符宗冬 李鴿 林雪娟 陳麗君,2 張大啟,2 李其富,2 廖小平 趙文杰

(1海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,海南 ?？?570102;2海南省熱帶腦科學(xué)研究與轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

炎癥與許多老年慢性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),如動脈粥樣硬化、心腦血管疾病、糖尿病、帕金森病和阿爾茨海默病等〔1〕,而巨噬細(xì)胞及其免疫網(wǎng)絡(luò)在慢性炎癥過程中發(fā)揮重要作用,深入研究并篩選基于調(diào)控巨噬細(xì)胞過度活化的分子靶點(diǎn),對許多慢性疾病的預(yù)防與治療有積極意義。鳶尾素(Irisin)作為一種新近發(fā)現(xiàn)的糖基化蛋白,已被證實(shí)可改善運(yùn)動并參與糖脂代謝〔2〕。近年研究發(fā)現(xiàn),糖尿病和慢性腎臟疾病患者血清Irisin水平明顯下降,且其水平與炎癥因子水平之間存在相關(guān)性〔3〕。此外,Irisin還可明顯減輕脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的炎癥〔4〕,然而其分子抗炎機(jī)制仍不十分清楚。

本研究通過檢測Irisin對LPS誘導(dǎo)的人髓系白血病單核細(xì)胞(THP)-1、巨噬細(xì)胞分泌的白介素(IL)-6、IL-1β和腫瘤壞死因子(TNF)-α水平、細(xì)胞線粒體膜電位(MMP)和活性氧(ROS)水平及其對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)和核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB信號通路的影響,探索Irisin是否可通過調(diào)控ERS改善巨噬細(xì)胞炎癥,為其作為分子靶點(diǎn)預(yù)防和治療慢性炎癥相關(guān)疾病提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與試劑 人THP-1單核細(xì)胞系購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。佛波酯購于美國Sigma-Aldrich公司。TNF-α、IL-1β和IL-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購于美國 Invitrogen 公司。LPS、MMP試劑盒(JC-1)和ROS試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路蛋白雙鏈RNA激活的蛋白激酶類內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)、激活轉(zhuǎn)錄因子(ATF)6和肌醇需要酶(IRE)1相關(guān)抗體、phospho-NF-κB p65和NF-κB p65抗體均購于美國Cell Signaling Technology,Inc (CST)公司。Irisin購自美國PeproTech公司。衣霉素(TM)購自CST公司。

1.2ELISA檢測TNF-α、IL-1β和IL-6水平 采用0.1 μmol/L佛波酯誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞48 h,使其從單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞。然后,利用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)THP-1巨噬細(xì)胞24 h,接著分別用LPS、不同濃度Irisin、LPS+不同濃度Irisin或LPS+Irisin(200 ng/ml)+ TM(10 ng/ml)進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后,收集上清。分為正常對照組(不進(jìn)行任何操作的單一THP-1巨噬細(xì)胞)、LPS組(THP-1巨噬細(xì)胞炎性模型組,LPS 200 ng/ml)、25 ng/ml Irisin組、50 ng/ml Irisin組、100 ng/ml Irisin組、200 ng/ml Irisin組、LPS+25 ng/ml Irisin組、LPS+50 ng/ml Irisin組、LPS+100 ng/ml Irisin組、LPS+200 ng/ml Irisin組、LPS+200 ng/ml Irisin+10 ng/ml TM組。根據(jù)ELISA試劑盒說明書檢測各組上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。

1.3MMP檢測 按照J(rèn)C-1說明書測定MMP。操作如下:將JC-1染色工作液加入每個孔中,孵育45 min。之后,用1×JC-1染色緩沖液清洗細(xì)胞兩次,在熒光顯微鏡下觀察,或用熒光酶標(biāo)儀測量熒光值。

1.4ROS檢測 根據(jù)ROS試劑盒說明檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平。將THP-1巨噬細(xì)胞與2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)在37 ℃孵育45 min。使用熒光酶標(biāo)儀測量熒光值或熒光顯微鏡下觀察。

1.5Western印跡檢測 RIPA緩沖液裂解細(xì)胞提取各組蛋白。總蛋白濃度用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒檢測。蛋白質(zhì)在10%的聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離,轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯(PVDF)膜。采用5%(W/V)脫脂奶粉封閉2 h,使用抗PEPK、IRE1α、免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BIP)、NF-κB p65、phospho-NF-κB p65、β-actin和磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)一抗4 ℃孵育過夜。二抗孵育2 h。使用Amersham Imager 600QC凝膠成像儀獲得圖像。使用Image J對條帶強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用PRISM軟件(GraphPad 5.0,San Diego,CA,USA)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)。

2 結(jié) 果

2.1Irisin和TM對LPS誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞IL-6、IL-1β和TNF-α分泌的影響 與正常對照組相比,LPS可顯著增加THP-1巨噬細(xì)胞中IL-6、IL-1β和TNF-α水平(均P<0.05);僅有高濃度Irisin(100 ng/ml和200 ng/ml)處理LPS誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞后,可明顯抑制IL-6、IL-1β和TNF-α濃度(P<0.05);單獨(dú)使用Irisin處理THP-1細(xì)胞后IL-6、IL-1β和TNF-α分泌水平組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?？紤]到Irisin濃度為200 ng/ml時(shí),IL-6、IL-1β和TNF-α的水平下降最多,所以選擇200 ng/ml Irisin作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的最佳濃度,設(shè)為LPS+Irisin組。與LPS+200 ng/ml Irisin組相比,LPS+200 ng/ml Irisin+TM組THP-1巨噬細(xì)胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平顯著升高(均P<0.05)。見表1。

表1 Irisin和TM對LPS誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-6的影響(pg/ml,n=3)

2.2Irisin對LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞MMP的影響 與正常對照組相比,LPS組紅綠熒光強(qiáng)度明顯降低(P<0.05)。而與LPS組相比,LPS+Irisin組紅綠熒光強(qiáng)度比值明顯升高(P<0.05)。見表2和圖1。

圖1 各組THP1巨噬細(xì)胞MMP和氧化應(yīng)激比較(×200)

表2 各組THP-1巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激和MMP比較

2.3Irisin對LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞ROS的影響 與正常對照組相比,LPS組細(xì)胞ROS顯著增加(P<0.05)。與LPS組比較,LPS+Irisin組ROS含量下降到正常水平,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2和圖1。

2.4Irisin對LPS誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞BIP、PERK、IRE1和phospho-NF-κB p65表達(dá)的影響 LPS組BIP、PERK和IRE1α表達(dá)水平明顯高于正常對照組(均P<0.05);LPS+Irisin組BIP、PERK和IRE1α的表達(dá)水平明顯低于LPS組(均P<0.05);與LPS+Irisin組相比,LPS+Irisin+TM組BIP、PERK和IRE1α表達(dá)明顯增加(均P<0.05)。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),與正常對照組相比,LPS組的phospho-NF-κB p65/NF-κB p65比值明顯增加(P<0.05);LPS+Irisin組中phospho-NF-κB p65/NF-κB p65比值明顯低于LPS組(P<0.05);與LPS+Irisin組相比,LPS+Irisin+TM組中phospho-NF-κB p65/NF-κB p65比值明顯增加(P<0.05)。見表3、圖2。

1～4:正常對照組、LPS組、LPS+Irisin組、LPS+Irisin+TM組

表3 各組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及NF-κB關(guān)鍵蛋白相對表達(dá)水平比較

3 討 論

Irisin于2012年由Bostr?m等〔2〕首次發(fā)現(xiàn),是一種運(yùn)動誘導(dǎo)的、骨骼肌分泌的糖基化蛋白,前期研究發(fā)現(xiàn)其具有改善運(yùn)動、參與糖脂代謝、保護(hù)線粒體和神經(jīng)元等功能。后續(xù)發(fā)現(xiàn)Irisin在動脈粥樣硬化、糖尿病、腦卒中、肥胖、炎癥性腸病和阿爾茨海默病等疾病中發(fā)揮明顯抑炎作用〔5〕。巨噬細(xì)胞在許多慢性炎性相關(guān)疾病致病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。LPS是革蘭陰性菌外膜的重要組成部分,是巨噬細(xì)胞的主要炎癥刺激因子。LPS通過激活許多信號通路,觸發(fā)人類單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的某些細(xì)胞因子,包括TNF-α和IL-1家族,誘發(fā)炎癥反應(yīng),在各種炎癥性疾病的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。LPS誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞是研究炎癥的一個經(jīng)典細(xì)胞模型〔6,7〕。為了探索Irisin的可能抑炎機(jī)制,本研究采用了LPS誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞體外模型,結(jié)果支持Irisin在慢性炎癥過程中發(fā)揮抗炎作用。

線粒體功能障礙導(dǎo)致能量代謝異常,產(chǎn)生過多的ROS,在引起誘發(fā)炎癥方面起重要作用〔8〕。本研究發(fā)現(xiàn),Irisin可以改善LPS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。這些結(jié)果表明,Irisin可能通過改善線粒體功能和氧化應(yīng)激,在減少巨噬細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子的分泌發(fā)揮關(guān)鍵作用。通過這種機(jī)制,Irisin可以維持機(jī)體巨噬細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡,從而發(fā)揮抑炎作用。

ERS是一種保護(hù)性的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng),多表現(xiàn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)平衡的破壞和各種病理狀態(tài)下的功能障礙。長期或過度的ERS可能會引起炎癥反應(yīng)或細(xì)胞凋亡,在激活巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中起重要作用,并參與各種慢性炎性相關(guān)性疾病的發(fā)展〔9〕。它可導(dǎo)致大量錯誤折疊和未折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)積聚,并引起鈣平衡的紊亂。未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)途徑是ERS中最重要的通路,它可通過分子伴侶葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(GRP)78/BIP和3種受體蛋白激活,即PERK、ATF6和IRE1 3條信號通路激活炎癥反應(yīng)〔10,11〕。此外,氧化還原平衡失調(diào)和線粒體功能障礙在ERS介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中也起著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)Irisin可以抑制ERS的過度激活,而且這種作用被ERS激活劑TM所逆轉(zhuǎn)。在正常生理?xiàng)l件下,PERK和IRE1在維持ERS方面起關(guān)鍵作用,而在病理?xiàng)l件下,它們通過與BIP解離而被激活,引起一系列的UPR。UPR通過 PERK、 IRE1、 ATF6 三條信號通路激活炎癥反應(yīng),進(jìn)一步激活NF-κB信號通路〔12〕。NF-κB的經(jīng)典活性形式由 p50/p65 復(fù)合物組成,可以形成不同于 rel、激活蛋白(AP)1和類固醇激素受體家族成員的二聚體。NF-κB被認(rèn)為是炎癥過程和自身免疫性疾病的一個重要機(jī)制〔13〕。許多重要的抗炎和免疫抑制藥物都抑制NF-κB通路,因此本研究檢測了NF-κB通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Irisin可明顯抑制NF-κB p65的激活,提示Irisin可能通過阻止ERS和NF-κB通路的激活,從而減少炎癥因子的分泌。

綜上,Irisin可有效抑制LPS誘導(dǎo)的THP1巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌,改善線粒體功能,維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡。其可能機(jī)制是通過抑制ERS和NF-κB信號通路,從而在某些慢性炎癥相關(guān)疾病中產(chǎn)生抗炎作用,因而Irisin未來有希望成為治療許多老年慢性炎癥相關(guān)疾病的潛在藥物靶點(diǎn)。