祁順來 張永剛 朵德龍

(青海省人民醫(yī)院 1中醫(yī)科,青海 西寧 817000;2藥學(xué)部)

鼻咽癌是我國常見的頭頸部腫瘤之一,患者5年生存率較低,大部分患者對放療產(chǎn)生不良反應(yīng)或放療抵抗性,研究證實(shí)中藥在腫瘤治療方面發(fā)揮重要作用,雷公藤紅素等中藥活性成分可抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移等〔1～4〕。甘草甜素(GL)是從中藥甘草中分離提取的三萜類成分,研究表明其對肝癌、食管癌等多種腫瘤具有抑制作用〔5〕。但GL對鼻咽癌的治療效果及其可能作用機(jī)制尚未可知。環(huán)狀RNA(circRNA)在腫瘤中異常表達(dá),并可能作為腫瘤診斷及治療的潛在靶點(diǎn),研究表明circ_0009910在胃癌中表達(dá)水平升高〔6〕。因此,本研究主要探討GL對鼻咽癌6-10B細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其對circ_0009910的調(diào)控作用,旨在為鼻咽癌藥物的研發(fā)提供新線索。

1 材料與方法

1.1一般資料 收集2017年5月至2018年11月于青海省人民醫(yī)院接受手術(shù)治療的39例鼻咽癌患者的鼻咽癌組織、癌旁組織,其中男29例,女10例,年齡53～65歲,平均年齡(60.16±4.21)歲。

1.2藥物、細(xì)胞與試劑 GL購自南京澤朗醫(yī)藥;人鼻咽癌細(xì)胞6-10B購自上海信裕生物;杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)、Opti-MEM減血清培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco;四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑購自碧云天生物;Matrigel購自北京索萊寶;Transwell小室購自美國Corning;Trizol購自北京全式金生物;Lipofectamine2000購自美國Invitrogen;si-circ_0009910、si-NC購自廣州銳博生物;逆轉(zhuǎn)錄試劑、SYBR熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑購自北京天根生化;兔抗人Ki-67、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9抗體購自美國CST;二抗購自北京中杉金橋生物。StepOne Plus實(shí)時熒光定量PCR儀購自美國ABI。

1.3實(shí)驗(yàn)分組 6-10B細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞板,每孔1×105個細(xì)胞,分別用含10、20、40 μmol/L GL的DMEM培養(yǎng)基孵育24 h〔7〕,記為低劑量GL(GL-L)組、中劑量GL(GL-M)組、高劑量GL(GL-H)組。用不含GL的DMEM培養(yǎng)基孵育的6-10B細(xì)胞作為對照(Con)組。采用Opti-MEM減血清培養(yǎng)基與si-NC、si-circ_0009910充分混勻后室溫孵育5 min記為A液,Lipofectamine2000與Opti-MEM減血清培養(yǎng)基充分混勻后記為B液,將A液與B液充分混勻后室溫孵育20 min,轉(zhuǎn)染6 h后將培養(yǎng)基更換為DMEM正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h,依次記為si-NC組、si-circ_0009910組。按照同樣的方法分別轉(zhuǎn)染pcDNA、pcDNA-circ_0009910至6-10B細(xì)胞6 h后加入含有濃度為40 μmol/L的GL培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h,分別記為GL+pcDNA組、GL+pcDNA-circ_0009910組。

1.4MTT檢測細(xì)胞增殖 將3×103個6-10B細(xì)胞接種于96孔板,依據(jù)“1.3”分組方法處理后,每孔加入20 μl MTT試劑,4 h后每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl,應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測光密度(OD)值并按照公式〔(抑制率=對照組OD-實(shí)驗(yàn)組OD)/(對照組OD-空白組OD)×100%〕計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

1.5Transwell法測定細(xì)胞遷移、侵襲 將各組6-10B細(xì)胞(1×105個/ml)加入含(侵襲實(shí)驗(yàn))或不含(遷移)40 μl Matrigel基質(zhì)膠稀釋液小室的上室(200 μl/孔),小室的下室加入培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)600 μl,培養(yǎng)24 h后,從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞隔室。4%多聚甲醛固定遷移或侵襲的細(xì)胞20 min,固定后,細(xì)胞用0.1%結(jié)晶紫染液染色10 min,干燥后拍照計(jì)數(shù)。

1.6實(shí)時熒光定量-PCR測定circ_0009910表達(dá) 采用Trizol從鼻咽癌組織與各組6-10B細(xì)胞中提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,cDNA加入焦碳酸二乙酯(DEPC)水稀釋20倍,使用SYBR熒光定量PCR試劑配制qRT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系。StepOnePlus實(shí)時熒光定量-PCR儀用來檢測circ_0009910相對表達(dá)水平。

1.7Western印跡檢測Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá) 提取6-10B細(xì)胞蛋白,檢測蛋白濃度后,將含有上樣緩沖液的蛋白混合物上樣至十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)2 h,轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜,用WB阻斷緩沖液阻斷2 h。然后用Ki-67(1∶800)、MMP-2(1∶1 000)、MMP-9(1∶1 000)一抗孵育在4 ℃孵育24 h,再用1∶2 000稀釋的二抗在室溫下孵育1 h。最后,用電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影,并用自動凝膠成像系統(tǒng)分析各蛋白條帶灰度值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1GL對鼻咽癌6-10B細(xì)胞增殖的影響 不同劑量GL處理后可促使細(xì)胞增殖抑制率升高而抑制Ki-67蛋白表達(dá),呈劑量依賴性,不同劑量GL組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),見圖1、表1。

表1 GL對鼻咽癌6-10B細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響

圖1 Western印跡檢測各組Ki-67蛋白表達(dá)

2.2GL對鼻咽癌6-10B細(xì)胞遷移、侵襲的影響 不同劑量GL處理后可抑制細(xì)胞遷移及侵襲,抑制MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá),呈劑量依賴性,且不同劑量GL組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),見表1、圖2。

圖2 Western印跡檢測MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)

2.3鼻咽癌組織中circ_0009910表達(dá)比較 circ_0009910在鼻咽癌組織中表達(dá)水平(3.85±0.21)顯著高于癌旁組織(1.00±0.00;t=40.714,P<0.001)。

2.4GL對鼻咽癌細(xì)胞circ_0009910表達(dá)的影響 與Con組circ_0009910表達(dá)水平(1.00±0.00)比較,GL-L組(0.76±0.04)、GL-M組(0.58±0.03)、GL-H組(0.39±0.03)circ_0009910表達(dá)水平顯著降低,且呈劑量依賴性,不同劑量GL組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=716.029,P<0.001)。

2.5抑制circ_0009910表達(dá)影響鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲 與si-NC組比較,si-circ_0009910組增殖抑制率增加,遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)及Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白水平下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),見表2、圖3。

表2 抑制circ_0009910表達(dá)對鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及相關(guān)蛋白表達(dá)影響

圖3 抑制circ_0009910表達(dá)影響鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲相關(guān)蛋白

2.6circ_0009910過表達(dá)逆轉(zhuǎn)GL對鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 與GL+pcDNA組比較,GL+pcDNA-circ_0009910組細(xì)胞增殖抑制率下降,遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)增多,Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),見圖4、表3。

表3 circ_0009910過表達(dá)逆轉(zhuǎn)GL對鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

1,2:GL+pcDNA組、GL+pcDNA-circ_0009910組

3 討 論

本研究結(jié)果顯示,GL使鼻咽癌細(xì)胞增殖被抑制,并可抑制Ki-67的表達(dá),且隨著藥物濃度的增加而明顯變化。GL具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫的作用,并可抑制腫瘤細(xì)胞生長,研究表明GL可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖〔8〕。另外,GL可抑制胃癌細(xì)胞增殖、黏附及遷移〔9〕。GL可能通過B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2及Bcl相關(guān)X基因(Bax)促進(jìn)舌癌細(xì)胞凋亡并抑制增殖及侵襲〔10〕。研究表明Ki-67在鼻咽癌中呈高表達(dá),其高表達(dá)量與細(xì)胞增殖密切相關(guān)〔11〕。本研究結(jié)果提示,GL以劑量依賴的方式阻滯鼻咽癌細(xì)胞增殖。鼻咽癌細(xì)胞中MMP-2、MMP-9表達(dá)上調(diào),其可通過降解細(xì)胞外基質(zhì)沉積來提高細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力〔12〕。本研究結(jié)果顯示,GL可抑制鼻咽癌細(xì)胞遷移及侵襲,且呈劑量依賴性。但GL調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制仍有待探索。

本研究提示,GL對鼻咽癌細(xì)胞增殖的抑制作用可能是通過降低circ_0009910表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。研究顯示,circ_0009910通過miR-335-5p/Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK)1軸促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移〔13〕。沉默circ_0009910可通過增加miR-20a-5p抑制急性髓性白血病細(xì)胞的生長〔14〕。circ_0009910通過調(diào)控miR-449a/白細(xì)胞介素(IL)-6R而促進(jìn)骨肉瘤的發(fā)生及發(fā)展〔15〕。本研究結(jié)果顯示,GL對鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響可被circ_0009910過表達(dá)所恢復(fù)。

綜上所述,GL可降低鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力,鼻咽癌組織中circ_0009910表達(dá)增強(qiáng),GL可通過降低circ_0009910表達(dá)阻礙鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。