樊娜 劉鑫 廖若含

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院心血管超聲及心功能科,四川 成都 610000)

心血管疾病是威脅人類生命健康的主要?dú)⑹种?心肌梗死、缺血性心肌病、心力衰竭及動(dòng)脈粥樣硬化等均屬于心血管相關(guān)疾病,且均與心肌細(xì)胞損傷有關(guān),其中心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡是其損傷的重要原因,抑制心肌細(xì)胞損傷是治療心血管疾病的重要途徑〔1～3〕。研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼NRA(lncRNA)可通過氧化應(yīng)激等信號通路及細(xì)胞凋亡調(diào)控缺血性心肌病的發(fā)生和發(fā)展,具有作為心血管疾病治療靶點(diǎn)的潛力〔4〕。KCNQ1重疊轉(zhuǎn)錄物(KCNQ1OT)1過表達(dá)促進(jìn)了阿霉素刺激的心肌細(xì)胞系HL-1的凋亡〔5〕。敲低KCNQ1OT1可以通過調(diào)節(jié)miR-2054/蛋白激酶B(AKT)3軸來減輕心臟肥大〔6〕。急性心肌梗死中,抑制KCNQ1OT1保護(hù)了心肌細(xì)胞免受缺氧觸發(fā)的細(xì)胞凋亡〔7〕,說明KCNQ1OT1與心血管疾病的進(jìn)展密切相關(guān)。研究報(bào)道大鼠梗死心肌中miR-499-5p表達(dá)量下降,miR-499-5p高表達(dá)可靶向Sox6抑制心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡并改善心功能〔8〕。miR-499a-5p可通過靶向CD38減輕缺氧/復(fù)氧引起的心肌細(xì)胞損傷〔9〕。據(jù)報(bào)道,硫氧還蛋白相互作用蛋白(TXNIP)與細(xì)胞氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和炎癥密切相關(guān),心肌缺血/再灌損傷時(shí)TXNIP表達(dá)水平升高并增加心肌自噬〔10〕。厚樸酚通過抑制TXNIP介導(dǎo)的NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白(NLRP)3炎性體活化來拮抗阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞衰老〔11〕。本實(shí)驗(yàn)通過在線軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)KCNQ1OT1與miR-499-5p有結(jié)合位點(diǎn),miR-499-5p與TXNIP有結(jié)合位點(diǎn)。然而KCNQ1OT1、miR-499-5p與TXNIP之間的關(guān)系及l(fā)ncRNA KCNQ1OT1是否通過miR-499a-5p/TXNIP調(diào)控缺氧心肌細(xì)胞損傷還尚未可知。因此,本實(shí)驗(yàn)旨在研究lncRNA KCNQ1OT1是否通過miR-499a-5p/TXNIP調(diào)控缺氧心肌細(xì)胞損傷。

1 材料與方法

1.1主要試劑材料 RNA提取試劑盒、實(shí)驗(yàn)所用抗體購自上海圻明生物;心肌細(xì)胞H9C2購自美國ATCC;PhyScriptTM2×SYBR Green PCR Mastermix、蛋白提取試劑盒、MTT試劑購自飛凈科研公司;DMEM培養(yǎng)基、Trizol試劑購自上海酶研生物;凋亡檢測試劑、超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑購自上海翌圣科技;丙二醛(MDA)測定試劑購自美國Abcam公司。

1.2細(xì)胞處理與分組 心肌細(xì)胞H9C2用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),分為心肌細(xì)胞缺氧預(yù)處理組(HPC)、對照(NC)組;HPC組心肌細(xì)胞先接種于低糖(5 mmol/L)且無血清DMEM培養(yǎng)基,置于缺氧(95% N2+5% CO2)環(huán)境的培養(yǎng)箱中缺氧處理12 h,隨后更換含10%胎牛血清的高糖(25 mmol/L)DMEM 培養(yǎng)液,于5% CO2、95% O2環(huán)境的培養(yǎng)箱中處理24 h;對照組細(xì)胞在含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)液中正常培養(yǎng)。將si-NC、si-lncRNA KCNQ1OT1、miR-NC、miR-499a-5p、si-TXNIP轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞后進(jìn)行缺氧處理,記為si-NC+HPC組、si-lncRNA KCNQ1OT1+HPC組、miR-NC+HPC組、miR-499a-5p+HPC組、si-TXNIP+HPC組;將pcDNA-NC、pcDNA-TXNIP 分別與si-lncRNA KCNQ1OT1共轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞后進(jìn)行缺氧處理,記為pcDNA-NC+si-lncRNA KCNQ1OT1+HPC組、pcDNA-TXNIP+si-lncRNA KCNQ1OT1+HPC組。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測lncRNA KCNQ1OT1、miR-499a-5p和TXNIP mRNA的表達(dá)水平 用Trizol試劑提取各組細(xì)胞的總RNA;反轉(zhuǎn)錄成cDNA,按照試劑盒說明進(jìn)行PCR,相對表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算。以GAPDH和U6為內(nèi)參,引物由上海生工生物工程公司合成,引物序列(5′-3′):lncRNA KCNQ1OT1上游:ACTCACTCACTCACTCACT,下游CTGGCTCCTTCTATCACATT;miR-499a-5p上游GCCCTGTCCCCTGTGTGCCTT,下游AAACATCACTGCAAGTCTT;TXNIP上游AGTGATTGGCAGCAGGTC,下游GGTGTCTGGGATGTTTAGG;GAPDH上游ACTCCACTCACGGCAAATTC,下游TCTCCATGGTGGTGAAGACA;U6上游CGCTTCGGC AGCACATATACTA,下游CGCTTCACGAATTTGC-GTGTCA。

1.4Western印跡 提取各組細(xì)胞總蛋白,取60 μg蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),經(jīng)電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)上;用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,分別加入TXNIP、細(xì)胞周期素(Cyclin)D1、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved-caspase)-3相應(yīng)的一抗,4 ℃孵育過夜,再加入二抗室溫孵育2 h,曝光顯影,定影,用Quantity One分析蛋白條帶的灰度值,以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白表達(dá)水平。

1.5MTT 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后每孔加入20 μl的MTT溶液,孵育4 h,再加入150 μl的二甲基亞砜(DMSO),振蕩反應(yīng)10 min,用酶標(biāo)儀于波長490 nm處檢測吸光度(A)值。

1.6流式細(xì)胞術(shù) 收集各組細(xì)胞,用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗2次,加入500 μl的結(jié)合緩沖液,先加入10 μl的膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC),再加入5 μl的碘化丙啶(PI),混勻后避光孵育10 min;用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.7MDA含量和SOD活性分析 細(xì)胞培養(yǎng)48 h后收集各組細(xì)胞,按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.8雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 構(gòu)建含有miR-499a-5p結(jié)合位點(diǎn)的lncRNA KCNQ1OT1和TXNIP的野生型和突變型熒光素酶載體,將其分別與miR-NC和miR-499a-5p共轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞中,按照試劑盒說明檢測熒光素酶活性。

將pcDNA-NC、pcDNA-lncRNA KCNQ1OT1分別轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞中,pcDNA-lncRNA KCNQ1OT1分別與miR-NC、miR-499a-5p共轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞中,RT-qPCR檢測lncRNA KCNQ1OT1和miR-499a-5p表達(dá)水平,Western印跡檢測TXNIP蛋白表達(dá)水平。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組心肌細(xì)胞H9C2中l(wèi)ncRNA KCNQ1OT1、miR-499a-5p、TXNIP表達(dá) 與NC組比較,HPC組心肌細(xì)胞H9C2中l(wèi)ncRNA KCNQ1OT1表達(dá)水平顯著升高,miR-499a-5p表達(dá)水平顯著降低,TXNIP mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見圖1、表1。

表1 兩組心肌細(xì)胞H9C2中l(wèi)ncRNA KCNQ1OT1、miR-499a-5p、TNXIP表達(dá)

1～6:NC組、HPC組、pcDNA-NC組、pcDNA-lncRNA KCNQ1OT1組、pcDNA-lncRNA KCNQ1OT1+miR-NC組、pcDNA-lncRNA KCNQ1OT1+miR-499a-5p組

2.2下調(diào)lncRNA KCNQ1OT1抑制HPC組心肌細(xì)胞H9C2凋亡、增加細(xì)胞活性、抑制氧化應(yīng)激 與NC組比較,HPC組心肌細(xì)胞H9C2中CyclinD1表達(dá)水平、細(xì)胞活性降低,Cleaved-caspase-3表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率、MDA含量升高,SOD活性降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與si-NC+HPC組比較,si-lncRNA KCNQ1OT1+HPC組心肌細(xì)胞H9C2中CyclinD1表達(dá)、細(xì)胞活性升高,Cleaved-caspase-3表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率、MDA含量降低,SOD活性升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2、表2、圖3。

表2 下調(diào)lncRNA KCNQ1OT1抑制HPC組心肌細(xì)胞H9C2凋亡、增加細(xì)胞活性、抑制氧化應(yīng)激

圖2 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡

1～6:NC組,HPC組,si-NC+HPC組、si-lncRNA KCNQ1OT1+HPC組、miR-NC+HPC組、miR-499a-5p+HPC組

2.3miR-499a-5p抑制HPC組心肌細(xì)胞H9C2凋亡,增加細(xì)胞活性,抑制氧化應(yīng)激 與miR-NC+HPC組比較,miR-499a-5p+HPC組miR-499a-5p、CyclinD1表達(dá)水平、細(xì)胞活性、SOD活性均顯著升高(P<0.05),Cleaved-caspase-3表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率、MDA含量均顯著降低(P<0.05)。見圖2、圖3、表3。

表3 miR-499a-5p抑制HPC組心肌細(xì)胞H9C2凋亡,增加細(xì)胞活性,抑制氧化應(yīng)激

2.4下調(diào)TXNIP抑制HPC組心肌細(xì)胞H9C2凋亡,增加細(xì)胞活性,抑制氧化應(yīng)激 與si-NC+HPC組比較,si-TXNIP+HPC組TXNIP、Cleaved caspase-3表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率、MDA含量均顯著降低,CyclinD1表達(dá)水平、細(xì)胞活性、SOD活性均顯著升高(P<0.05)。見圖2、圖4、表4。

表4 下調(diào)TXNIP抑制HPC組心肌細(xì)胞H9C2凋亡,增加細(xì)胞活性,抑制氧化應(yīng)激

1～4:si-NC+HPC組、si-TNXIP+HPC組、pcDNA-NC-si-lncRNA KCNQ1OTHHPC組、pcDNA-TXNIP+si-lncRNA KCNQ1OT1+HPC組

2.5lncRNA KCNQ1OT1通過靶向miR-499a-5p調(diào)控TXNIP表達(dá) Starbase在線軟件預(yù)測顯示,lncRNA KCNQ1OT1和miR-499a-5p及miR-499a-5p和TXNIP有結(jié)合位點(diǎn)(圖5)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,lncRNA KCNQ1OT1-WT及TXNIP-WT與miR-499a-5p共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞熒光素酶活性低于lncRNA KCNQ1OT1-WT及TXNIP-WT與miR-NC共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(P<0.05),而lncRNA KCNQ1OT1-MUT及TXNIP-MUT與miR-499a-5p或miR-NC共轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞熒光素酶活性無顯著差異(P>0.05)。見表5。與pcDNA-NC組比較,pcDNA-lncRNA KCNQ1OT1組lncRNA KCNQ1OT1和TXNIP表達(dá)水平顯著升高,miR-499a-5p表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);與pcDNA-lncRNA KCNQ1OT1+miR-NC組比較,pcDNA-lncRNA KCNQ1OT1+miR-499a-5p組lncRNA KCNQ1OT1和TXNIP表達(dá)水平顯著降低,miR-499a-5p表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見圖1、表6。

表5 熒光素酶活性分析

表6 各組lncRNA KCNQ1OT1、miR-499a-5p和TXNIP的相對表達(dá)

(A)miR-499a-5p和TXNIP(B)結(jié)合進(jìn)行預(yù)測

2.6TXNIP可以逆轉(zhuǎn)lncRNA KCNQ1OT1下調(diào)對HPC組心肌細(xì)胞H9C2凋亡,細(xì)胞活性和氧化應(yīng)激的影響 與pcDNA-NC+si-lncRNA KCNQ1OT1+HPC組比較,pcDNA-TXNIP+si-lncRNA KCNQ1OT1+HPC組TXNIP、Cleaved-caspase-3表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率、MDA含量均顯著升高,CyclinD1表達(dá)水平、細(xì)胞活性、SOD活性均顯著降低(P<0.05)。見圖2、圖4、表7。

表7 TXNIP可以逆轉(zhuǎn)lncRNA KCNQ1OT1下調(diào)對HPC組心肌細(xì)胞H9C2凋亡,細(xì)胞活性和氧化應(yīng)激的影響

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA KCNQ1OT1表達(dá)水平升高,與相關(guān)研究〔12〕結(jié)果相似,KCNQ1OT1在心血管相關(guān)疾病及細(xì)胞模型中高表達(dá)。KCNQ1OT1可以通過與miR-204-5p結(jié)合來促進(jìn)LGALS3表達(dá),從而加劇小鼠心肌缺血/再灌注損傷〔13〕。KCNQ1OT1敲低顯著改善了氧葡萄糖剝奪和再灌注誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞炎癥,氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡〔14〕,說明KCNQ1OT1不僅影響細(xì)胞凋亡,還與氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)。氧化應(yīng)激指氧化劑產(chǎn)生與抗氧化防御之間的失衡,其發(fā)生與氧自由基異常積累有關(guān),內(nèi)源性和外源性因素都可以誘導(dǎo)氧化應(yīng)激〔15〕。MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物,其含量高低可反映氧自由基對組織細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的損害程度;SOD是抗氧化酶,可清除體內(nèi)多余的氧自由基,抑制氧化應(yīng)激的發(fā)生〔16,17〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明,缺氧誘導(dǎo)了心肌細(xì)胞氧化損傷,下調(diào)KCNQ1OT1可抑制氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激。研究報(bào)道m(xù)R-499可抑制心肌細(xì)胞凋亡及損傷〔18,19〕。miR-499a-5p過表達(dá)促進(jìn)了人骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化〔20〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中miR-499a-5p表達(dá)水平降低;上調(diào)miR-499a-5p可降低缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激;miR-499a-5p具有抗心肌細(xì)胞損傷的作用,且其可受KCNQ1OT1調(diào)控。

七氟烷預(yù)處理可通過調(diào)節(jié)TXNIP抑制氧-葡萄糖剝奪誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化損傷〔21〕。miR-148a通過抑制TXNIP和Toll樣受體(TLR)4/NF-κB/NLRP3炎性體信號通路來減輕心肌缺血/再灌注損傷〔22〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中TXNIP mRNA和蛋白表達(dá)水平升高;下調(diào)TXNIP可降低缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激,下調(diào)TXNIP可抑制心肌細(xì)胞損傷;miR-499a-5p調(diào)控TXNIP表達(dá),且KCNQ1OT1靶向調(diào)控miR-499a-5p;過表達(dá)KCNQ1OT1 后,miR-499a-5p表達(dá)水平降低,TXNIP表達(dá)水平升高;過表達(dá)TXNIP可以逆轉(zhuǎn)lncRNA KCNQ1OT1下調(diào)對缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9C2的影響,提示KCNQ1OT1可能通過miR-499a-5p調(diào)控TXNIP的表達(dá)。

綜上,下調(diào)lncRNA KCNQ1OT1可能通過miR-499a-5p/TXNIP軸抑制缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激,促進(jìn)細(xì)胞存活。