺血再灌注損傷，這可能為腦梗死及其并發(fā)癥的治療提供一種新思路。