吳進(jìn)軒范偉兵安子龍馬恩耀王永福
(1.廣州采芝林藥業(yè)有限公司,廣東 廣州 510000;2.甘肅廣藥白云山中藥科技有限公司,甘肅 定西 743000)
何首烏[1]是我國(guó)中醫(yī)臨床中常用名藥,作為一個(gè)傳統(tǒng)的大宗藥材,應(yīng)用廣泛,化學(xué)成分較為復(fù)雜。現(xiàn)代有相關(guān)研究顯示,何首烏對(duì)高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病有一定的治療效果,同時(shí)還有抗氧化、抗腫瘤的作用,是臨床上滋補(bǔ)肝腎的中藥。何首烏中存在二苯乙烯苷類(lèi)化合物、總多糖、游離蒽醌和結(jié)合蒽醌等多種有效結(jié)構(gòu),因此何首烏具有抗氧化作用,抗動(dòng)脈粥樣硬化作用,免疫調(diào)節(jié)作用,此外,何首烏及其所含的活性成分還有抗炎、抗菌及腦血管保護(hù)作用。人體內(nèi)含有許多對(duì)人體具有重要影響作用的微量元素。微量元素就是占據(jù)人體總重量的萬(wàn)分之一及以下的元素,目前公認(rèn)有13種微量元素對(duì)動(dòng)物生命是不可缺少的[4],這些微量元素對(duì)人體有重要的生理作用。對(duì)酶系統(tǒng)、激素作用及核酸代謝有重要的影響。微量元素可被許多種方法測(cè)定出來(lái),由于傳統(tǒng)的金屬元素分析方法樣品前處理較復(fù)雜,靈敏度較低,且不能同時(shí)測(cè)定多種元素,因此其應(yīng)用受限。本文采用ICP-MS法,采用正交實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定,對(duì)不同采收時(shí)期何首烏微量元素含量的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行測(cè)定。
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硝酸,過(guò)氧化氫,單元素對(duì)照溶液Al(GSB0417132 004)、K(GSB0417332004)、Ca(GSB0417202004)、Fe(GSB0417262004)、Zn(GSB0417612004)。
1.3.1 樣品處理
將不同生長(zhǎng)期的何首烏樣品置于50~60℃的環(huán)境下烘干、粉碎,后過(guò)四號(hào)篩(65目)并密封避光保存,備用。
1.3.2 供試品溶液制備
精密稱(chēng)量已過(guò)篩何首烏樣品粉末約0.2000g后置于氟乙烯消解罐內(nèi),精密量取7mL濃硝酸并加入,蓋好內(nèi)蓋后放置于微波消解儀中,將消解程序設(shè)置為190℃、20min,進(jìn)行消解。完成消解后,拿出消解罐并放置于加熱板上,將溫度設(shè)置為100℃,加熱30min到紅棕色蒸汽揮盡。取出,放冷,將消解后的溶液移入25mL的容量瓶中,并用超純水進(jìn)行少量多次去洗滌消解罐,將洗滌液合并入容量瓶中后用超純水定容,搖均勻,密封待測(cè)。空白溶液的制備同上述操作。高效液相色譜含量測(cè)定及樣品處理方法同2020年版《中國(guó)藥典》規(guī)定。
1.3.3 對(duì)照品溶液的制備
精密吸取Mg、Al、K、Ca、Fe、Cu、Zn 7種元素的單元素對(duì)照品溶液,并用2%的硝酸溶液進(jìn)行稀釋?zhuān)♂尯蟮臐舛葹?000ppm的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。采用逐級(jí)稀釋法制備質(zhì)量濃度為2ppb、5ppb、10ppb、20ppb、50ppb、100ppb、200ppb、500ppb、1000ppb、2000ppb、5000ppb的系列混合對(duì)照品溶液。
2.1.1 線性關(guān)系及檢出限
采用5%稀硝酸將K、Cu、Mg、Fe、Zn、Ca、Mn 7種元素對(duì)照溶液逐級(jí)稀釋[5],空白為5%稀硝酸溶液,繪制各元素線性方程。單元素的同濃度溶液連續(xù)進(jìn)行進(jìn)樣11次,并參照IUPAC的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)展開(kāi)檢出限的實(shí)驗(yàn)測(cè)定,結(jié)果顯示,7種元素的r在0.9978~1范圍內(nèi),具有良好的線性關(guān)系,線性方程及檢出限結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 何首烏線性方程、線性范圍和檢出限
表2 正交設(shè)計(jì)方案
2.1.2 精密度
精密吸取濃度為100ppb的混合對(duì)照品溶液[6],按1.3連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)得上述7種微量元素濃度RSD值為0.98%~4.99%,表明儀器精密度良好。
2.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)
取經(jīng)過(guò)1.3提取的何首烏樣品溶液[7],分別放置于0h、2h、4h、6h、8h進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得上述7種微量元素濃度RSD值為1.37%~4.67%,表明樣品在8h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.1.4 重復(fù)性試驗(yàn)
從同一份何首烏樣品中精密稱(chēng)取0.2000g樣品6份,按照1.3制備供試品溶液,測(cè)得7種元素的RSD值為1.27%~4.95%,說(shuō)明方法重復(fù)性良好。
2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)
何首烏的消解參數(shù)包括混酸比、消解時(shí)間、消解溫度,在實(shí)驗(yàn)過(guò)程當(dāng)中保持其他參數(shù)一定,調(diào)節(jié)某一影響因素,通過(guò)對(duì)比微量元素總含量的多少選擇最佳的消解條件[8]。
2.2.1.1 混酸比單因素實(shí)驗(yàn)
在何首烏樣品中依次加入7mL、6mL、5mL、4mL、3mL、2mL、1mL濃硝酸并用過(guò)氧化氫補(bǔ)足至7mL,微波消解程序?yàn)?60℃,10min,操作方法同1.3,進(jìn)行測(cè)定,得出實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為如圖1所示。
圖1 混酸比對(duì)微波消解法提取何首烏微量元素含量的影響
從實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出,在消解程序?yàn)?60℃、10min的條件下,加入7mL的硝酸,測(cè)得的微量元素含量最高。
2.2.1.2 消解時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn)
將消解時(shí)間分別設(shè)置為10min、15min、20min、25min、30min,混酸比為1∶1,溫度為160℃,其他操作方法同上述操作,進(jìn)行測(cè)定,得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。
圖2 時(shí)間對(duì)微波消解法提取何首烏微量元素含量的影響
從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,設(shè)定其他條件不變,時(shí)間為20min時(shí),測(cè)出的微量元素含量最高。
2.2.1.3 消解溫度單因素實(shí)驗(yàn)
將消解溫度分別設(shè)置為160℃、170℃、180℃、190℃、200℃,混酸比為1∶1,消解時(shí)間為10min,其他操作方法同上述操作,進(jìn)行測(cè)定,得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。
圖3 溫度對(duì)微波消解法提取何首烏微量元素含量的影響
從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,在其他條件不變的情況下,溫度為190℃時(shí),測(cè)出的微量元素含量最高。
2.2.2 正交實(shí)驗(yàn)
根據(jù)已有的理論和實(shí)驗(yàn)分析,影響微波消解法提取何首烏內(nèi)的微量元素的含量的因素主要有混酸比、溫度及消解時(shí)間。適當(dāng)提高消解溫度對(duì)微量元素提取有促進(jìn)作用,但溫度太高時(shí),微量元素提取含量將減少;消解時(shí)間太長(zhǎng)或者太短都會(huì)導(dǎo)致微量元素提取含量過(guò)低,加入硝酸含量為7mL進(jìn)行消解時(shí),微量元素提取含量較高。因此為了研究3種因素對(duì)微波消解法提取何首烏微量元素含量高低的影響大小,設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)。
2.2.2.1 實(shí)驗(yàn)方案
以混酸比、消解溫度、消解時(shí)間為考察因素,用L9(34)正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)[9]。
2.2.2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果
根據(jù)上述正交設(shè)計(jì)方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn),得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。
表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果
根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,比較均值,何首烏的最佳消解環(huán)境為7mL硝酸、190℃、20min。
2.2.3 顯著性差異實(shí)驗(yàn)
根據(jù)上述正交設(shè)計(jì)方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn),得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。
表4 顯著性差異實(shí)驗(yàn)結(jié)果
由表4可知,根據(jù)方差分析,消解時(shí)間對(duì)微波消解何首烏提取微量元素有顯著性影響。
2.2.4 數(shù)據(jù)分析
不同的采收時(shí)期,何首烏的微量元素含量不同。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Mg、Al、K、Ca、Fe、Zn、Cu微量元素呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。
圖4 樣品微量元素含量
從圖4可以看出[10],Mg、Al、K、Ca、Fe、Zn、Cu 7種微量元素均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì),在種植第521天微量元素含量達(dá)到最高值。其中,7種微量元素的含量大小排列順序?yàn)镵>Ca>Mg>Al>Fe>Zn>Cu,何首烏內(nèi)的K元素含量最高,這是因?yàn)镵是植物生長(zhǎng)過(guò)程中不可或缺的元素之一,植物體內(nèi)的K能做60多種酶的活化劑,可以促進(jìn)何首烏的光合作用,促進(jìn)糖代謝等多種化學(xué)反應(yīng),還可以促進(jìn)氮的吸收和蛋白質(zhì)的合成等,因此何首烏對(duì)K的需求非常大,含量高;Mg先升后降的幅度較大,且7種元素在種植第521天(10月)出現(xiàn)高峰,這可能與何首烏生理活動(dòng)旺盛、酶化反應(yīng)強(qiáng)烈有關(guān)。K、Zn的變化趨勢(shì)較平穩(wěn),上升跟下降的趨勢(shì)變化幅度不大,說(shuō)明何首烏對(duì)K、Zn的吸收較穩(wěn)定。
據(jù)其他文獻(xiàn)[11],不同產(chǎn)區(qū)的何首烏采收期略有不同,不同采收時(shí)期何首烏的微量元素含量也存在一定的差異,在種植第521天微量元素含量出現(xiàn)一個(gè)峰值,但上升和下降的趨勢(shì)不盡一致。據(jù)中國(guó)藥典記載,何首烏最佳采收期為10月,而微量元素含量也在10月出現(xiàn)峰值,這與藥典上記載的最佳采收期一致,符合藥典所述;Mg、Al、K、Ca、Fe、Zn、Cu 7種微量元素在種植的第521天的含量較高。Fe、Cu、Zn是機(jī)體多種酶的活性中心[13],與機(jī)體的免疫功能有密切關(guān)系。如體內(nèi)缺乏Zn,人體的免疫系統(tǒng)將會(huì)受到損害,使得機(jī)體免疫的應(yīng)答、發(fā)生和發(fā)展能力降低;抗感染、抗腫瘤的能力也降低;缺Fe不僅會(huì)引起貧血,還會(huì)使免疫功能和細(xì)胞的吞噬功能受到損害;Cu是影響機(jī)體免疫功能的微量元素之一;Ca、Mg也是高等植物體內(nèi)所必需的微量元素[12],對(duì)植物體的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用;K元素在治療心血管疾病,促進(jìn)血液循環(huán),造血活血抗動(dòng)脈粥樣硬化具有顯著療效;何首烏具有補(bǔ)肝腎、益精血、烏須發(fā)、強(qiáng)筋骨的作用。其藥理作用由有機(jī)有效成分發(fā)揮效用外,可能與Fe、Cu、Zn元素含量較高有關(guān),這些微量元素參與入體調(diào)節(jié)機(jī)體平衡,增強(qiáng)人體免疫功能。
本研究通過(guò)電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)探討不同采收時(shí)期何首烏微量元素的動(dòng)態(tài)變化,進(jìn)行方法性考察,結(jié)果證明,生長(zhǎng)時(shí)期與微量元素的含量間關(guān)系密切,是影響藥材質(zhì)量的重要因素;何首烏中微量元素的動(dòng)態(tài)變化,為藥材質(zhì)量提供保障。此研究揭示了何首烏在不同時(shí)期微量元素含量動(dòng)態(tài)變化規(guī)律,為何首烏種植、采收及加工提供一定依據(jù);中藥材有效成分的含量高低、質(zhì)量好壞不僅與藥材自身、季節(jié)變化或海拔氣候有關(guān)系,還與施肥、土壤含水量等外部環(huán)境影響因素有關(guān)。是否可以利用微量元素的外源性刺激影響何首烏有效成分的含量,進(jìn)而提高藥材產(chǎn)量,有待進(jìn)一步研究。