李林 殷月 王晨晨 莊寶祥 王岱君

濰坊醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 1解剖學(xué)教研室，2生理學(xué)教研室，3形態(tài)學(xué)實驗室（山東濰坊 261053）

肢體缺血-再灌注損傷是臨床中常見的一種病理生理過程，嚴(yán)重的肢體缺血-再灌注不僅影響局部缺血組織的存活和功能，還可造成全身炎癥反應(yīng)綜合征和導(dǎo)致多器官功能受損［1-3］，其中心［4-5］便常發(fā)生此類損傷。肢體缺血-再灌注引起其他器官損傷的機(jī)制復(fù)雜多樣，而細(xì)胞凋亡則是重要原因之一［6-7］。細(xì)胞凋亡是被精確調(diào)控的程序性死亡，主要通過三大信號傳導(dǎo)通路調(diào)控，即死亡受體通路，線粒體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路［8］。其中，死亡受體通路則通過激活腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor，TNFR）超家族中的死亡受體（death receptor，DR）而觸發(fā)細(xì)胞凋亡。DR3 作為TNFR 超家族受體之一，其胞外結(jié)構(gòu)域與配體TL1A 結(jié)合后可通過死亡結(jié)構(gòu)域（death domain，DD）相互作用，引導(dǎo)TRADD-DD（tumor necrosis factor receptor type 1-associated death domain protein）募集到DR3-DD，建立近端膜平臺招募下游受體，隨后TRADD 與DR3 分離，TRADD 與招募到的FADD（fas-associated death domain protein）與Caspase8 結(jié)合，形成二級死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物，最終導(dǎo)致Caspase 依賴性凋亡［9-10］。至今，對肢體缺血-再灌注后心損傷及細(xì)胞凋亡并無十分有效的防治方法，探尋有效防治方法尤為重要。氫是自然界最簡單的元素，氫氣一直被認(rèn)為屬于生理性惰性氣體，在生物體內(nèi)不具有重要作用。直至2007年，OHSAWA 等［11］報道氫氣可選擇性中和羥自由基和亞硝酸陰離子以保護(hù)腦缺血-再灌注損傷后，才引起了研究氫氣治療疾病的熱潮。研究表明，氫氣在防治心缺血-再灌注中也表現(xiàn)出不俗的潛力［12-13］。筆者在前期工作中發(fā)現(xiàn)，氫氣可抑制DR4 和DR5 的配體TRAIL（tumor necrosis factorassociated apoptosis induced ligand）表達(dá)，從而減輕骨骼肌細(xì)胞凋亡［14-15］。而氫氣對同為死亡受體的DR3 以及對肢體缺血-再灌注后心肌細(xì)胞凋亡的影響卻鮮有文獻(xiàn)報道。本研究先采用KEGG 通路富集分析心肌缺血-再灌注后基因表達(dá)是否與細(xì)胞凋亡相關(guān)，為研究提供支持。TUNEL 觀察肢體缺血-再灌注后心肌細(xì)胞凋亡情況，ELISA 測定血清TL1A 和DR3 水平，WB 法測定心肌組織TL1A 和DR3 蛋白相對表達(dá)量，RT-qPCR 測定心肌組織TL1A 和DR3 mRNA 相對表達(dá)量，以探討氫氣能否通過抑制TL1A/DR3 通路減輕肢體缺血-再灌注后心肌細(xì)胞凋亡。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物雄性新西蘭大耳白兔18只，兔齡70～80 d，體質(zhì)量（2.08 ± 0.19）kg，按SPF 級動物飼養(yǎng)要求喂養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境設(shè)置為濕度（50 ± 10）%，溫度（23 ± 2）℃，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。實驗動物由青島康大生物科技有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（魯）20160002。本實驗由濰坊醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號：2021SDL281。

1.1.2 主要儀器與試劑主要儀器：CX41 光學(xué)顯微鏡，Olympus IX 73 熒光倒置顯微鏡及其攝像系統(tǒng)均由日本Olmpus 公司生產(chǎn)，DNM-9602 酶標(biāo)分析儀由北京普朗新技術(shù)有限公司生產(chǎn)，AmershamImageQuant 800 超靈敏多功能成像儀由云南萊博科技有限公生產(chǎn)，QuantStudio? 5 實時熒光定量PCR系統(tǒng)由賽默飛世爾科技（中國）有限公司生產(chǎn)。

主要試劑：TL1A ELISA 檢測試劑盒（JL52648-96T）購于上海江萊生物科技有限公司，DR3 ELISA 檢測試劑盒（MM-8276402）購于江蘇酶免實業(yè)有限公司，一步法TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（C1088）購于碧云天生物技術(shù)研究所，DR3 抗體（A14261）購于Abclone，Caspase3 抗體（bs-0081R）、TL1A 抗體（bs-5092R）與?-tubulin 抗體（bs-4511R）均購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）與BCA 蛋白濃度測定試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所，ReverTra Ace qPCR RT Kit 購于日本TOYOBO 公司。

1.2 方法

1.2.1 心肌缺血-再灌注數(shù)據(jù)集KEGG 通路富集從GEO 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載GSE160516 數(shù)據(jù)集表達(dá)矩陣文件和GPL23038 平臺文件。該數(shù)據(jù)集包括4 例假手術(shù)小鼠樣本數(shù)據(jù)（GSM4874400-03）以及12 例心肌缺血-再灌注小鼠的樣本（GSM4874404-15）數(shù)據(jù)。在RStudio 4.2.0 中通過“l(fā)imma”包［15］對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。通過|log2FC| ＞ 1（Fold Change，差異倍數(shù)）和P＜ 0.05 過濾差異表達(dá)基因。最后，在rstudio 中使用“clusterprofiler”包［16］，設(shè)置P＜ 0.05，進(jìn)行表達(dá)差異基因的KEGG 通路富集。

1.2.2 動物分組采用隨機(jī)數(shù)字表法將18 只實驗動物隨機(jī)分為C 組、R 組和H 組，每組6 只。

1.2.3 缺血-再灌注模型建立C 組：200 g/L 烏拉坦5 mL/kg 耳緣靜脈注射麻醉，將寬度為3 cm 的特制袖帶連接臺式水銀血壓計，綁縛于實驗動物雙后肢根部股動脈搏動處，不做充氣加壓處理［17］；R 組：在C 組處理的基礎(chǔ)上，將袖帶充氣，以超過收縮壓20～30 mmHg作為完全阻斷血流的壓力，保持此缺血狀態(tài)4 h，然后袖帶放氣，使血流再通，形成雙后肢缺血-再灌注模型，隨即于兔右下腹處，以5 mL/kg 量的空氣進(jìn)行腹腔注射；H 組：以5 mL/kg用量行氫氣腹腔注射，其余處理與R組相同。

1.2.4 取材于再灌注24 h 時，耳緣靜脈取血液4 mL，靜置25 min，2 500 r/min 離心10 min，取上清，-80 ℃冰箱分裝凍存?zhèn)溆?；立刻處死動物，摘取心臟，切取心臟左心室組織，用預(yù)冷生理鹽水洗凈后分為兩部分，一部分放入4%多聚甲醛中固定，一部分放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 ELISA 檢測兔血清TL1A，DR3 水平取-80 ℃冰箱凍存的血清，ELISA 法檢測血清TL1A和DR3 水平，嚴(yán)格按照劑盒說明書操作。

1.2.6 TUNEL檢測兔心肌細(xì)胞凋亡率心肌組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，丙酮脫水、二甲苯透明，常規(guī)制作石蠟切片（4 μm）。嚴(yán)格按照TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒要求操作。磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗，滴加DAPI、PBS 沖洗、抗熒光淬滅封片液封片，Olympus IX 73 熒光倒置顯微鏡下觀察。TUNEL 激發(fā)波長為450 nm（綠色熒光），DAPI 激發(fā)波長為400 nm（藍(lán)色熒光）。每組（n=6）隨機(jī)選取6 張切片，每張切片隨機(jī)選取6 個視野取平均值（400×），用Image J 軟件對TUNEL和DAPI 細(xì)胞進(jìn)行量化，計算細(xì)胞凋亡率［TUNEL細(xì)胞數(shù)/（DAPI 細(xì)胞數(shù)+TUNEL 細(xì)胞數(shù)）］。

1.2.7 Western blot檢測兔心肌組織TL1A、DR3及Caspase3 蛋白表達(dá)取0.05 g 凍存心肌組織液氮研磨，置于EP 管，加入強(qiáng)組織裂解液，離心，取上清，用BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，計算所需蛋白上樣量，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶封閉（濃度8%），加一抗（Tublin 1∶40 000，TL1A 1∶3 500，DR3 1∶500，Caspase3 1∶1 000），4 ℃孵育過夜，洗膜，加入含二抗（山羊抗兔1∶2 000），室溫孵育1 h，洗膜，Amersham Image Quant 800 超靈敏多功能成像儀顯影，使用PS 截取圖像和Image J 測定灰度值。

1.2.8 RT-qPCR 檢測心肌組織TL1A、DR3 與Caspase3 mRNA 表達(dá)將C、R 和H 組的心肌組織由Trizol 法提取總RNA，總RNA 按試劑盒操作逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行RT-qPCR 擴(kuò)增，2-△△Ct計算相對表達(dá)水平。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用GraphPad prism 9.0.0 對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計方法采用單因素方差分析，多重比較采用Tukey 法，以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KEGG 通路富集結(jié)果通過對GSE160516 數(shù)據(jù)集差異基因的挑選以及KEGG 通路的富集，發(fā)現(xiàn)心肌缺血-再灌注后，基因表達(dá)富集在Apoptosis信號通路、TNF 信號通路和MAPK 信號通路等。見圖1。

圖1 GSE160516 差異基因的TOP20 KEGG 通路富集圖Fig.1 The TOP20 KEGG pathway enrichment map of GSE160516 differential genes

2.2 兔血清TL1A 和DR3 水平與C 組比較，R 組兔血清TL1A和DR3表達(dá)水平顯著增加（P＜ 0.01）；與R 組比較，H 組兔血清TL1A 和DR3，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義表達(dá)水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01）。見表2。

表2 兔血清TL1A 和DR3 水平Tab.2 TL1A and DR3 level of rabbits serum ±s，pg/mL

表2 兔血清TL1A 和DR3 水平Tab.2 TL1A and DR3 level of rabbits serum ±s，pg/mL

注：與R組比較，*P ＜ 0.01

組別C組R組H組F值P值DR3 10.085 ± 2.482*31.129 ± 3.957 12.495 ± 0.561*107.9＜ 0.001 TL1A 2.012 ± 0.354*8.317 ± 0.805 2.733 ± 0.105*273.3＜ 0.001

2.3 兔心肌細(xì)胞凋亡率TUNEL結(jié)果顯示，R組與H 組心肌細(xì)胞發(fā)生了凋亡。相較于C 組［（1.191 ±0.168）%］，R 組［（5.465 ± 0.654）%］心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜ 0.01）；相較于R 組，H 組［（1.316 ±0.245）%］細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜ 0.01）；H 組與C組比較，細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。見圖2。

圖2 兔心肌細(xì)胞凋亡TUNEL 圖（400×）Fig.2 TUNEL plot of apoptosis in rabbit myocardium（400×）

2.4 兔心肌組織TL1A、DR3 和Caspase3 蛋白相對表達(dá)量Western blot 結(jié)果顯示，與C 組比較，R組兔心肌組織TL1A、DR3 和Caspase3 蛋白相對表達(dá)量顯著增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01）；與R 組比較，H 組心肌組織中的TL1A、DR3 和Caspase3 蛋白相對表達(dá)量顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01）。見圖3、表3。

圖3 兔心肌組織TL1A、DR3 和Caspase3 蛋白表達(dá)Fig.3 Expression of TL1A，DR3 and Caspase3 proteins in rabbit myocardium

表3 兔心肌組織TL1A、DR3 和Caspase3 蛋白相對表達(dá)Tab.3 Relative expression of TL1A，DR3 and Caspase3 proteins in rabbit myocardium±s，n =6

表3 兔心肌組織TL1A、DR3 和Caspase3 蛋白相對表達(dá)Tab.3 Relative expression of TL1A，DR3 and Caspase3 proteins in rabbit myocardium±s，n =6

注：與R組比較，*P ＜ 0.01

組別C組R組H組F值P值Caspase3 0.229 ± 0.011*1.432 ± 0.076 1.133 ± 0.010*1178＜ 0.001 TL1A 0.036 ± 0.010*0.481 ± 0.051 0.373 ± 0.010*346.2＜ 0.001 DR3 0.614 ± 0.034*0.756 ± 0.013 0.655 ± 0.035*37.70＜ 0.001

2.5 兔心肌組織TL1A、DR3和Caspase3 mRNA相對表達(dá)量與C組比較，R組兔心肌組織TL1A、DR3和Caspase3 mRNA相對表達(dá)量顯著增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01），與R組比較，H組心肌組織TL1A、DR3 和Caspase3 mRNA 相對表達(dá)量顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05，P＜ 0.01）。見表4。

表4 兔心肌組織TL1A、DR3 和Caspase3 mRNA 相對表達(dá)Tab.4 Relative expression of TL1A，DR3 and Caspase3 mRNA in rabbit myocardium ±s

表4 兔心肌組織TL1A、DR3 和Caspase3 mRNA 相對表達(dá)Tab.4 Relative expression of TL1A，DR3 and Caspase3 mRNA in rabbit myocardium ±s

注：與R組比較，*P ＜ 0.01

組別C組R組H組F值P值Caspase3 1.000 ± 0.121*2.530 ± 0.354 1.935 ± 0.381*37.55＜ 0.001 TL1A 1.000 ± 0.189*11.814 ± 1.235 6.954 ± 1.234*171.2＜ 0.001 DR3 1.000 ± 0.107*1.410 ± 0.088 1.158 ± 0.092*27.83＜ 0.001

3 討論

心肌常發(fā)生缺血-再灌注損傷，包括心肌本身缺血-再灌注引起的損傷和其他器官或組織缺血-再灌注引起的損傷。心肌缺血-再灌注損傷機(jī)制復(fù)雜多樣，心肌細(xì)胞凋亡為主要原因之一［18-19］。本研究中，對小鼠心肌缺血-再灌注數(shù)據(jù)集進(jìn)行KEGG 通路富集，發(fā)現(xiàn)缺血-再灌注后心肌組織內(nèi)細(xì)胞凋亡通路和TNF通路被激活，表明心肌缺血-再灌注后心肌細(xì)胞會觸發(fā)由死亡受體通路調(diào)控的細(xì)胞凋亡［20］。有研究報道［21］，某些器官如腎等缺血-再灌注后可引起心肌細(xì)胞凋亡。雖然肢體缺血-再灌注后可引心肌損傷，但能否引起心肌細(xì)胞凋亡鮮有報道。

動物實驗研究表明，心肌缺血-再灌注發(fā)生的細(xì)胞凋亡率大約為20%～30%［22-23］。另有臨床研究表明［24］，急性心肌梗死血液再通后在梗死組織邊緣區(qū)可觀察到10%左右心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡。本實驗通過TUNEL 檢測發(fā)現(xiàn)，肢體缺血4 h 再灌注24 h 后心肌細(xì)胞發(fā)生了凋亡，凋亡率為（5.464 5 ± 0.654）%。表明，肢體缺血-再灌注可引起心肌細(xì)胞凋亡，但此凋亡屬繼發(fā)性，凋亡率低于心肌原發(fā)者。Caspase3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白之一［25］，激活后可裂解下游死亡底物，放大上游死亡級聯(lián)，最終引起染色質(zhì)凝結(jié)和DNA 斷裂，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［26-27］。本研究檢測了心肌組織內(nèi)Casapse3 蛋白和mRNA 相對表達(dá)，發(fā)現(xiàn)R組與C組比較，Casapse3表達(dá)均顯著升高（P＜ 0.01）。Casapse3 高表達(dá)進(jìn)一步表明了肢體缺血-再灌注后心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

氫氣已在包括心肌缺血-再灌注［28］在內(nèi)的許多系統(tǒng)疾病顯示出治療潛力，在眾多的治療機(jī)制中，抗細(xì)胞凋亡占有重要地位［29］。前期研究發(fā)現(xiàn)［14］，氫氣可抑制TRAIL 激活，從而抑制細(xì)胞凋亡。DR3作為TNF 家族的死亡受體，與配體TL1A［36］結(jié)合后會觸發(fā)由死亡受體通路調(diào)控的細(xì)胞凋亡［30］，且TL1A［31-32］和DR3除了膜結(jié)合的形式之外，也存在著可溶形式［33］。本實驗通過ELISA 檢測血清TL1A 和DR3 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)兩者表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01），表明當(dāng)肢體缺血4 h 再灌注24 h 后血清內(nèi)TL1A 和DR3 表達(dá)水平均上調(diào)。上調(diào)的TL1A 可與心肌細(xì)胞膜上的DR3 受體結(jié)合，觸發(fā)死亡受體途徑心肌細(xì)胞凋亡。而腹腔注射氫氣后，血清TL1A和DR3 的表達(dá)水平顯著下降（P＜ 0.01），甚至降至C組水平，提示氫氣能有效抑制TL1A和DR3釋放。

此外，本研究從蛋白和mRNA 水平檢測了心肌組織內(nèi)TL1A、DR3和Caspase3的相對表達(dá)水平。觀察到，與C組比較，R組TL1A、DR3和Caspase3表達(dá)水平均有顯著升高（P＜ 0.01），蛋白和mRNA 表達(dá)水平結(jié)果一致。此結(jié)果表明，心肌組織內(nèi)有TL1A和DR3的表達(dá)且肢體缺血-再灌注可引起心肌組織內(nèi)TL1A和DR3表達(dá)上調(diào)，上調(diào)的TL1A與DR3結(jié)合后可激活TL1A/DR3通路，上調(diào)Caspase3表達(dá)，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡。H 組與R 組比較，TL1A、DR3和Caspase3 在蛋白和mRNA 表達(dá)水平均顯著降低（P＜ 0.05）。此結(jié)果表明，氫氣可下調(diào)心肌組織內(nèi)TL1A 與DR3 的表達(dá)及抑制心肌細(xì)胞釋放TL1A，并競爭結(jié)合DR3 以阻斷TL1A/DR3 通路向下傳遞信息，降低Caspase3表達(dá)，從而減少細(xì)胞凋亡。

本研究是以TL1A/DR3 通路為切入點探討氫氣對肢體缺血-再灌注介導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響，表明氫氣可抑制TL1A/DR3 通路以減輕此凋亡。但有關(guān)氫氣作用于TL1A/DR3 的具體位點，不同氫氣劑量、濃度等對防治效果的影響等尚不明確。肢體缺血-再灌注繼發(fā)心肌細(xì)胞凋亡機(jī)理復(fù)雜，相互之間又有密切聯(lián)系，對其防治尚有大量的工作需要開展。今后將繼續(xù)加大、加深研究，以期為臨床提供更多有價值的資料。

【Author contributions】LI Lin and YIN Yue performed the experiments and wrote the article.WANG Chenchen revised the article.ZHUANG Baoxiang performed the experiments and analysed the data.WANG Daijun designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.