鄧凱 楊萌 張琳 錢俊安 史云強(qiáng) 王春暉，2

1昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院泌尿外科（昆明 650000）；2云南省腫瘤免疫防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（昆明 650000）

中性粒細(xì)胞在抵御微生物感染及創(chuàng)傷后的炎癥損傷過程中發(fā)揮重要作用［1-2］。但在腫瘤進(jìn)展過程中，腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞（tumor-associated neutrophils，TAN）被認(rèn)為是一個(gè)“旁觀者”或“中立派”。而近年來的研究表明TAN 并不是真正的“中立”，相反，TAN 可以通過多種途徑抑制或促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，這種雙向調(diào)控源于TAN 高度的異質(zhì)性和可塑性。因其可塑性，TAN 在發(fā)育、分化、募集的過程中被誘導(dǎo)極化為許多異質(zhì)性亞群，表現(xiàn)出不同的功能表型，即TAN 的可塑性和異質(zhì)性是其發(fā)揮雙向調(diào)控作用的基礎(chǔ)。通過操縱TAN 在腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）中的浸潤(rùn)水平或其功能表型，有望為目前的腫瘤治療帶來全新的靶點(diǎn)和思路，但由于其異質(zhì)性，在討論TAN 的抑瘤或促瘤作用時(shí)，須考慮到具體的腫瘤類型甚至是臨床分期的不同。

1 TAN 的異質(zhì)性和可塑性

TAN來源于骨髓，是人體內(nèi)數(shù)量最多的免疫細(xì)胞，具有壽命短和更新快的特點(diǎn)，造血干細(xì)胞逐步發(fā)育分化為粒細(xì)胞-單核細(xì)胞祖細(xì)胞（granulocytemonocyte progenitors，GMPs）后，在G-CSF及GM-CSF的誘導(dǎo)下，逐步分化成熟。

TAN 發(fā)育成熟后大部分仍繼續(xù)留在骨髓，其釋放受到嚴(yán)格的調(diào)控。趨化因子受體CXCR4 和CXCR2 及其配體決定了TAN 進(jìn)入血液循環(huán)的數(shù)量。其中，CXCR4與CXCL12促使TAN 繼續(xù)保留在骨髓，CXCR2、CXCL1、CXCL2 促使TAN 進(jìn)入血液循環(huán)當(dāng)中。G-CSF 通過誘導(dǎo)增加CXCL1、CXCL2或減少CXCL12、 CXCR4 的表達(dá)，促進(jìn)TAN 進(jìn)入循環(huán)，快速升高血液中粒細(xì)胞水平。腫瘤細(xì)胞也可分泌G-CSF，因此腫瘤患者循環(huán)中未成熟TAN 的比例較正常人明顯升高。TAN 與各組織的親和程度也不同，以上各種因素共同作用導(dǎo)致了TAN 在發(fā)育階段以及分布空間上的異質(zhì)性。

目前關(guān)于TAN 亞群的分型尚無特異性的標(biāo)記分子，常以TAN 亞群表現(xiàn)出的功能表型作為分型依據(jù)，將發(fā)揮抗腫瘤作用或炎性反應(yīng)的TAN 稱為N1 型，將發(fā)揮促腫瘤作用的TAN 稱為N2 型。也可以根據(jù)分布位置，分為外周血TAN 和腫瘤浸潤(rùn)性中性粒細(xì)胞（tumor infiltrating neutrophils，TIN）。根據(jù)發(fā)育程度的不同，可分為未成熟和成熟TAN［1-3］。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor-β，TGF-β）可以誘導(dǎo)TAN 向著N2 極化。經(jīng)TGF-β 誘導(dǎo)后的TAN 主要為N2 型，而阻斷TGF-β 后，TME內(nèi)CD8+T 細(xì)胞的數(shù)量和活性均增加，免疫治療的療效得到增強(qiáng)，TME 內(nèi)的TAN 極化方向由N2 轉(zhuǎn)向了N1。IFN-β 可以誘導(dǎo)TAN 想著N1 的方向分化，比如在缺乏IFN-β 時(shí)，小鼠肺部腫瘤中以N2 為主，細(xì)胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecule 1，ICAM1）和TNF-α 表達(dá)低，而經(jīng)過IFN-β 治療后TNF-α 及ICAM1 表達(dá)增加，T 細(xì)胞的活化增強(qiáng)，TAN 向著N1 極化，表現(xiàn)出抗腫瘤特性。

在同一類型腫瘤的不同分期中，TAN 的功能表型也可能存在不同，一般來說，在原發(fā)腫瘤早期，TAN 常常以N1 型為主，而隨著腫瘤的進(jìn)展，TME中的TAN 逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橐訬2 為主，一定程度上代表了腫瘤進(jìn)展的結(jié)果［4］。受限于傳統(tǒng)定義TAN 亞群的方法，光鏡下的細(xì)胞或細(xì)胞核形態(tài)差異并不能將異質(zhì)性TAN 亞群很好的區(qū)分開，對(duì)TAN 異質(zhì)性產(chǎn)生的原因更是知之甚少。雖然近年來有研究提出以組織學(xué)染色、電鏡分析以及分子表型等對(duì)TAN 進(jìn)行更加準(zhǔn)確合理的分型，但目前為止尚沒有任何一種方法能夠用來準(zhǔn)確鑒別TAN 的異質(zhì)性并解釋其產(chǎn)生原因。

2 TAN 的雙向調(diào)控

TAN 是TME 中存在的多種免疫細(xì)胞之一［5］，在腫瘤進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用，但其具體是促癌還是抑癌，在不同的研究中得出的結(jié)果并不相同：一些研究結(jié)果顯示TAN 具有抗腫瘤潛力［6-7］，但另一些研究卻顯示TAN 具有促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的特性。先前的研究發(fā)現(xiàn)，未成熟TAN 的異位出現(xiàn)可能是造成不同功能表型的原因，因?yàn)槊庖咭种菩訲AN 通常具有更不成熟的表型，有人甚至將免疫抑制表型的TAN 等同于未成熟TAN，TAN 的成熟與否成為標(biāo)記TAN 功能表型的重要依據(jù)。然而，并不是所有免疫異質(zhì)性TAN 都是未成熟的，而未成熟的TAN 也不一定就是免疫抑制性的，如血液中免疫抑制性TAN 同樣包括已經(jīng)發(fā)育成熟的細(xì)胞；CD1-CD66+的未成熟TAN 被證實(shí)可以活化T 細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤活性，而CD10+的成熟TAN 則具備相反的作用。也有人認(rèn)為是粒細(xì)胞內(nèi)獨(dú)特的顆粒組成引起了未成熟和成熟TAN 表型的差異。

2.1 抗腫瘤作用在胃癌、結(jié)直腸癌（Ⅲ期）和高級(jí)別卵巢癌的研究中，TAN 的浸潤(rùn)程度與較好的預(yù)后相關(guān)，提示TAN 可能具有抗腫瘤潛能，這種抗腫瘤作用通過直接或間接的多種途徑實(shí)現(xiàn)［2］。

TAN 可以通過自身接觸和細(xì)胞毒性作用直接殺傷腫瘤細(xì)胞［7］，這種殺傷作用與局部缺氧相關(guān)而與T 細(xì)胞無關(guān)，緩解缺氧后，TME 內(nèi)TAN 的募集減少，但有趣的是，在這種條件下募集的TAN 卻能夠更有效的殺傷腫瘤細(xì)胞［8］。G-CSF、趨化因子、脂多糖以及IFN-β 等多種刺激因素通過與TAN 細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體結(jié)合，以及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β 受體（TGFβR）信號(hào)傳導(dǎo)的阻斷，可以促進(jìn)H2O2的產(chǎn)生和釋放，導(dǎo)致瞬時(shí)受體電位陽(yáng)離子通道M 亞家族成員2（transient receptor potential melastatin 2，TRPM2）的激活和開放，促使Ca2+大量流入，引起腫瘤細(xì)胞死亡［9］。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）可通過作用于中性粒細(xì)胞上的HGF 受體（也稱為MET）促進(jìn)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，iNOS）的表達(dá)和NO 的釋放，對(duì)腫瘤細(xì)胞造成殺傷。TAN 還能通過抗體依賴的細(xì)胞毒性作用（antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC）殺傷腫瘤細(xì)胞［10］，并以機(jī)械性破壞的方式對(duì)腫瘤細(xì)胞膜進(jìn)行攝取，造成腫瘤細(xì)胞的崩解死亡，該過程涉及信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白-α（signal regulatory protein alpha，SIRPα）與CD47 的相互作用，表明靶向該通路具有潛在的治療應(yīng)用價(jià)值［2，6］。在一項(xiàng)宮頸腺癌小鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)，TAN 還能分泌一種能降解基底膜成分的廣譜蛋白酶，促使腫瘤細(xì)胞從基底膜脫落，發(fā)揮抑制腫瘤的作用（圖1A-C）。

除了直接殺傷腫瘤細(xì)胞外，TAN 分泌的趨化因子CXCL10、CCL2、CCL3、CXCL1 和 CXCL2，能夠募集T 細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞增強(qiáng)抗腫瘤免疫［11］（圖1D）。TAN 還可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌IL-12，促進(jìn)非常規(guī)T 細(xì)胞（CD4-CD8-TCRαβ+double-negative unconventional T cells，UTCαβ）向Ⅰ型免疫反應(yīng)的極化和IFN-γ 的產(chǎn)生［11］（圖1E）。TME 中存在的干擾素-γ（IFN-γ）和GM-CSF 能促進(jìn)TAN 成熟為抗原呈遞細(xì)胞（antigen presenting cell，APC），表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ類和Ⅱ類分子，刺激CD4+和CD8+T細(xì)胞的增殖和活化。有趣的是，有體外試驗(yàn)表明TAN 釋放的中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs）也可以引發(fā)和加強(qiáng)T 細(xì)胞的抗腫瘤免疫，但目前在癌癥患者的文獻(xiàn)報(bào)道中，NETs 均為促腫瘤作用，故NETs 在體內(nèi)是否具備抗腫瘤作用尚需進(jìn)一步的研究［1］。

圖1 TAN 的抗腫瘤作用Fig.1 Anti-tumor effects of TAN

2.2 促腫瘤作用在包括非小細(xì)胞肺癌、頭頸部腫瘤、黑色素瘤、肝細(xì)胞癌在內(nèi)的多種腫瘤活檢樣本中，TAN 的浸潤(rùn)程度與總生存率（overall survival，OS）呈負(fù)相關(guān)［12］，而術(shù)前較高的系統(tǒng)免疫炎癥指數(shù)和中性粒細(xì)胞淋巴細(xì)胞比值（neutrophils to lymphocytes ratio，NLR）與多種實(shí)體腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)［13-14］。大量體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了TAN 通過多種途徑促進(jìn)腫瘤進(jìn)展：

通過釋放ROS 造成肺上皮細(xì)胞DNA 損傷：這種損傷本身比較輕微，但在致癌物存在的情況下可以被顯著放大，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，即TAN 通過釋放ROS 提高了組織對(duì)致癌物質(zhì)的敏感性［15］。此外，人和小鼠腸黏膜中活化的TAN 可通過釋放促炎癥的RNA 微粒，促進(jìn)上皮細(xì)胞DNA 的雙鏈斷裂，造成基因組不穩(wěn)定性，組織愈合受損，促進(jìn)腫瘤發(fā)生［16］（圖2A）。

通過旁分泌信號(hào)通路刺激腫瘤細(xì)胞的增殖：在斑馬魚RAS 驅(qū)動(dòng)的腫瘤模型研究中，TAN 通過釋放前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）或彈性蛋白酶直接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。此外，白介素1受體拮抗劑（IL-1RA）可以對(duì)抗抑癌基因誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡，間接促進(jìn)腫瘤增殖（圖2B）。

通過抑制其他免疫細(xì)胞發(fā)揮促瘤作用［1］：TAN 除了通過ROS、iNOS 和精氨酸酶1（arginase 1，Arg1）等介質(zhì)實(shí)現(xiàn)對(duì)T 細(xì)胞的直接抑制外［1］，還可以通過 CCL17、CCL2 募集腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages，TAM）和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）重塑TME，抑制T 細(xì)胞的抗腫瘤免疫。

通過代謝途徑塑造抑制性TME：在乳腺癌模型中，腫瘤誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞能夠通過參與線粒體氧化代謝來維持ROS 的產(chǎn)生以抑制T 細(xì)胞［17］。另有研究發(fā)現(xiàn)TAN 在分化過程中發(fā)生了糖酵解向脂肪酸氧化的轉(zhuǎn)變，通過上調(diào)脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（fatty acid transporter protein 2，F(xiàn)ATP2），增加花生四烯酸（arachidonic acid，AA）的攝取和PGE2 的合成參與抑制性免疫微環(huán)境的形成。

通過表達(dá)免疫檢查點(diǎn)受體/配體來抑制其他免疫細(xì)胞：在人和小鼠肝癌模型及人類胃癌患者中，TAN 通過表達(dá)程序性細(xì)胞死亡蛋白配體1（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）抑制T 細(xì)胞的抗腫瘤反應(yīng)。而阻斷PD-1/PD-L1 后，T 細(xì)胞受到的免疫抑制減弱，浸潤(rùn)和活化得到加強(qiáng)［18］（圖2D）。

促進(jìn)腫瘤血管的生成：基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的激活、誘導(dǎo)、血管生成以及早期腫瘤生長(zhǎng)有關(guān)，主要由腫瘤內(nèi)TAN 和腫瘤周圍的巨噬細(xì)胞表達(dá)。CD11b+Gr1+TAN 表達(dá)的Bv8 蛋白上調(diào)可以促進(jìn)小鼠腫瘤的血管生長(zhǎng)，而抗Bv8 抗體可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)并抑制血管生成，提示TAN 可能在癌變?cè)缙谕ㄟ^MMP-9、Bv8 等促進(jìn)腫瘤組織血管生成（圖2C）。

NETs 是一種TAN 胞膜破裂后釋放的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，主要由松散的DNA 骨架構(gòu)成，其他成分還包括MMP9、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）、組織蛋白酶G（cathepsin G，CG）和髓系過氧化物酶（myeloid peroxidase，MPO）等［19］，NETs通過多種途徑促進(jìn)腫瘤進(jìn)展［20］（圖2B，D，E）。

圖2 TAN 的促腫瘤作用Fig.2 Pro-tumor effects of TAN

如前所述，TAN 通過不同的途徑在不同種類和臨床分期的腫瘤中發(fā)揮抗瘤或是促瘤的調(diào)控作用，針對(duì)這些可能的調(diào)控機(jī)制，目前已有多種藥物正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)［6］，如TGFβ 抑制劑用于促進(jìn)N1 型TAN 的發(fā)育，CXCR2 拮抗劑用于抑制TAN向腫瘤的募集，非甾體類藥物通過抑制COX2 抑制腫瘤細(xì)胞增殖并減輕前列腺素介導(dǎo)的免疫抑制等。即使如此，關(guān)于TAN 具體的抗腫瘤或促腫瘤作用機(jī)制目前仍不十分清楚，而鑒于TAN 亞群高度的異質(zhì)性，筆者認(rèn)為在具體的腫瘤類型中討論其調(diào)控作用可能更為合理。

3 TAN 在UBC 中的研究進(jìn)展

UBC 被認(rèn)為是一種高度免疫原性惡性腫瘤，包括非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌（non-muscle-invasive bladder cancer，NMIBC）和肌層浸潤(rùn)性膀胱癌（muscle-invasive bladder cancer，MIBC），TAN 的雙向調(diào)控作用在UBC 臨床診療中具有巨大潛力。

3.1 NLR 用于預(yù)測(cè)UBC 預(yù)后多項(xiàng)研究證實(shí)外周血NLR與UBC較差的臨床預(yù)后相關(guān)［21-22］，NLR值與腫瘤的分級(jí)、分期顯著相關(guān)，還與NMIBC 患者的高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。在一項(xiàng)回顧性分析中，899例UBC患者行根治性膀胱全切術(shù)而未行其他輔助治療，其中，術(shù)前較高的NLR 與患者病理分級(jí)、膀胱外腫瘤侵犯以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，術(shù)前NLR ≥ 2.7 的患者，10年腫瘤特異性生存率更低。因此，NLR 被認(rèn)為是預(yù)測(cè)膀胱癌患者預(yù)后、分層的重要指標(biāo)［22-23］。NLR 也被一些研究作為預(yù)測(cè)高危NMIBC 對(duì)BCG 治療反應(yīng)性的工具，可為高危NMIBC 患者提供個(gè)體化的治療方案［24］。需要指出的是，絕大多數(shù)研究中采用的NLR 指標(biāo)只能反映外周血中中性粒細(xì)胞的數(shù)量，并不能反映TME中真實(shí)的TAN浸潤(rùn)情況。

3.2 靶向TAN 與其他UBC 經(jīng)典治療的聯(lián)合對(duì)于高危NMIBC，經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)加BCG 膀胱內(nèi)灌注治療可以有效降低術(shù)后復(fù)發(fā)率以及腫瘤的進(jìn)展率。然而一些患者對(duì)BCG 治療并不敏感，而有研究認(rèn)為NLR 可以作為預(yù)測(cè)高危NMIBC 對(duì)BCG 治療反應(yīng)性的工具，并根據(jù)評(píng)估結(jié)果為NMIBC 患者提供最佳的治療方案［24］

大量研究表明TAN 與MIBC 患者較差的化療、放療反應(yīng)性以及較低的生存率相關(guān)，并且TAN 促進(jìn)腫瘤發(fā)生、進(jìn)展與轉(zhuǎn)移的功能也在一些腫瘤模型中得到驗(yàn)證，靶向TAN 并聯(lián)合經(jīng)典放、化療的療法顯示出一定潛在應(yīng)用價(jià)值。研究表明，UBC 腫瘤細(xì)胞可以通過對(duì)上調(diào)CXCL1、CXCL8，促進(jìn)TAN分泌VEGFA 和MMP9，促進(jìn)淋巴管的形成和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移［25］，提示靶向TAN 可能具有抑制UBC 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的潛力。然而有研究表明并不是所有的TAN 浸潤(rùn)水平升高都意味著更差的預(yù)后，有文獻(xiàn)報(bào)道在病理分期為pT2N0M0 時(shí)，CCR5+TAN 浸潤(rùn)水平與TNM 分期呈負(fù)相關(guān)，并且對(duì)輔助化療和ICIs 治療有更好的反應(yīng)性［26］。相較于管腔內(nèi)生型乳頭狀MIBC，基底型MIBC 顯示出明顯更高水平的趨化因子吸引中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，而二者不同的腫瘤免疫微環(huán)境也提示兩種類型的MIBC 可能受益于完全不同的治療方法［27］。

3.3 靶向于TAN 的腫瘤治療策略及困境基于目前的研究結(jié)果，靶向于TAN 的腫瘤治療策略大致分為兩類。首先是通過直接耗竭TAN 或抑制其在TME 中的募集，從而減少N2 亞群的促腫瘤作用，然而，考慮到嚴(yán)重甚至致命感染的明顯風(fēng)險(xiǎn)，全身性的中性粒細(xì)胞耗竭策略在臨床上是不現(xiàn)實(shí)的。其次是通過各種辦法干預(yù)體內(nèi)TAN 的功能表型，減少N2 亞群的同時(shí)增加N1 亞群，其中最常用的方法是阻斷TGF-β 或以IFN-β、高劑量的G-CSF誘導(dǎo)，促進(jìn)TAN 的抗腫瘤潛能，但目前對(duì)于TAN亞型的極化機(jī)制知之甚少，甚至連誘導(dǎo)后的TAN亞群也無法做到精確的標(biāo)識(shí)和鑒別，盡管如此，TAN 亞群的極化和重塑仍被認(rèn)為是重要的和潛力巨大的腫瘤治療策略。也有人提出從外周血提取抗瘤的N1 后再進(jìn)行外源性輸注的技術(shù)，然而，這些針對(duì)TAN 的全身性操作可能會(huì)引起嚴(yán)重的不良事件，如急性肺損傷［6］，并且由于TAN 本身壽命較短，無法長(zhǎng)期保持功能狀態(tài)，需要多次、大量輸注粒細(xì)胞，存在嚴(yán)重不良反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)等缺點(diǎn)，該技術(shù)的臨床應(yīng)用仍存在爭(zhēng)議。

雖然大量研究顯示出TAN 雙向調(diào)控在腫瘤治療中的臨床應(yīng)用潛力，但鑒于目前的研究結(jié)果大部分來源于體外試驗(yàn)或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，這些結(jié)論在人體內(nèi)是否也同樣成立尚不得而知，筆者認(rèn)為，靶向TAN 的腫瘤治療策略要取得進(jìn)一步的突破，依賴于對(duì)TAN 亞群更深入的研究和更精準(zhǔn)的分型，并以此為前提揭示TAN 不同的亞群募集和極化過程中的確切重塑機(jī)制。此外，還需要構(gòu)建更加接近于臨床的研究模型，在已有研究成果的基礎(chǔ)上進(jìn)一步討論TAN 在復(fù)雜環(huán)境下對(duì)腫瘤的調(diào)控作用。

4 總結(jié)

綜上所述，TAN 因其可塑性和復(fù)雜的發(fā)育分化過程，在不同腫瘤或組織形成具有明顯功能表型差異的異質(zhì)性亞群，這些亞群表現(xiàn)出抗瘤和促瘤的雙向調(diào)控作用，深刻影響著腫瘤發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過程。目前的研究顯示出TAN 應(yīng)用潛力的同時(shí)面臨較多未知和挑戰(zhàn)，進(jìn)一步揭示TAN 亞群分型和極化的機(jī)制是下一步研究的關(guān)鍵，有望為新一代腫瘤治療提供新的靶點(diǎn)。

【Author contributions】DENG Kai wrote and revised the article.YANG Meng ，ZHANG Ling，QIAN Jun'an，SHI Yun-qiang revised the article.WANG Chunhui reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.