劉東彥 石曉峰* 王 信 王新娣 馬趣環(huán) 張家旭

（1.甘肅省醫(yī)學科學研究院，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000）

全世界松科植物共有10個屬230余種，我國松樹有10個屬120余種，可供藥用的達13種。我國南方有豐富的馬尾松（Pinus massonianaLamb.）、油松（P.abulacformisCarr.）、刺松（Juniperus formosanaHayata）、云南松（P.yunnaenisFrench.）、濕地松（P.elliottii）、華山松（P.armandiFranch.）等，北方有紅松（P.karaiensSieb et Zucc.）、白皮松（Pinus bungeanaZucc.ex Endl）.、黑松（P.thunbergiiPurl.）、雪松（Cedrus deodara(Roxb) G.Don）、落葉松（Larix gmelinii(Rupr.)Kuzen.）、樟子松（P.sylvestrisvar.mongolica Litv.）等[1]。松樹的利用價值很高[2-5]。課題組前期通過對7種松柏科植物的嫩枝、松針及雪松不同采集期、不同部位中莽草酸的含量測定，發(fā)現(xiàn)4月和5月份采集雪松松針中莽草酸的含量較高，嫩枝次之，其他部位含量較低[6-7]，并針對其松針中莽草酸的開發(fā)進行了大量研究[8-11]，建立了水提—醇沉—柱層析—重結晶提取法，可獲得純度達95%以上的莽草酸。而莽草酸是抗病毒藥物的中間體，主要應用于磷酸奧司他韋的合成[12]。鑒于此，本研究收集甘肅產(chǎn)（蘭州和天水）雪松、白皮松、油松、華山松、樟子松及落葉松6種松樹4～5月份的松針和嫩枝，測定其中的莽草酸含量，篩選出莽草酸含量高的松樹部位，用于后續(xù)制備莽草酸的原料，為莽草酸的資源開發(fā)及松樹的有效利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

莽草酸（批號MUST-14110807，純度97.19%），購自成都曼斯特生物科技有限公司；甲醇為色譜純；磷酸等其余試劑均為分析純。

考察甘肅產(chǎn)松樹品種[13-14]，主要有雪松、油松、華山松、白皮松、樟子松和落葉松六大品種。參考課題組對雪松的研究，筆者選擇蘭州和天水兩大城市，采集同一地點、同一時間6種松樹。蘭州雪松、白皮松、油松、華山松、樟子松及落葉松6種松樹于2021年4月19日采自甘肅省蘭州市植物園；天水雪松、白皮松、油松、華山松、樟子松及落葉松6種松樹于2021年5月8號采自甘肅省天水市小隴山林業(yè)研究院。經(jīng)甘肅省醫(yī)學科學研究院鑒定其品種，陰干后分別收集松針和嫩枝，粉碎后過藥典二號篩。樣品信息如表1所示。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

1.2 試驗儀器

高效液相色譜儀（Agilent 1260），美國安捷倫公司；超聲波提取儀（SK3310LHC），上海科導超聲儀器有限公司；萬分之一分析天平（AE260），瑞士Mettle公司；高速多功能粉碎機（CX-100），上海市晟喜制藥機械有限公司；艾科浦超純水機（AWL-0501-M），重慶頤樣企業(yè)發(fā)展有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇/0.1%磷酸水溶液（10∶90，體積比），檢測波長為217 nm，柱溫為30 ℃，流速為1 mL/min，進樣量為20 μL，理論板數(shù)按莽草酸峰計算應不低于6 000。

1.3.2 對照品溶液的制備

精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥36 h的莽草酸對照品10.0 mg，置于50 mL的容量瓶中，加純凈水溶解并定容，配制成濃度為0.2 mg/mL的莽草酸對照品儲備液。精密吸取莽草酸對照品儲備液3 mL，置于10 mL的容量瓶中，加純凈水定容，配制成濃度為60 μg/mL的莽草酸對照品溶液。

1.3.3 供試品溶液的制備

精密稱取S1號（天水雪松松針）樣品約0.2 g，置于25 mL的具塞錐形瓶中，精密加入純凈水20 mL，稱取重量，浸泡10 min，超聲處理40 min（溫度為50 ℃，功率為40 W）。待冷卻后再次稱取重量，并用純凈水補足減失的重量，搖勻過濾后，吸取續(xù)濾液1 mL，置于25 mL的容量瓶中，加純凈水定容并搖勻，使用0.45 μm的濾膜進行過濾，得到樣品。

1.4 方法學考察

1.4.1 線性關系的考察

精密吸取濃度為60 μg/mL的莽草酸對照品溶液，分別為0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于1 mL的容量瓶中，加純凈水定容搖勻，配制成系列濃度的莽草酸對照品溶液，使用HPLC進行檢測。以莽草酸濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線。得到線性回歸方程：Y=60.190 6X+13.993 8(r=0.999 5)，且莽草酸濃度在3.0～60 μg/mL范圍內呈良好的線性關系。

1.4.2 精密度試驗

精密吸取濃度為24 μg/mL的莽草酸對照品溶液20 μL，使用HPLC進行檢測，重復進樣6次，測得其峰面積的RSD為0.91%（n=6），表明儀器的精密度良好。

1.4.3 重復性試驗

精密稱取S1號樣品約0.2 g，共6份，制備供試品溶液，使用HPLC進行檢測。測得其中莽草酸的平均含量為30.45 mg/g，RSD為1.33%（n=6），表明該方法重復性較好。

1.4.4 穩(wěn)定性試驗

在1.4.3的基礎上，分別將供試品溶液靜置0、2、4、6、8、10、24 h后再進行HPLC檢測。測得莽草酸峰面積的RSD為1.41%，表明樣品在24 h內穩(wěn)定性良好。

1.5 驗證試驗

將不同品種、產(chǎn)地和部位松樹中莽草酸的含量導入SPSS 19.0軟件（若某一樣品中莽草酸的含量檢測不到，則將其含量輸為0.001），對24批樣品中莽草酸的含量進行Z得分標準化處理，隨后以平方Euclidean距離為度量標準，采用組間聯(lián)接法，對標準化處理后的數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)聚類分析[15-17]。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

莽草酸是一個可發(fā)生電離的弱酸，在溶液中pH值小于2.67時才以分子形式存在[18]。在色譜柱選擇上，前期試驗曾用過Diamonsil C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)[7]、Agilent TC-C18 (250 mm×4.6 mm,5 μm)[8]和Agilent Eclipse Plus C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)[10]，短柱出峰時間2.3 min，樣品色譜圖和對照品色譜圖非常相似，因此沈薇[19]采用LC-MS/MS鑒別了目標峰莽草酸的純度。本試驗優(yōu)化了流動相甲醇-0.1%磷酸溶液的比例(5∶95、7∶93、10∶90)，選甲醇-0.1%磷酸溶液(10∶90)，六種松樹收集的松針和松枝中莽草酸均達到分離，目標峰莽草酸出峰時間3.1 min，達到試驗要求，色譜圖如圖1所示。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.2 加樣回收率分析

精密稱取上述莽草酸含量為30.45 mg/g的S1號樣品約0.1g，共6份，加入莽草酸對照品適量，制備供試品溶液，使用HPLC進行檢測，發(fā)現(xiàn)莽草酸的平均回收率為100.4%（n=6），RSD為1.71%，結果見表2。

表2 加樣回收率試驗結果（n=6）Tab.2 Results of recovery tests（n=6）

2.3 樣品含量分析

精密稱取6種松樹24批樣品各0.2 g，每個樣品3份，制備供試品溶液，使用HPLC進行檢測，計算每個樣品中莽草酸的含量，結果如表3所示。

表3 樣品含量測定結果 ( ±s ,n = 3)Tab.3 Results of content determination of sample( ±s,n= 3)

表3 樣品含量測定結果 ( ±s ,n = 3)Tab.3 Results of content determination of sample( ±s,n= 3)

注：“-”代表未檢出。

編號莽草酸含量/(mg·g-1)S131.47±0.41 S224.27±0.25 S316.94±0.16 S429.88±0.28 S53.83±0.45 S6-S729.66±0.22 S821.13±0.31 S911.13±0.40 S1018.46±0.36 S11-S12-S136.98±0.31 S142.08±0.43 S151.62±0.24 S164.66±0.34 S170.95±0.38 S181.70±0.26 S192.99±0.36 S201.91±0.41 S211.79±0.43 S223.74±0.29 S230.28±0.46 S240.66±0.48

2.4 直觀分析

為便于比較，將6種松樹24批樣品中莽草酸的含量按天水松針、蘭州松針、天水嫩枝和蘭州嫩枝分別繪圖，進行重疊顯示，如圖2所示[20-21]。由圖2可知，6種松樹不管是天水產(chǎn)還是蘭州產(chǎn)，也不論品種、部位，其莽草酸含量基本一致。莽草酸含量由高到低依次為雪松、華山松、白皮松、油松、樟子松和落葉松。因此，天水雪松松針、蘭州雪松松針、天水白皮松及天水華山松松針，可作為開發(fā)莽草酸的優(yōu)選資源。

圖2 直觀分析圖Fig.2 The visual analysis

2.5 聚類分析

聚類分析結果如圖3所示[22-23]。聚類分析表明，在度量距離為5時，24批樣品可聚為3類，其中天水雪松松針（S1）、天水白皮松松針（S2）、天水華山松松針（S4）和蘭州雪松松針（S7）聚合為一類，天水油松松針（S3）、蘭州白皮松松針（S8）和蘭州華山松松針（S10）聚合為一類，其余樣品聚為一類。不同樣品按松樹品種、產(chǎn)地和部位聚合，與2.4章節(jié)的直觀分析結果一致。

圖3 24 批樣品聚類樹狀圖Fig.3 Dendrogram of twenty-four batches of samples

3 結論

6種松樹松針中的莽草酸含量差距較大，落葉松和樟子松松針中基本不含莽草酸，雪松松針中的莽草酸含量最高，其次為華山松松針和白皮松松針，而松枝中莽草酸的含量均較低。不同產(chǎn)地采集松樹中莽草酸的含量也存在差異，除了采集時間的影響外，生長環(huán)境也會影響其莽草酸的含量。

通過本試驗研究篩選得到天水雪松松針、蘭州雪松松針、天水白皮松及天水華山松松針中莽草酸的含量較高，參考課題組前期建立的水提—醇沉—柱層析—重結晶制備雪松松針中莽草酸的方法[24]和《雪松葉》甘肅省中藥材標準[25]，以其作為制備莽草酸的原料，批量制備莽草酸，將制備的莽草酸申請納入中國食品藥品檢定研究院標準物質，供研究者廣泛使用；并為合成磷酸奧司他韋提供豐富的原料，實現(xiàn)松樹資源的有效利用。