林澤宏 周紅海 魏紀(jì)湖 羅 灝 柒萬強(qiáng) 唐 俊

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)1 研究生院,2 骨傷學(xué)院,廣西南寧市 530001)

肩袖損傷是常見的肩關(guān)節(jié)疾病,以肩部疼痛、活動(dòng)障礙為主要癥狀,其在全部肩關(guān)節(jié)疾病中的占比為5%～40%,且在臨床上30%～70%的肩關(guān)節(jié)疼痛與肩袖損傷有關(guān)[1]。肩袖損傷的患病風(fēng)險(xiǎn)與年齡呈正相關(guān),60～69 歲人群的患病率可達(dá) 31%,而 80 歲以上人群的患病率預(yù)計(jì)可達(dá) 65%[2]。近年來,隨著我國社會(huì)人口老齡化加劇,我國的肩袖損傷患病率也在逐年增加,這加大了社會(huì)和個(gè)人的經(jīng)濟(jì)壓力。目前除手術(shù)治療外,中醫(yī)藥療法在肩袖損傷的保守治療中占有重要地位[3]。如何緩解肩袖損傷患者的疼痛,改善關(guān)節(jié)活動(dòng)度,減少肩袖軟組織變性,防止肌腱進(jìn)一步撕裂,是肩袖損傷保守治療的臨床和科研熱點(diǎn)。因此,探索一種安全、有效的中藥方劑對于肩袖損傷的保守治療具有重要意義。

中醫(yī)中并無“肩袖損傷”的直接記載,但根據(jù)綜合臨床表現(xiàn)和病因病機(jī),應(yīng)將其歸屬于中醫(yī)“痹癥”中的“肩痹”范疇。解痙散瘀湯是我國國醫(yī)大師韋貴康教授運(yùn)用“活血通經(jīng),解痙散瘀”之法治療頸肩痹痛的良方,臨床研究表明,該方對肩痹有明確的療效[4],但目前其治療肩袖損傷的作用機(jī)制還不明確。而中藥復(fù)方的作用機(jī)制具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn),故本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù),探討解痙散瘀湯治療肩袖損傷的潛在機(jī)制,以期為肩袖損傷保守治療的臨床用藥及研究提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 活性成分及其作用靶點(diǎn)的篩選 (1)通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP;https://old.tcmsp-e.com/index.php)獲取白芍、赤芍、當(dāng)歸、丹參、甘草、兩面針、牛膝、桃仁、豨薟草的所有活性成分,然后設(shè)置口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%且類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18初步篩選主要活性成分,再通過TCMSP進(jìn)一步檢索主要活性成分的作用靶點(diǎn)。(2)通過中國知網(wǎng)(https://www.cnki.net/)檢索有關(guān)地龍活性成分研究的文獻(xiàn)[5-7],收集地龍的活性成分,通過ChemDraw軟件繪制活性成分的分子結(jié)構(gòu)并保存為.sdf格式。將.sdf格式文件上傳SwissADME平臺(tái)(http://www.swissadme.ch/)篩選主要活性成分,篩選條件為“Pharmacokinetics”項(xiàng)的“GI absorption”結(jié)果為“High”,且“Druglikeness項(xiàng)”的5種預(yù)測(Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge)結(jié)果中有2個(gè)及2個(gè)以上為“Yes”。將地龍主要活性成分的.sdf格式文件上傳至SwissTargetPrediction平臺(tái)(http://swisstargetprediction.ch/),設(shè)置物種為“Homo Sapiens”且probability>0,對主要活性成分的作用靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測。(3)使用R語言將獲得的所有靶點(diǎn)進(jìn)行合并去重,然后通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)將靶點(diǎn)名轉(zhuǎn)換為規(guī)范的基因名稱[8]。

1.2 解痙散瘀湯治療肩袖損傷潛在作用靶點(diǎn)的篩選 使用“Rotator Cuff Tears”作為檢索詞,在GeneCards?數(shù)據(jù)庫[9](www.genecards.org)和OMIM?數(shù)據(jù)庫(https://www.omim.org)中檢索肩袖損傷的相關(guān)靶點(diǎn),將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫的結(jié)果進(jìn)行合并去重。通過VENNY 2.1平臺(tái)(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)將解痙散瘀湯主要活性成分的作用靶點(diǎn)與肩袖損傷的相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行映射取交集,得到解痙散瘀湯治療肩袖損傷的潛在作用靶點(diǎn)。

1.3 構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 使用Cytoscape 3.9.1軟件,對主要活性成分及解痙散瘀湯治療肩袖損傷的潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行分析并構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。通過Cytoscape 3.9.1軟件的Network Analyzer插件分析成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋮?shù),根據(jù)節(jié)點(diǎn)連接度由大到小進(jìn)行排序,將連接度位居前5的主要活性成分作為解痙散瘀湯治療肩袖損傷的關(guān)鍵活性成分。

1.4 構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) 將解痙散瘀湯治療肩袖損傷的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.5 平臺(tái)(https://string-db.org),設(shè)定物種為“Homo sapiens”,可信度為0.4,剩余參數(shù)均為默認(rèn)值,最終獲得解痙散瘀湯治療肩袖損傷的蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò),將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件的cytoNCA插件,分析中介中心性、接近中心性、度中心性、特征向量中心性、局部平均連接中心性及網(wǎng)絡(luò)中心性共6個(gè)參數(shù)進(jìn)行2次篩選,最終以度中心性值大于中位值的靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)。

1.5 功能富集分析和通路富集分析 將解痙散瘀湯治療肩袖損傷的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp),設(shè)置物種為“Homo Sapiens”,進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology,GO)功能富集分析及京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,以P<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)[10]。將分析結(jié)果導(dǎo)入微生信平臺(tái)(http://www.bioinformatics.com.cn/)進(jìn)行可視化處理。

1.6 關(guān)鍵活性成分與核心靶點(diǎn)蛋白的分子對接 首先,通過PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取關(guān)鍵活性成分的2D結(jié)構(gòu),采用ChemOffice軟件對其進(jìn)行優(yōu)化并制作其3D結(jié)構(gòu)。然后,通過RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.pdbus.org/)獲取核心靶點(diǎn)蛋白的3D結(jié)構(gòu),并通過PyMol軟件對其進(jìn)行去水、去小分子配體等優(yōu)化。最后,通過AutoDock 1.5.6軟件實(shí)現(xiàn)關(guān)鍵活性成分與核心靶點(diǎn)蛋白的分子對接,以結(jié)合能大小判定分子對接是否成功,結(jié)合能≤0 kcal/mol表明配體與受體可以自發(fā)結(jié)合,一般來說分子間的結(jié)合能越低,則發(fā)生作用的概率越大,結(jié)合越穩(wěn)定。

2 結(jié) 果

2.1 解痙散瘀湯的主要活性成分及其作用靶點(diǎn) 通過TCMSP共獲得主要活性成分273個(gè)及其作用靶點(diǎn)270個(gè),其中白芍、赤芍、當(dāng)歸、丹參、甘草、兩面針、牛膝、桃仁、豨薟草的主要活性成分分別有13個(gè)、29個(gè)、2個(gè)、65個(gè)、92個(gè)、20個(gè)、20個(gè)、23個(gè)、9個(gè)。通過SwissADME平臺(tái)獲得地龍的主要活性成分47個(gè)及其作用靶點(diǎn)679個(gè)。合并去重后,共獲得解痙散瘀湯的主要活性成分291種、作用靶點(diǎn)835個(gè)。

2.2 解痙散瘀湯治療肩袖損傷的潛在作用靶點(diǎn) 經(jīng)合并去重后,從GeneCards?數(shù)據(jù)庫和OMIM?數(shù)據(jù)庫共獲得肩袖損傷相關(guān)靶點(diǎn)357個(gè)。通過VENNY 2.1平臺(tái)將肩袖損傷的相關(guān)靶點(diǎn)與解痙散瘀湯主要活性成分的作用靶點(diǎn)取交集,共獲得解痙散瘀湯治療肩袖損傷的潛在作用靶點(diǎn)95個(gè)。

2.3 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵活性成分篩選結(jié)果 將主要活性成分與解痙散瘀湯治療肩袖損傷的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件,構(gòu)建得到的成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)包含節(jié)點(diǎn)237個(gè)、連線729條,見圖1。在網(wǎng)絡(luò)中,連接度位居前5的主要活性成分依次為槲皮素、環(huán)(L-脯氨酸-L-苯丙氨酸)二肽、木犀草素、L-脯氨酰-L-亮氨酰-L-亮氨酰甘氨酸、山柰酚,即關(guān)鍵活性成分。關(guān)鍵活性成分的基本信息見表1。

表1 關(guān)鍵活性成分的基本信息

圖1 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)及核心靶點(diǎn)篩選結(jié)果 通過STRING 11.5平臺(tái)對解痙散瘀湯治療肩袖損傷的95個(gè)潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行分析,剔除獨(dú)立靶點(diǎn),得到PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù),然后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件進(jìn)行拓?fù)浞治龊涂梢暬?見圖2。拓?fù)浞治鼋Y(jié)果顯示,白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1B、絲氨酸/蘇氨酸激酶1(serine/threonine kinase 1,AKT1)、血管內(nèi)皮生長因子 A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)9、纖維連接蛋白(fibronectin,FN)1為網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)。

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO功能富集分析結(jié)果 對解痙散瘀湯治療肩袖損傷的95個(gè)潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析,共獲得736個(gè)條目,包括566個(gè)生物過程,60個(gè)細(xì)胞組分,110個(gè)分子功能。以-lgP值進(jìn)行由大到小排序選出前10個(gè)條目進(jìn)行可視化,見圖3。

圖3 GO富集分析結(jié)果的可視化圖

2.6 KEGG通路富集分析結(jié)果 對解痙散瘀湯治療肩袖損傷的95個(gè)潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析,共獲得142條通路,潛在作用靶點(diǎn)主要涉及晚期糖基化終末產(chǎn)物-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體信號通路、缺氧誘導(dǎo)因子1信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、IL-17信號通路等信號通路。以-lgP值進(jìn)行由大到小排序。將前15條通路制作成氣泡圖,見圖4。

圖4 KEGG通路富集分析的可視化圖

2.7 分子對接分析結(jié)果 所有關(guān)鍵活性成分和核心靶點(diǎn)蛋白對接的結(jié)合能均≤0 kcal/mol,表明解痙散瘀湯治療肩袖損傷的關(guān)鍵活性成分和核心靶點(diǎn)均具有較好的結(jié)合活性,見表2。選取部分分子對接結(jié)果進(jìn)行展示,見圖5。

圖5 部分分子對接結(jié)果的可視化圖

3 討 論

肩袖損傷在中醫(yī)學(xué)中屬于“痹癥”中的“肩痹”范疇,臨床上常以“肩痹”治法治之。解痙散瘀湯為國醫(yī)大師韋貴康教授為肩部病痛所創(chuàng)良方,有活血通經(jīng)、解痙散瘀的功效,可使經(jīng)脈通、氣血順,損傷之筋脈得以濡養(yǎng),脈通筋柔,痹痛得消,臨床療效頗佳[4]。方中以丹參為君藥,丹參可調(diào)和氣血,行而不破,散中有收;當(dāng)歸、桃仁、赤芍通行三焦,行血散瘀;白芍、甘草、牛膝、地龍緩急解痙止痛,再配以兩面針、豨薟草消腫止痛,共奏活血散瘀、解痙止痛之功。

本研究通過構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò),獲得5個(gè)關(guān)鍵活性成分,包括槲皮素、木犀草素、環(huán)(L-脯氨酸-L-苯丙氨酸)二肽、L-脯氨酰-L-亮氨酰-L-亮氨酰甘氨酸、山柰酚。肩袖組織發(fā)生急性損傷或是受到長期反復(fù)的機(jī)械性損傷時(shí),損傷組織局部存在不同程度的炎癥反應(yīng),而持續(xù)、過度的炎癥反應(yīng)會(huì)加重患者的疼痛感,以及影響肩袖組織的修復(fù)[11]。槲皮素通過提高超氧化物歧化酶和MMP抑制劑的水平,以及降低腫瘤壞死因子α、IL-1B、MMP的水平,來抑制炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng),延緩蛋白聚糖的降解,從而促進(jìn)肩袖損傷后軟組織的修復(fù)[12-13]。木犀草素通過核轉(zhuǎn)錄因子κB通路,減少IL-1B、腫瘤壞死因子α等炎癥因子的分泌,減輕損傷組織的局部炎癥反應(yīng)[14]。山柰酚能通過核轉(zhuǎn)錄因子κB信號通路和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路,降低誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶、腫瘤壞死因子α等促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)水平,發(fā)揮抗炎、鎮(zhèn)痛的作用[15-16]。環(huán)(L-苯丙氨酸-L-脯氨酸)二肽、L-脯氨酰-L-亮氨酰-L-亮氨酰甘氨酸是存在于地龍的生物類小分子多肽,具有良好的消炎、鎮(zhèn)痛效果[17]。上述關(guān)鍵活性成分的藥理作用表明解痙散瘀湯可提升人體抗氧化能力,減輕炎癥反應(yīng),從而緩解肩袖損傷患者的疼痛。

本研究PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果顯示,IL-1B、AKT1、VEGFA、MMP9、FN1為解痙散瘀湯治療肩袖損傷的核心靶點(diǎn)。肩袖組織損傷后,局部釋放大量細(xì)胞因子,激活多種生物信號通路,形成復(fù)雜的靶點(diǎn)-通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò),在肩袖損傷的炎癥期、愈合期和重塑期發(fā)揮重要作用[18]。在軟組織損傷早期,毛細(xì)血管破裂和細(xì)胞內(nèi)液滲透導(dǎo)致局部組織充血腫脹,腫瘤壞死因子、IL-1B等致炎因子被大量釋放,從而激活p38MAPK等炎癥相關(guān)信號通路,進(jìn)而誘發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)[19]。大量研究表明,IL-1B、AKT1是肩袖損傷炎癥期重要的促炎性細(xì)胞因子,通過核轉(zhuǎn)錄因子κB、MAPK等多條信號通路在損傷組織局部參與炎癥反應(yīng)的發(fā)生[20-22]。VEGFA可促進(jìn)血管形成,改變血管通透性,參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡,在肩袖損傷的病理過程中有重要作用[23]。損傷的肩袖組織會(huì)在分子層面進(jìn)行重塑,表現(xiàn)為腱細(xì)胞減少、細(xì)胞凋亡增加和膠原蛋白排列紊亂,增加后期肩袖再撕裂的概率,影響肩關(guān)節(jié)功能[24]。MMP家族通過重塑損傷細(xì)胞外基質(zhì)改變組織形態(tài),有研究表明,在肩袖損傷組織中MMP9表達(dá)顯著升高,其過度活躍會(huì)影響肩袖組織的修復(fù),而抑制其表達(dá)可促進(jìn)肩袖損傷后的腱骨愈合[25-26]。FN1廣泛存在于細(xì)胞外基質(zhì),是組織修復(fù)的重要材料,通過與細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用來促進(jìn)整合蛋白釋放,從而促進(jìn)組織修復(fù)[27]。

本研究KEGG通路富集分析結(jié)果顯示,解痙散瘀湯治療肩袖損傷的潛在作用靶點(diǎn)主要涉及的信號通路有晚期糖基化終末產(chǎn)物-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體信號通路、缺氧誘導(dǎo)因子1信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、IL-17信號通路。晚期糖基化終末產(chǎn)物-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體信號通路可通過調(diào)控氧化修飾性蛋白質(zhì)的生成,促進(jìn)炎癥發(fā)生與發(fā)展,同時(shí)炎癥因子激活免疫細(xì)胞,導(dǎo)致?lián)p傷組織局部炎癥反應(yīng)進(jìn)一步加劇[28]。缺氧誘導(dǎo)因子1信號通路、腫瘤壞死因子信號通路及IL-17信號通路的表達(dá),促進(jìn)炎癥因子、促血管形成因子及基質(zhì)金屬蛋白酶釋放,影響炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡與組織重塑[29-31]。GO功能富集分析結(jié)果顯示,潛在作用靶點(diǎn)基因主要涉及的生物學(xué)過程有脂多糖反應(yīng)、低氧反應(yīng)、過氧化氫反應(yīng)、膠原分解代謝過程、蛋白水解等,這些生物學(xué)過程均與炎癥反應(yīng)和組織重塑有關(guān)[32-33]。綜上,解痙散瘀湯主要通過影響與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡及血管生成相關(guān)的信號通路,來抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)控?fù)p傷組織局部細(xì)胞凋亡、抑制組織過度重塑,進(jìn)而減緩肩袖損傷的發(fā)展,改善患者預(yù)后。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出解痙散瘀湯的主要活性成分,初步探明其以多成分、多靶點(diǎn)、多通路的方式,通過抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)控?fù)p傷組織重塑等機(jī)制,來發(fā)揮治療肩袖損傷的作用,這或許可為今后解痙散瘀湯治療肩袖損傷的相關(guān)實(shí)驗(yàn)提供理論依據(jù)。