許葉 周暢 李建紅 趙振強(qiáng) 王埮 陳志斌

(1海南醫(yī)學(xué)院,海南 海口 570102;2海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科;3海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院)

帕金森病(PD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病,其主要的病理解剖特點(diǎn)為中腦黑質(zhì)致密部(SNc)多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性大量死亡,投射到紋狀體的多巴胺能神經(jīng)纖維減少而致紋狀體多巴胺含量顯著下降,從而出現(xiàn)一系列運(yùn)動(dòng)癥狀和非運(yùn)動(dòng)癥狀,嚴(yán)重影響患者的正常工作和日常生活。 到目前為止,左旋多巴(L-DOPA)仍然是治療PD最有效的藥物。然而在L-DOPA治療5年后,80%以上PD患者出現(xiàn)療效減退,并且發(fā)生難以控制的運(yùn)動(dòng)并發(fā)癥——L-DOPA誘發(fā)異動(dòng)癥(LID)〔1,2〕。LID一旦出現(xiàn)就會(huì)長(zhǎng)期保持,不僅阻礙了L-DOPA對(duì)PD的進(jìn)一步治療,而且患者為了改善癥狀需要接受侵入性和風(fēng)險(xiǎn)程度更高的治療,如深部腦電刺激術(shù)等。因此闡明LID的發(fā)病機(jī)制,并尋找有效的干預(yù)措施對(duì)于PD的治療至關(guān)重要。研究表明紋狀體區(qū)神經(jīng)元異常放電是導(dǎo)致患者出現(xiàn)LID的重要原因之一。在LID模型中直接通路中間多棘神經(jīng)元(MSNs)內(nèi)的哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路被持續(xù)激活;阻斷mTOR的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能明顯減輕LID而不影響L-DOPA對(duì)PD的治療作用〔3～5〕,提示mTOR信號(hào)的激活可能是導(dǎo)致LID紋狀體神經(jīng)元異常發(fā)電的機(jī)制之一,并可能成為治療LID的新靶標(biāo)。因此,本文對(duì)雷帕霉素抑制LID大鼠模型紋狀體神經(jīng)元電活動(dòng)展開研究。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)Sprague-Daewley大鼠,雄性,體質(zhì)量(200±20)g,開熄燈各12 h,溫度控制在20～25 ℃,濕度控制在40%～60%,自由進(jìn)食進(jìn)水,試驗(yàn)前先適應(yīng)性訓(xùn)練3～4 d。飼養(yǎng)過程嚴(yán)格按照華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心管理?xiàng)l例執(zhí)行。

1.2試劑和設(shè)備 6-羥多巴(OHDA)、左旋多巴甲酯、鹽酸芐絲肼、雷帕霉素、二甲基亞砜(DMSO)、維生素C粉劑(美國(guó)sigma公司),阿撲嗎啡(美國(guó)Cayman公司),紅霉素軟膏(馬應(yīng)龍藥業(yè)集團(tuán)有限公司),Tween-20(Beyotime公司),聚乙二醇400散劑(汕頭市迅能貿(mào)易有限公司)。桌面數(shù)顯腦立體定位儀、微型手持式顱鉆、通用夾持器(深圳市瑞沃德生命科技有限公司);多通道電路板、多通道電極基座、鎳鉻合金絲、金屬焊接絲、數(shù)據(jù)采集處理器、USB Data Cables、16通道輸入輸出端口擴(kuò)充組件及線纜、電極連接適配器(江蘇易格生物科技公司);AB膠(得力集團(tuán)有限公司);NeuroStudio 128通道、解旋器轉(zhuǎn)接套裝、Headstage(Bio-Signal Technologies);DELL 雙屏臺(tái)式電腦(戴爾股份有限公司);Offline Store軟件;NeuroExplorer軟件。

1.3實(shí)驗(yàn)分組及模型制備 本實(shí)驗(yàn)采用序貫的模式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組。首先所有大鼠參照參考文獻(xiàn)〔6〕使用6-0HDA腦立體定位微量注射制成PD模型。以7%水合氯醛麻醉。麻醉后給予6-0HDA(2 μg/μl)(鉆顱坐標(biāo):AP:4.2;ML:1.5 mm;DV:-7.8 mm)注入一側(cè)SNc。在明確PD造模成功后進(jìn)一步連續(xù)21 d腹腔注射L-DOPA+芐絲肼制作LID模型。隨后所有LID模型大鼠隨機(jī)分成2組,其中實(shí)驗(yàn)組連續(xù)腹腔注射L-DOPA+雷帕霉素21 d, 1次/d;對(duì)照模型(假手術(shù)組):在LID模型基礎(chǔ)上,連續(xù)腹腔注射L-DOPA+DMSO 共21 d,1次/d。所有建模成功大鼠在7%水合氯醛0.5 ml/100 g腹腔麻醉下通過腦立體定位儀植入多通道電極陣列。觀察到的信號(hào)是電極尖端所在位置的平均胞外場(chǎng)電位(mEFP)〔7〕。

1.4行為學(xué)實(shí)驗(yàn)及LID評(píng)分 術(shù)后第14天,頭頸部皮下注射阿撲嗎啡(0.05 mg/kg)誘導(dǎo)大鼠向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn),5 min后開始觀察,每5 min記錄一次,持續(xù)記錄30 min。記錄結(jié)果平均>7 r/min或>210 r/30 min為達(dá)標(biāo)PD模型。各組均進(jìn)行異常不自主運(yùn)動(dòng)(AIM)評(píng)分〔8〕。雷帕霉素組和對(duì)照組給藥后20 min進(jìn)行評(píng)定,20 min/次,共6次,計(jì)算120 min內(nèi)總分?jǐn)?shù)。理想狀態(tài)下用藥后每個(gè)評(píng)分時(shí)間點(diǎn)滿分為16分,累計(jì)總分為96分。

1.5腦立體定位法多通道電極植入 實(shí)驗(yàn)中采用自制16通道電極,參照參考文獻(xiàn)〔9〕進(jìn)行制作。電極絲為0.001 3英尺鎳鉻合金絲,排列固定在電路板上,參考電極絲與其余電極絲之間間隔500 μm,其余電極絲間距為350～400 μm。電路板固定在電極基座上。制作完電極后進(jìn)行手術(shù)埋置多通道電極陣列。Sprague-Daewley大鼠以7%水合氯醛0.5 ml/100 g行腹腔麻醉,固定于腦立體定位儀上,常規(guī)頭顱手術(shù)消毒備皮后,以前囟為原點(diǎn)確定坐標(biāo),前后囟相差不超過2 mm,按照Paxinos&Watson大鼠解剖圖譜以右側(cè)紋狀體為靶區(qū),手持顱鉆在對(duì)應(yīng)的坐標(biāo)上鉆孔(鉆顱坐標(biāo):AP:-1.5 mm;ML:0.1 mm;DV:-3.8 mm)。去除骨瓣及硬腦膜后將電極緩慢下放至大鼠紋狀體區(qū)。手術(shù)結(jié)束后大鼠放回籠中休養(yǎng)恢復(fù)1 w后再進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.6紋狀體神經(jīng)元放電活動(dòng)的記錄、整理和分析 連接headstage與大鼠頭部的電極排母,調(diào)試Neurostudio多通道數(shù)據(jù)采集系統(tǒng),設(shè)置濾波參數(shù)和閾值線:低頻場(chǎng)電位為200 Hz以下,采樣頻率為2 ks/s;高頻動(dòng)作電位為300 Hz以上;閾值線為-65 mV。設(shè)置完后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行保存記錄。記錄完畢后,數(shù)據(jù)輸入OfflineSorter軟件,分離提取鋒電位和局部場(chǎng)電位(LFPs),Neuroexplorer分析導(dǎo)出LFPs,Matlab功率譜密度和時(shí)頻分析。

1.7電生理 本實(shí)驗(yàn)中紋狀體成功植入多通道電極大鼠共10只,其中假手術(shù)組4只,記錄30個(gè)神經(jīng)元;實(shí)驗(yàn)組6只,PD狀態(tài)采集神經(jīng)元72個(gè),LID狀態(tài)神經(jīng)元45個(gè)。雷帕霉素干預(yù)1 w后神經(jīng)元39個(gè),雷帕霉素干預(yù)2 w后神經(jīng)元78個(gè)。植入電極成功的大鼠分成假手術(shù)組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組根據(jù)大鼠所處實(shí)驗(yàn)狀態(tài)不同分為PD組、LID組、雷帕霉素1 w組、雷帕霉素2 w組,用以觀察PD、LID大鼠紋狀體神經(jīng)元的放電情況及雷帕霉素使用時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)于紋狀體神經(jīng)元異常放電的影響。

1.8電極位點(diǎn)損毀及鑒定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后予7%水合氯醛腹腔麻醉大鼠,連接電流器,對(duì)電極排母孔逐一通電損毀,將電極損毀后的大鼠固定在解剖臺(tái)上先后使用生理鹽水100～150 ml及200 ml 4%多聚甲醛進(jìn)行心臟灌注。停止灌流后,斷頭取全腦,4%多聚甲醛浸泡2 h,30%的蔗糖4 ℃過夜,待組織沉降后進(jìn)行紋狀體冰凍切片觀察。電極所在位點(diǎn)見圖1。

圖1 電極位點(diǎn)損毀及鑒定

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 釆用SPSS22.0軟件進(jìn)行分析。滿足正態(tài)分布和方差齊性的數(shù)據(jù)不同組比較采用單因素方差分析(ONE-WAY ANOVA),不滿足正態(tài)分布和方差齊性的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)。提取的電生理信號(hào)通過OfflineSorter、Neuroexplorer軟件分析導(dǎo)出數(shù)據(jù)。用GraphPadPrism8軟件制圖。

2 結(jié) 果

2.1雷帕霉素改善L-DOPA誘導(dǎo)LID大鼠的不自主運(yùn)動(dòng) L-DOPA可以誘發(fā)大鼠出現(xiàn)不自主運(yùn)動(dòng),隨著用藥天數(shù)逐漸延長(zhǎng),大鼠可表現(xiàn)出偏側(cè)扭轉(zhuǎn)等不自主運(yùn)動(dòng)。自用藥第9天起,雷帕霉素組AIM評(píng)分較對(duì)照組明顯下降(P<0.05)。見表1。

表1 兩組不同天數(shù)AIM 評(píng)分分)

2.2雷帕霉素顯著抑制LID大鼠紋狀體神經(jīng)元放電頻率 LID組紋狀體神經(jīng)元的放電頻率明顯高于假手術(shù)組(P<0.001),經(jīng)過雷帕霉素干預(yù)1 w后紋狀體神經(jīng)元放電頻率明顯較LID組下降(P<0.001),干預(yù)2 w后紋狀體神經(jīng)元放電頻率較干預(yù)1 w時(shí)略有升高,但兩者無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見圖2、表2。

表2 各組紋狀體神經(jīng)元及簇狀放電頻率比較

圖2 各組紋狀體神經(jīng)元放電頻率對(duì)比

2.3雷帕霉素改善LID局部場(chǎng)電位變化 局部場(chǎng)電位原始波形圖時(shí)頻見圖3。在10 Hz以下的低頻段及10～20 Hz之間的中頻段,PD組色彩最淡,LID組能量明顯高于PD組,經(jīng)雷帕霉素干預(yù)1 w和2 w后能量較LID組明顯降低,低頻組能量經(jīng)雷帕霉素干預(yù)1 w和2 w無顯著性差異,而在20～30 Hz的頻段,雷帕霉素1 w組和假手術(shù)組最深能量最低,LID組色彩最淡,能量最高,見圖4。場(chǎng)電位的功率譜分析見圖5A,LID組在0～10 Hz低頻范圍內(nèi)能量最高,雷帕霉素干預(yù)組在15～40 Hz處略微高于LID組。上述結(jié)果提示,LID紋狀體神經(jīng)元存在異常放電情況,雷帕霉素可以有效抑制紋狀體神經(jīng)元的異常放電,干預(yù)時(shí)間1 w與2 w對(duì)紋狀體異常放電影響無明顯差異。

圖3 各組LFP信號(hào)

圖4 各組LFP的時(shí)頻分析

2.4雷帕霉素抑制LID簇狀放電頻率 LID組神經(jīng)元簇狀放電頻率較假手術(shù)組及PD組明顯升高(P<0.001),而在雷帕霉素處理1 w及2 w后神經(jīng)元簇狀放電頻率均下降(P<0.05,P<0.01),雷帕霉素1 w及2 w組神經(jīng)元簇狀放電頻率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表2、圖5B。

3 討 論

LID的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全清楚。有研究顯示mTOR信號(hào)通路在LID的發(fā)病過程中扮演重要角色〔10〕,使用mTORC1抑制劑雷帕霉素可以緩解6-OHDA誘導(dǎo)的PD大鼠長(zhǎng)期攝入L-DOPA所發(fā)生的LID癥狀,這與D1R過度激活有關(guān)〔11,12〕。本研究同樣證實(shí)了雷帕霉素可以顯著改善LID大鼠的行為學(xué)癥狀,電生理研究顯示LID狀態(tài)下的大鼠紋狀體神經(jīng)元自發(fā)放電頻率明顯升高。多通道微電極陣列技術(shù)可以記錄和檢測(cè)到多個(gè)神經(jīng)元胞外動(dòng)作電位,即鋒電位〔7〕。

這種技術(shù)能長(zhǎng)時(shí)間對(duì)清醒動(dòng)物中樞系統(tǒng)神經(jīng)元放電活動(dòng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)和記錄,研究發(fā)現(xiàn)〔13～15〕中樞系統(tǒng)神經(jīng)元的電生理活動(dòng)可隨著動(dòng)物的某些特定行為改變發(fā)生相應(yīng)變化。多通道電極主要檢測(cè)的指標(biāo)包括神經(jīng)元的放電頻率、Burst發(fā)放頻率、局部場(chǎng)電位、時(shí)頻分析和功率譜分析。局部場(chǎng)電位時(shí)頻分析及功率分析表明,在10 Hz以下的低頻段(0～10 Hz)及中頻段(20～30 Hz),紋狀體神經(jīng)元電活動(dòng)減弱,予雷帕霉素干預(yù)1 w后,提示神經(jīng)元電活動(dòng)被有效抑制,雷帕霉素干預(yù)1 w和2 w其神經(jīng)元電活動(dòng)未見明顯改變。而在高頻段(15～40 Hz),LID組神經(jīng)元電活動(dòng)似乎略低于雷帕霉素干預(yù)組的神經(jīng)元電活動(dòng),提示有可能在高頻段區(qū)域,雷帕霉素干預(yù)后的神經(jīng)元放電方式已發(fā)生改變。

綜上,mTOR通路信號(hào)的異常激活是LID發(fā)生的重要環(huán)節(jié),抑制mTOR通路的激活可作為治療LID的靶點(diǎn),為此類藥物的開發(fā)提供一定依據(jù)。