艾力夏提·艾熱提,馬志剛,李洪偉

（新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院骨科中心脊柱一科，新疆 烏魯木齊 830000）

椎間盤退變（intervertebral disc degeneration,IDD）是下腰痛最常見的原因之一，表現(xiàn)為細胞外基質(zhì)的退化、細胞凋亡、炎癥反應(yīng)增加[1]。當前IDD的治療主要為緩解疼痛和控制癥狀，較少干擾其病理生理過程，雖然已有一些緩解輕度和中度IDD的臨床策略，但仍需進一步探討[2-3]。因此，深入研究IDD的發(fā)病機制對研發(fā)新型治療方法有幫助。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是一類長度超過200個核苷酸，且無編碼蛋白功能的RNA。越來越多的證據(jù)表明，lncRNA在人類退行性髓核組織中存在差異表達，并可能在調(diào)節(jié)IDD的進展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4-5]。有研究發(fā)現(xiàn)，核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域樣受體家族Pyrin域蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor family pyrin domain-containing protein 3,NLRP3）在IDD中表達明顯增高，且與椎間盤退變程度呈正相關(guān)，而且IDD 的髓核細胞中NLRP3 炎癥小體被激活[6-8]。另外，已有研究表明，lncRNA HOX 轉(zhuǎn)錄反義RNA（HOX transcript antisense intergenic RNA,HOTAIR）與NLRP3炎癥小體的激活有關(guān)[9]。lncRNA HOTAIR 可通過內(nèi)源競爭性RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）競爭機制來控制微小RNA（microRNA,miR）-22 的表達和功能[10-11]，而且lncRNA HOTAIR 還可以調(diào)控IDD 的進展[12]。然而，lncRNA HOTAIR 在IDD 中對髓核細胞的炎癥小體和細胞凋亡的具體作用尚不清楚。故本研究探討了lncRNA HOTAIR 對椎間盤髓核細胞中炎癥小體激活的調(diào)節(jié)作用和機制。

1 材料與方法

1.1 人椎間盤髓核細胞系培養(yǎng)

人椎間盤髓核細胞系（human intervertebral disc nucleus pulposus cell line,HNPC）購自武漢普諾賽生物科技有限公司。HNPC 細胞在含有10%胎牛血清（美國GIBCO 公司）、100 mg/mL 鏈霉素和100 U/mL 青霉素的杜氏改良培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并置于37 ℃的濕潤培養(yǎng)箱[95%(V/V)空氣和5%(V/V) CO2]中培養(yǎng)，培養(yǎng)基每隔2 d 更換1 次。細胞每隔3 d 傳代1 次，將傳代2 次后的對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。

1.2 細胞的分組與處理

用晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products,AGE）誘導(dǎo)HNPC 細胞退變。首先將HNPC 細胞分為AGE（200 μg/mL,上海遠慕生物有限公司）處理組（AGE 組）和對照組（與AGE 等體積的生理鹽水處理細胞，Ctrl 組）。其次，將HNPC 細胞分為miR-22 的擬似物（20 μg/mL，北京生工生物技術(shù)公司）組（mimic組）、mimic 的陰性對照（20 μg/mL，北京生工生物技術(shù)公司）組（mimic-NC 組）、lncRNA HOTAIR 過表達質(zhì)粒（10 μg/mL，上海吉瑪公司）組（HOTAIR 組）、過表達質(zhì)粒的空載體（10 μg/mL，上海吉瑪公司）組（Vector 組）、10 μg/mL HOTAIR 聯(lián)合20 μg/mL mimic 處理組（HOTAIR+mimic組）、10 μg/mL HOTAIR聯(lián)合50 μg/mL NLRP3 抑制劑mcc950 處理組（HOTAIR+mcc950 組）。各組細胞均處理24 h用于后續(xù)實驗。

1.3 流式細胞術(shù)檢測HNPC細胞的凋亡率

用Annexin V-FITC凋亡試劑盒（美國Sigma公司）評估AGE 組、Ctrl 組、HOTAIR 組以及Vector 組細胞凋亡率。各組HNPC 細胞在結(jié)合緩沖液中洗滌2 次后，以500 g離心5 min。然后置于100 μL Annexin V-FITC 和10 μL PI的1×結(jié)合緩沖液中避光培養(yǎng)。采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.4 Western blot檢測炎癥小體蛋白標志物

檢測AGE 組、Ctrl 組、HOTAIR 組、Vector 組、HOTAIR+mimic 組、HOTAIR+mcc950 組中炎癥小體相關(guān)蛋白NLRP3、Caspase1、含半胱天冬酶激活和募集結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase activation and recruitment domain,ASC）的表達。用RIPA 裂解緩沖液裂解細胞提取總蛋白。用二喹啉甲酸試劑盒測定蛋白濃度。此外，使用12% SDS-PAGE凝膠分離蛋白，并將其轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。將膜用5%的脫脂牛奶封閉2 h，然后在4 ℃下與一抗（均購于美國Abcam公司）孵育10 h。免疫復(fù)合物用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗兔IgG抗體（1∶5 000）孵育。使用Western-Light化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)捕獲蛋白信號表達。所有實驗均重復(fù)3 次。抗體為NLRP3（1∶500）、Caspase1（1∶1 000）、ASC（1∶600）。

1.5 qRT-PCR 法檢測lncRNA HOTAIR 和miR-22 的表達

根據(jù)試劑盒說明書，使用TRIzol 試劑（美國Invitrogen 公司）和RNeasy mini kit（美國Qiagen 公司）從各組HNPC 細胞中提取總RNA 或者總miRNA。通過分光光度法測定總RNA 或者總miRNA 的濃度和純度，并使用PrimeScript RT 逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（日本Takara公司）按照說明書合成互補DNA。使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒（日本Takara公司）和StepOnePlus實時PCR系統(tǒng)（美國Applied Biosystems）進行qRT-PCR 分析。lncRNA HOTAIR 表達以GAPDH 為內(nèi)參，miR-22 表達以U6 為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法測定基因的相對表達量。目的基因引物由上海生工生物技術(shù)有限公司設(shè)計。引物序列：lncRNA HOTAIR 正向 5＇- CCTTAT AAGCTCATCGGAGCA-3＇，反向5＇-CATTTCTGGG TGGTTCCTTT-3＇；miR-22 正向5＇-GGTTAAGCTGCC AGTTGAA-3＇，反向5＇-CCAGTGCGTGTCGTGGAGT-3＇；GAPDH 正向5＇-CTCACTGCTACATCCAGTACAC-3＇，反向5＇-CCTGCCTACCATGTTTACCG-3＇；U6 正向5＇-CTCGCTTCGGCAGCACA-3＇，反向5＇-AACGCTT CACGAATTTGCGT-3＇。

1.6 雙熒光素酶報告實驗

通過雙熒光素酶報告實驗檢測lncRNA HOTAIR與miR-22 以及miR-22 與NLRP3 的3'-UTR 的結(jié)合作用。通過PCR 擴增HOTAIR 中包含預(yù)測miR-22 結(jié)合位點的cDNA 片段。然后將結(jié)合位點的假定序列克隆到pGL3 雙熒光素酶miRNA-基因表達載體（美國Promega 公司）中，構(gòu)建報告載體pGL3-HOTAIR-wild-type（WT-lncRNA HOTAIR）。另外，使HOTAIR 基因中miR-22 的結(jié)合位點發(fā)生突變，并命名為pGL3-HOTAIR-mut（MUT-lncRNA HOTAIR）。隨后，根據(jù)說明書，使用Lipofectamine 2000 將1 μg WT-lncRNA HOTAIR 或1 μg MUT-lncRNA HOTAIR 分別與mimic轉(zhuǎn)染的HNPC 細胞（5×104個/孔）共轉(zhuǎn)染（mimic 組），或使用Lipofectamine 2000 將1 μg WT-lncRNA HOTAIR或1 μg MUT-lncRNA HOTAIR 分別與mimic-NC 轉(zhuǎn)染的HNPC 細胞（5×104個/孔）共轉(zhuǎn)染（mimic-NC 組）。雙熒光素酶報告系統(tǒng)（美國Promega 公司）檢測熒光素酶活性。

另外，與上述方案一致，構(gòu)建報告載體pGL3-NLRP3-3'UTR-wild-type （WT-NLRP3-3'UTR） 。 使NLRP3-3'UTR中miR-22的結(jié)合位點發(fā)生突變，并命名為pGL3-NLRP3-3'UTR-mut（MUT-NLRP3-3'UTR）。隨后，根據(jù)說明書，使用Lipofectamine 2000 將1 μg WTNLRP3-3'UTR 或1 μg MUT-NLRP3-3'UTR 分別與mimic 轉(zhuǎn)染的HNPC 細胞（5×104個/孔）共轉(zhuǎn)染（mimic組），或使用Lipofectamine 2000 將質(zhì)粒1 μg WTNLRP3-3'UTR 或1 μg MUT-NLRP3-3'UTR 分別與mimic-NC 轉(zhuǎn)染的HNPC 細胞（5×104個/孔）共轉(zhuǎn)染（mimic-NC 組）。雙熒光素酶報告系統(tǒng)（美國Promega公司）檢測熒光素酶活性。

1.7 Hoechst 33342染色檢測HNPC細胞的凋亡率

將Vector 組、HOTAIR 組、Ctrl 組、HOTAIR+mimic組、HOTAIR+mcc950 組HNPC 細胞過夜培養(yǎng)。用PBS輕輕沖洗細胞，同時加入0.5 mL Hoechst 33342（美國Thermo Fisher 公司）和PI（美國Invitrogen 公司）工作液。將細胞置于室溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 min。PBS 沖洗后，用熒光顯微鏡觀察分析，統(tǒng)計圖中HNPC細胞的凋亡數(shù)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

使用GraphPad PRISM 5.01 進行數(shù)據(jù)錄入和統(tǒng)計學(xué)分析，正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示。2組間比較采用Studentt檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準為α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 髓核細胞中l(wèi)ncRNA HOTAIR、miR-22、NLRP3 的表達

使用200 μg/mL 的AGE 誘導(dǎo)髓核細胞退變。與Ctrl 組比較，AGE 組細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05），而且AGE 組NLRP3、ASC、Caspase1 的表達均上調(diào)（P＜0.05）。與Ctrl 組比較，AGE 組髓核細胞中l(wèi)ncRNA HOTAIR 的表達上調(diào)（P＜0.05），而miR-22下調(diào)（P＜0.05）。雙熒光素酶報告實驗檢測發(fā)現(xiàn)，lncRNA HOTAIR 可直接結(jié)合miR-22，且miR-22 可與NLRP3的3'UTR結(jié)合，見圖1。

圖1 lncRNA HOTAIR、miR-22、NLRP3炎癥小體在AGE誘導(dǎo)的髓核細胞退變中的表達

2.2 過表達lncRNA HOTAIR 促進炎癥小體的激活和細胞凋亡

與Vector 組比較，HOTAIR 組的lncRNA HOTAIR表達顯著增加（P＜0.05）。與Vector 組比較，HOTAIR組NLRP3、ASC、Caspase1 蛋白表達均上調(diào)（P＜0.05），且髓核細胞的凋亡率顯著升高（P＜0.05），miR-22表達顯著降低（P＜0.05），見圖2。

圖2 lncRNA HOTAIR 過表達對NLRP3炎癥小體和髓核細胞凋亡的影響

2.3 lncRNA HOTAIR 通過抑制miR-22 激活NLRP3促進的細胞凋亡

與Ctrl 組比較，HOTAIR 組細胞凋亡數(shù)明顯增加（P＜0.05）；與HOTAIR 組比較，HOTAIR+mimic 組及HOTAIR+mcc950 組細胞凋亡數(shù)均顯著減少（P＜0.05），見圖3。

圖3 lncRNA HOTAIR 通過抑制miR-22激活NLRP3促進的細胞凋亡

2.4 lncRNA HOTAIR 通過抑制miR-22 激活NLRP3介導(dǎo)的炎癥小體

與Ctrl 組比較，HOTAIR 組lncRNA HOTAIR 以及NLRP3、ASC、Caspase1 蛋白表達均上調(diào)（P＜0.05），而miR-22 的表達顯著下調(diào)（P＜0.05）。與HOTAIR 組比較，HOTAIR+mimic 組lncRNA HOTAIR 的表達無顯著變化（P＞0.05），miR-22 的表達顯著上調(diào)（P＜0.05），而NLRP3、ASC、Caspase1 蛋白表達均顯著下調(diào)（P＜0.05）。與HOTAIR 組比較，HOTAIR+mcc950 組lncRNA HOTAIR 和miR-22 表達均無顯著變化（P＞0.05），而NLRP3、ASC、Caspase1 蛋白表達均顯著下調(diào)（P＜0.05），見圖4。

圖4 髓核細胞中l(wèi)ncRNA HOTAIR、miR-22以及NLRP3炎癥小體標志物的表達

3 討論

IDD 是一種常見的退行性疾病，lncRNA 在其發(fā)病機制中起到重要作用[10-13]。2014年，Wan等[14]首次報道了人類IDD 中l(wèi)ncRNA 的表達譜，與健康人群相比，IDD 人群中l(wèi)ncRNA HOTAIR（NR_003716）的表達差異顯著。本研究發(fā)現(xiàn)，在AGE 誘導(dǎo)髓核細胞退變過程中，lncRNA HOTAIR 表達顯著上調(diào)，并且進一步證明其具有促進HNPC 細胞凋亡的能力。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA HOTAIR 通過與miR-22 和靶基因NLRP3的直接靶向結(jié)合，調(diào)控NLRP3 炎癥小體的激活。這些發(fā)現(xiàn)為以lncRNA HOTAIR/miR-22/NLRP3 軸作為IDD的治療靶點提供了新線索。

先前的研究表明，ceRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在IDD 中具有重要作用[15-19]。lncRNA HOTAIR 可通過與miR-34a、miR-22等miRNAs相互作用來調(diào)控髓核細胞凋亡[20-21]，且miR-22 是一種被充分證明受ceRNA 網(wǎng)絡(luò)調(diào)控并參與介導(dǎo)多種細胞過程的miRNA[22]，其可促進HNPC 細胞增殖，抑制HNPC 細胞的退行性改變并減緩細胞衰老[23]。本研究證實了miR-22 在AGE 誘導(dǎo)后的HNPC細胞中顯著降低，而且過表達lncRNA HOTAIR 顯著抑制了miR-22 的表達，表明lncRNA HOTAIR 可以負向調(diào)控miR-22。有趣的是，我們進一步研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA HOTAIR 與miR-22 直接靶向結(jié)合。此外，lncRNA HOTAIR 過表達可以促進HNPC 細胞凋亡并抑制miR-22 的表達，過表達miR-22 后明顯逆轉(zhuǎn)了這種促進作用，表明HNPC 細胞凋亡受lncRNA HOTAIR/miR-22軸的調(diào)控。

另外，本研究進一步發(fā)現(xiàn)，miR-22 與NLRP3 直接靶向結(jié)合。AGE 誘導(dǎo)后NLRP3炎癥小體明顯被激活，且當lncRNA HOTAIR 過表達后可以顯著上調(diào)NLRP3、ASC、Caspase1 蛋白，從而促進NLRP3 炎癥小體激活。當mcc950 抑制NLRP3 后，明顯逆轉(zhuǎn)了lncRNA HOTAIR 對凋亡和炎癥小體的促進作用。過表達miR-22 后明顯逆轉(zhuǎn)了這種促進作用，表明HNPC 的細胞凋亡和炎癥小體都受lncRNA HOTAIR/miR-22/NLRP3軸的調(diào)控。

盡管在體外實驗中觀察到了lncRNA HOTAIR/miR-22/NLRP3 軸在促進HNPC 細胞凋亡和炎癥小體激活中的重要作用，但仍需要進一步研究來驗證這種調(diào)控機制在體內(nèi)是否能逆轉(zhuǎn)IDD 的發(fā)生和發(fā)展。例如，開展動物模型實驗和臨床研究來評估針對lncRNA HOTAIR/miR-22/NLRP3 軸的治療策略是否能夠有效改善IDD患者的病情。

綜上所述，lncRNA HOTAIR 通過調(diào)控miR-22 和NLRP3 的表達，參與了椎間盤髓核細胞凋亡和炎癥小體的激活。本研究表明，以lncRNA HOTAIR/miR-22/NLRP3 軸作為IDD 的治療靶點非常有前景，可用于IDD治療的候選藥物的研究中。