楊煥煥 袁詩雨 唐映梅

昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院胃腸科（昆明 650101）

原發(fā)性膽汁性膽管炎（primary biliary cholangitis，PBC）是一種慢性自身免疫性肝病。全球患病率升高，以中國在內(nèi)的亞太地區(qū)患病率升高尤為突出。未經(jīng)有效治療，PBC 可最終進(jìn)展至肝硬化、肝衰竭，將嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量［1-2］。熊去氧膽酸（ursodeoxycholic acid，UDCA）是PBC 治療的首選藥物，但約25%～50%的患者應(yīng)答不佳。奧貝膽酸是PBC 治療的二線用藥，主要用于對(duì)UDCA 應(yīng)答不佳的患者，但因其可加重患者瘙癢等癥狀限制了臨床應(yīng)用。肝移植是PBC 相關(guān)終末期肝病患者唯一根治性治療方法，但受供體來源的限制，肝移植成為PBC 治療的一個(gè)重要挑戰(zhàn)［3-4］。BEC 占肝臟細(xì)胞總數(shù)的5%，是PBC時(shí)免疫破壞的主要靶目標(biāo)。BEC 在多種刺激條件下被激活通過增殖以彌補(bǔ)損傷的BEC。但隨著疾病的進(jìn)展，BEC 凋亡逐漸增多，細(xì)胞增殖能力減弱，最終導(dǎo)致膽管的進(jìn)行性缺失［5］。與健康人相比，PBC 患者BEC 中DNA 碎片增多，且PBC 患者BEC 中的Fas、FasL、TRAIL、顆粒酶B、穿孔蛋白表達(dá)水平顯著升高。同時(shí)，PBC時(shí)BEC 中凋亡相關(guān)基因WAF1 和P53 表達(dá)亦明顯上調(diào)，提示PBC時(shí)BEC凋亡增加［6］。諸多因素如自身抗原的暴露、異常免疫反應(yīng)、膽汁淤積、腸道菌群的改變及氧化應(yīng)激等因素均會(huì)導(dǎo)致BEC 凋亡，而BEC 凋亡又會(huì)促進(jìn)上述因素的形成，繼而形成惡性循環(huán)，推動(dòng)PBC 不斷的進(jìn)展。BEC 凋亡在PBC 疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，深入探究影響B(tài)EC 凋亡的因素及相關(guān)機(jī)制，可為開發(fā)新的PBC 治療靶點(diǎn)提供新思路，從而使更多的PBC 患者受益。

1 PBC 時(shí)線粒體自身抗原暴露促進(jìn)BEC凋亡的發(fā)生

PBC 時(shí)機(jī)體免疫異常打破對(duì)自身抗原的免疫耐受，造成肝內(nèi)中、小膽管的靶向損傷，導(dǎo)致膽管缺失和膽汁淤積［7］。因?yàn)锽EC 缺乏谷胱甘肽的修飾，BEC 在凋亡過程中PDC-E2 可保持免疫原性并可進(jìn)入凋亡小體，隨后被循環(huán)中的抗線粒體抗體（AMA）識(shí)別，并形成抗原抗體復(fù)合物，進(jìn)一步激活免疫反應(yīng)和導(dǎo)致BEC 凋亡［5］。同時(shí)，脫落的凋亡小體形成新生抗原刺激炎癥細(xì)胞釋放炎癥細(xì)胞因子，加重局部炎癥狀態(tài)，由此引起更多的BEC 凋亡［6］。免疫細(xì)胞的攻擊也會(huì)導(dǎo)致BEC 自身抗原的暴露，例如在NK/BEC 的比值升高的情況下，NK 細(xì)胞攻擊BEC 并釋放自身抗原成分激活自身反應(yīng)性T 淋巴細(xì)胞而導(dǎo)致BEC 損傷［8］。凋亡細(xì)胞通常會(huì)被專業(yè)吞噬細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞）和鄰近非專業(yè)吞噬細(xì)胞（如上皮細(xì)胞等）吞噬，隨后吞噬體和溶酶體融合降解凋亡細(xì)胞。但PBC 時(shí)一方面巨噬細(xì)胞存在胞葬功能障礙，這導(dǎo)致凋亡細(xì)胞不能被巨噬細(xì)胞及時(shí)有效清除，致使凋亡細(xì)胞不斷積累和自身抗原的持續(xù)性暴露，繼而引發(fā)廣泛的自身免疫反應(yīng)，促進(jìn)BEC 凋亡；另一方面，PBC時(shí)鄰近的正常BEC 吞噬凋亡BEC 的同時(shí)會(huì)攝入凋亡BEC 中的自身反應(yīng)蛋白等成分，從而提供自身抗原的持久性來源，使BEC 不斷受到免疫攻擊和損傷［9-10］。線粒體自身抗原的暴露是BEC 凋亡的促進(jìn)因素，而通過促進(jìn)BEC 谷胱甘肽的修飾，改善巨噬細(xì)胞的胞葬功能等來抑制自身抗原的暴露可能是PBC 的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)。

2 PBC 時(shí)異常免疫反應(yīng)在BEC 凋亡中具有重要作用

PBC 的主要病理基礎(chǔ)是T 淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為主，其他多種天然免疫細(xì)胞參與的肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的免疫破壞［11］。BEC 表達(dá)多種Toll 樣受體（Tolllike receptors，TLR），微生物及代謝產(chǎn)物等與之結(jié)合激活TLR 促進(jìn)BEC 分泌 CX3CL1、IL-6、TNFα 等趨化因子和細(xì)胞因子，后者可招募多種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)至門靜脈和BEC 周圍［12］，這些免疫細(xì)胞通過不同作用機(jī)制促進(jìn)BEC 凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致膽管進(jìn)行性減少和膽汁淤積等，最終導(dǎo)致PBC 不可逆性進(jìn)展。

2.1 CD4+T 淋巴細(xì)胞和CD8+T 淋巴細(xì)胞T 淋巴細(xì)胞是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，PBC 患者門靜脈有大量CD4+T 和CD8+T 淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。CD4+T 淋巴細(xì)胞除了可以通過直接分泌IL-6，12，17，21 和IFN-γ 等細(xì)胞因子促進(jìn)細(xì)胞損傷，還可以通過增強(qiáng)和維持CD8+T 淋巴細(xì)胞反應(yīng)和刺激B 淋巴細(xì)胞分化為漿細(xì)胞產(chǎn)生抗體從而促進(jìn)BEC 凋亡的發(fā)生。與CD4+T 細(xì)胞相比，CD8+T 細(xì)胞對(duì)BEC 具有更直接的殺傷作用，主要通過表達(dá)FasL 與BEC表達(dá)上調(diào)的Fas 受體結(jié)合及釋放穿孔素和顆粒酶兩種方式誘導(dǎo)BEC 凋亡。其次，CD8+T 細(xì)胞還可以通過表達(dá)KLRG1和分泌IFN-γ促進(jìn)BEC損傷［8，13］。

2.2 Th1、Th17、Treg 和Tfh 細(xì)胞CD4+T 淋巴細(xì)胞在不同細(xì)胞因子的刺激下可分化為Th1 和Th17細(xì)胞，可分別通過產(chǎn)生IFN-γ 和IL-17 誘導(dǎo)BEC 凋亡。PBC 患者外周血中Treg 細(xì)胞的數(shù)量顯著減少，同時(shí)單核細(xì)胞浸潤(rùn)增加，血清AMA 抗體增加，Treg 細(xì)胞的數(shù)量減少和功能異?？赡軐?dǎo)致自身反應(yīng)性T 細(xì)胞不受控制激活，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，進(jìn)一步加重BEC 凋亡和損傷。此外，PBC 患者循環(huán)中的濾泡輔助性T（Tfh）細(xì)胞增多，在受到抗原等刺激后IL-21 生成增多，繼而促進(jìn)自身反應(yīng)性B 淋巴細(xì)胞分化為漿細(xì)胞并產(chǎn)生AMA 抗體。表明Tfh 細(xì)胞通過參與AMA 的產(chǎn)生間接介導(dǎo)PBC患者BEC 凋亡和損傷［13］。

2.3 B 淋巴細(xì)胞B 淋巴細(xì)胞在PBC 的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用。首先BEC損傷后暴露的PDC-E2激活B 淋巴細(xì)胞后通過分泌IL-6、IFN-γ 和TNF-α等細(xì)胞因子促進(jìn)Th1、Th17 細(xì)胞增殖與分化可以啟動(dòng)對(duì)BEC 的損傷反應(yīng)［14］；其次，B 細(xì)胞通過分化成漿細(xì)胞產(chǎn)生抗體形式參與BEC 的凋亡。漿細(xì)胞分泌產(chǎn)生的AMA 與凋亡小體中的PDC-E2 形成抗原抗體復(fù)合物反過來又可以激活多種免疫細(xì)胞，吸引免疫攻擊繼而導(dǎo)致BEC 損傷；此外，漿細(xì)胞還可分泌IgA 抗體并通過pIgR 介導(dǎo)進(jìn)入膽管上皮細(xì)胞并通過激活caspase 途徑促進(jìn)BEC 凋亡［11，13］。

2.4 巨噬細(xì)胞巨噬細(xì)胞是PBC 發(fā)病中重要的先天性免疫細(xì)胞，其對(duì)BEC 的促凋亡作用主要表現(xiàn)在以下3 個(gè)方面：（1）在AMA 存在的情況下，巨噬細(xì)胞和凋亡的BEC 共培養(yǎng)時(shí)TRAIL 產(chǎn)生顯著增加，與BEC 中表達(dá)上調(diào)的DR5 受體結(jié)合促進(jìn)BEC大量凋亡；（2）抗原抗體抗復(fù)合物等刺激使巨噬細(xì)胞中的炎癥小體NOD 樣受體蛋白-3 激活繼而促進(jìn)IL-18、IL-1β 等炎癥因子的釋放，從而導(dǎo)致周圍BEC 凋亡增加［15-16］；（3）PBC 時(shí)浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞表達(dá)CD40L，與BEC 上的CD40 結(jié)合后可通過激活NF-KB 和AP-1 途徑增加BEC 中FasL 的表達(dá)間接促進(jìn)了BEC 凋亡［17］。

2.5 NK 和NKT 細(xì)胞自然殺傷（natural killer ，NK）細(xì)胞主要在PBC 患者的門脈區(qū)富集，IFN-a 和TLR4 配體是NK 細(xì)胞的重要刺激物，可以驅(qū)動(dòng)NK細(xì)胞激活通過分泌IFN-γ 和穿孔素有效殺死BEC。除了直接殺傷BEC 外，NK 細(xì)胞還能在APC 存在的情況下激活自身反應(yīng)性CD4+T 細(xì)胞進(jìn)而促進(jìn)BEC凋亡和疾病進(jìn)展［8，13］。自然殺傷T（natural killer T，NKT）細(xì)胞在接受BEC 呈遞的脂質(zhì)抗原刺激后分泌IFN-γ 并通過FasL 介導(dǎo)BEC 凋亡［18］。

綜上所述，在不同刺激因素下先天性和適應(yīng)性免疫細(xì)胞可以單獨(dú)或通過相互作用的方式共同誘導(dǎo)PBC 時(shí)BEC 凋亡的發(fā)生?；诿庖呓閷?dǎo)的發(fā)病機(jī)制，目前已提出幾種關(guān)于PBC 免疫治療策略，如甲氨蝶呤等免疫抑制劑；針對(duì)免疫細(xì)胞或細(xì)胞因子的靶向藥物，如B 細(xì)胞靶向療法和抗CD20 單克隆抗體-利妥昔單抗等，但上述免疫治療效果有限。PBC 是一種自身免疫性肝病，多種免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子均參與了PBC 的發(fā)病，因而單獨(dú)的一種免疫治療方法可能達(dá)不到較好的臨床效果，故繼續(xù)深入研究PBC 時(shí)各種免疫細(xì)胞在PBC 中的作用及機(jī)制，開發(fā)聯(lián)合免疫治療可能成為未來PBC治療的一種新的治療方案。

3 PBC 時(shí)膽汁酸代謝異常加重BEC 凋亡

PBC 時(shí)BEC 凋亡增加進(jìn)而導(dǎo)致膽管進(jìn)行性缺失和膽汁淤積。膽汁淤積時(shí)疏水性膽汁酸的增加又可對(duì)細(xì)胞造成毒性損害，其誘導(dǎo)BEC 凋亡與胞質(zhì)內(nèi)游離鈣離子的增加、JNK 激活、ROS 生成增強(qiáng)以及Bax 介導(dǎo)的線粒體外膜通透性增加導(dǎo)致細(xì)胞色素C 釋放相關(guān)［19］。陰離子交換蛋白2（anion exchanger protein2，AE2）與膽汁酸的代謝密切相關(guān)。AE2 和Ⅲ型肌醇三磷酸受體（InsP3R3）位于BEC的頂膜中，可促進(jìn)碳酸氫鹽的分泌使管腔呈堿性進(jìn)而防止疏水性膽汁酸進(jìn)入BEC 并誘導(dǎo)細(xì)胞毒性。PBC 時(shí)，膽管上皮細(xì)胞中的AE2 和InsP3R3 表達(dá)降低，一方面使碳酸氫鹽在BEC 中積累，激活可溶性腺苷酸環(huán)化酶（sAC）—碳酸氫鹽的傳感器，活化的sAC 通過Bax 的磷酸化、細(xì)胞色素C 的釋放和Caspase-3 途徑參與膽汁酸誘導(dǎo)的BEC 凋亡。另一方面，由于碳酸氫鹽的分泌不足，無法與膽汁酸充分結(jié)合并形成去質(zhì)子化的膽汁酸鹽，從而使毒性膽汁酸進(jìn)入BEC 并導(dǎo)致其凋亡。miRNA-506 在BEC 中過表達(dá)可抑制AE2 和InsP3R3 的活性，導(dǎo)致PDC-E2 過表達(dá)和線粒體功能障礙、促進(jìn)氧化應(yīng)激和膽汁酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［11，19-21］。熊去氧膽酸是PBC 治療的是首選藥物，其可通過上調(diào)BEC 中AE2 的表達(dá)，促進(jìn)碳酸氫鹽的分泌，減少疏水性膽汁酸對(duì)BEC 的損傷和抑制免疫反應(yīng)及Bax 的易位維持線粒體膜的穩(wěn)定性等減少BEC 凋亡，但部分患者對(duì)其應(yīng)答不佳。奧貝膽酸及其他藥物雖然也可通過改善膽汁淤積抑制BEC 凋亡及延緩PBC 的進(jìn)展，但因其副作用限制了其臨床應(yīng)用。miRNA-506、AE2 通過影響膽汁酸代謝在PBC 的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用，靶向miRNA-506、AE2 等的藥物研發(fā)可能為PBC 的治療帶來新希望。

4 PBC 時(shí)腸道菌群的異常改變與BEC 凋亡有關(guān)

研究證實(shí)腸道菌群的改變與PBC 疾病密切相關(guān)，并可加重BEC 凋亡的發(fā)生。肝臟通過腸肝軸與腸道緊密相連，失衡的腸道菌群通過此軸可引起一系列的肝臟病理反應(yīng)。PBC 患者中腸道菌群多樣性發(fā)生改變，乳酸桿菌等有益菌減少，變形菌、腸桿菌等致病菌增加。微生物和宿主抗原之間的分子模擬可能增強(qiáng)易感個(gè)體的自身免疫反應(yīng)。人與大腸桿菌、支原體等微生物的PDC-E2 成分十分相似，可通過分子模擬機(jī)制導(dǎo)致對(duì)自身抗原免疫耐受性的打破，誘發(fā)自身免疫反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致BEC 損傷［22-24］。腸道菌群的異位可使巨噬細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞上的TLR 表達(dá)上調(diào)，其激活后可釋放TNF-α、CCL4 等炎癥細(xì)胞因子和趨化因子，進(jìn)而通過炎癥反應(yīng)和吸引免疫攻擊繼而導(dǎo)致BEC凋亡、肝內(nèi)膽管缺失和膽汁淤積。膽汁淤積反過來又會(huì)導(dǎo)致腸道菌群的改變，形成惡性循環(huán)，使更多的BEC 發(fā)生凋亡。此外，腸道菌群及代謝產(chǎn)物還會(huì)通過促進(jìn)活性氧的產(chǎn)生、增加氧化應(yīng)激等方式促進(jìn)BEC 凋亡［25-27］。多數(shù)PBC 患者有腸道菌群的改變，腸道菌群的失衡與PBC 的發(fā)病及其預(yù)后均相關(guān)，其可作為PBC 患者診斷的生化標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)。

5 PBC 時(shí)氧化應(yīng)激參與BEC 凋亡

氧化應(yīng)激是指氧化和抗氧化防御之間的不平衡導(dǎo)致的細(xì)胞生物學(xué)功能損害。PBC 患者血清中氧化應(yīng)激的生化標(biāo)志物增多，而超氧化物歧化酶、谷胱甘肽S 轉(zhuǎn)移酶等抗氧化分子水平則顯著下降［28-29］。PBC 時(shí)IFN-β、TNF-α 等促炎細(xì)胞因子可以誘導(dǎo)BEC 活性氧的產(chǎn)生，并通過ATM/p53/p21WAF1/Cip1 通路導(dǎo)致細(xì)胞周期阻，BEC 凋亡增加而再生受損，最終導(dǎo)致肝內(nèi)中小膽管的進(jìn)行性減少。同時(shí)，炎癥細(xì)胞因子誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激增加了BEC 對(duì)化學(xué)誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的敏感性，這與抗氧化酶的抑制密切相關(guān)［30-31］。PBC 時(shí)氧化應(yīng)激通常伴有谷胱甘肽的降低，通過增加caspase-3 的活性、降低bcl-2 在BEC 上的表達(dá)和誘導(dǎo)P53 及p-JNK 的表達(dá)等促進(jìn)BEC 凋亡，谷胱甘肽抑制劑處理增強(qiáng)了BEC 對(duì)氧化劑誘導(dǎo)凋亡的敏感性，說明谷胱甘肽的耗竭在BEC 凋亡中具有重要作用［16］。谷胱甘肽的降低一方面可增強(qiáng)氧化應(yīng)激對(duì)BEC的損傷作用，另一方面降低的谷胱甘肽使PDC-E2的修飾異常而使其保持免疫完整性，繼而觸發(fā)自身免疫反應(yīng)而導(dǎo)致BEC 損傷。氧化應(yīng)激還可使線粒體能量代謝障礙及線粒體膜通透性增加、細(xì)胞色素C釋放增加，繼而導(dǎo)致BEC凋亡。抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少活性氧等的產(chǎn)生，增加外源性谷胱甘肽，可抑制PBC 時(shí)BEC 的損傷，進(jìn)而延緩疾病的進(jìn)展。

6 PBC 時(shí)影響B(tài)EC 凋亡的其他因素及相關(guān)機(jī)制

女性優(yōu)勢(shì)是PBC 疾病的另一特征，好發(fā)年齡為40～60 歲，隨著年齡的增加，體內(nèi)雌激素水平逐漸下降。雌激素可保護(hù)線粒體功能，其缺乏可上調(diào)雌激素相關(guān)受體γ（estrogen-related receptorγ，ERRγ）的表達(dá)并通過增加BEC 中Bcl-2 家族中的促凋亡分子進(jìn)而增加BEC 凋亡的易感性。在培養(yǎng)人的BEC 中，雌激素相關(guān)受體α（estrogen-related receptor α，ERRα）被過氧化物酶體增殖物激活受體γ 共激活因子-1α（peroxisome proliferator-activated receptorγ coactivator-1α，PGC-1α）激活，PGC-1α-ERRα 軸誘導(dǎo)脂肪酸氧化產(chǎn)生活性氧促進(jìn)細(xì)胞凋亡［32-33］。Galectin-3（一種半乳糖凝集素）和B7-H4分子在BEC 中表達(dá)上調(diào)，可分別通過抑制CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、IgA 抗體的產(chǎn)生和FasL 的產(chǎn)生抑制BEC 凋亡。上述表明Gal-3 和B7-H4 分子是BEC 凋亡的保護(hù)性因素。此外，PBC 時(shí)BEC 中P53、WAF1 和Bcl-2 家族中的促凋亡蛋白分子表達(dá)上調(diào)，則可通過影響細(xì)胞周期和線粒體功能促進(jìn)BEC 凋亡［6，34-35］。影響B(tài)EC 凋亡的因素很多，促凋亡和抗凋亡因素的失衡是BEC 凋亡和PBC 疾病進(jìn)展重要原因，也是PBC 治療的關(guān)鍵所在。

7 總結(jié)與展望

PBC 是一種以中年女性發(fā)病為主的自身免疫性肝病，肝內(nèi)中、小膽管的損傷和膽汁淤積為其主要特點(diǎn)。熊去氧膽酸和奧貝膽酸分別是PBC治療的一線和二線用藥，但有相當(dāng)一部分患者由于對(duì)上述藥物應(yīng)答不佳或因嚴(yán)重副作用而得不到有效治療，最終進(jìn)展至終末期肝病。受供體來源的限制，肝移植成為PBC 相關(guān)終末期肝病治療的重要挑戰(zhàn)。目前PBC 發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，但越來越多的證據(jù)表明BEC凋亡在PBC的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。線粒體自身抗原的暴露、異常免疫反應(yīng)、毒性膽汁酸、腸道菌群的改變及氧化應(yīng)激等因素通過不同的作用機(jī)制促進(jìn)PBC時(shí)BEC凋亡的發(fā)生。進(jìn)一步深入探索及研究PBC 時(shí)影響B(tài)EC 凋亡的因素及相關(guān)機(jī)制可為未來PBC 開發(fā)新的治療靶點(diǎn)或新的治療方案提出提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，這將使更多的PBC 患者受益。

【Author contributions】YANG Huanhuan was responsible for writing the article，YUAN Shiyu was responsible for collecting and organizing the literature，and TANG Yingmei was responsible for revising the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.