胡鳳，黃魏，趙中開，鐘云

自貢檢驗檢測院，四川 自貢 643000

小兒咳喘靈顆粒由麻黃、苦杏仁、甘草、石膏、金銀花、板藍(lán)根、瓜蔞組成，在臨床上可以用于兒童的咳嗽、呼吸道感染、氣管炎等，屬于兒科用藥且用藥廣泛［1-4］。小兒咳喘靈顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》（中藥成方制劑標(biāo)準(zhǔn)第四冊），標(biāo)準(zhǔn)編號為WS3-B-0688-91［5］。雖然有部分企業(yè)使用局頒標(biāo)準(zhǔn)，檢驗項目略有增加，但絕大多數(shù)的小兒咳喘靈顆?，F(xiàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)仍為WS3-B-0688-91，該質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅收錄了2 個理化鑒別，不能全面控制該制劑質(zhì)量?，F(xiàn)有對小兒咳喘靈顆粒進(jìn)行含量測定的研究［6-8］總共涉及到13 個指標(biāo)成分，以金銀花和麻黃類的含量測定研究居多。

指紋圖譜可有效控制中藥及中藥制劑的質(zhì)量。由于中藥化學(xué)成分復(fù)雜，指紋圖譜既能夠體現(xiàn)中藥化學(xué)組分的整體水平，又可以較全面地反映中藥所含化學(xué)成分的種類及數(shù)量，可以體現(xiàn)中藥制劑中化學(xué)成分和相對含量［9-13］。中藥制劑為多種中藥飲片制備而成，其化學(xué)成分相對于化學(xué)藥而言十分復(fù)雜，高效液相色譜（HPLC）能夠很好將中藥制劑中的多個組分進(jìn)行分離，指紋圖譜能較為全面地呈現(xiàn)出相同品種中藥制劑中化學(xué)組分?jǐn)?shù)量與分布規(guī)則，可以反映中藥制劑的整體特征［14-17］。

本研究采用HPLC 法分析小兒咳喘靈顆粒中的相關(guān)化學(xué)成分，建立其指紋圖譜，尋找各藥材的特征成分，并結(jié)合聚類分析、主成分分析（PCA）2 種化學(xué)模式識別方法，對小兒咳喘靈顆粒質(zhì)量進(jìn)行評價，以期為小兒咳喘靈顆粒質(zhì)量的藥品監(jiān)管提供技術(shù)支撐［18］。

1 儀器與試驗材料

1.1 儀器

賽默飛U3000 高效液相色譜儀，XSE-205 梅特勒電子天平，UPR-Ⅱ-20L 純水儀，SCQ 超聲波清洗器。

1.2 試劑與試藥

甘草酸銨對照品、鹽酸麻黃堿對照品、甘草苷對照品、4,5-O-二咖啡?？鼘幩釋φ掌?、R,S-告依春對照品、綠原酸對照品、木犀草苷對照品、苦杏仁苷對照品、3,5-O-二咖啡?？鼘幩釋φ掌罚徸灾袊称匪幤窓z定研究院，批號分別為110731-202021、171242-201809、111610-201908、111894-202104、110753-202018、110753-202018、111720-201609、1110820-201808、111782-201807，含量分別以96.2%、100.0%、95.0%、95.1%、96.1%、96.1%、94.9%、98.2%、94.3%計。

乙腈為色譜純，甲醇為分析純，水為超純水（由UPR-Ⅱ-20L 純水儀制備）。收集小兒咳喘靈顆粒10 批，均為市售品種，分別來自10 個不同生產(chǎn)廠家，編號S1 到S10，具體信息見表1。

表1 小兒咳喘靈顆粒生產(chǎn)廠家信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為WelchXtimate C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），梯度洗脫，以乙腈（B），0.1%磷酸溶液（A）為流動相，洗脫條件：3%B →15%B（0～20 min），15%B →20%B（20～35 min），20%B →30%B（35～45 min），30%B →60%B（45～60 min），60%B（60～65 min）；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣體積為10 μL；色譜柱柱溫為30 ℃；DAD 檢測器，光譜范圍190 nm～400 nm，檢測波長為210 nm。

2.2 溶液的制備［13-14］

2.2.1 對照品溶液的制備分別精密稱定R,S-告依春14.3 mg 置25 mL 量瓶中、苦杏仁苷19.1 mg 置10 mL 量瓶中、鹽酸麻黃堿30.8 mg 置25 mL 量瓶中、綠原酸22.3 mg 置50 mL 量瓶中、甘草苷19.4 mg 置50 mL 量瓶中、木犀草苷18.1 mg 置25 mL 量瓶中、3,5-O-二咖啡酰奎寧酸19.1 mg 置25 mL 量瓶中、甘草酸銨20.7 mg 置50 mL 量瓶中、4,5-O-二咖啡?？鼘幩?2.9 mg 置25 mL 量瓶中，加適量甲醇超聲溶解后再加甲醇至刻度，搖勻；分別精密量取上述標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液1 mL 置同一10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備取小兒咳喘靈顆粒適量，混勻，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，精密加入70%甲醇20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷至室溫，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液用微孔濾膜過濾，即得。

2.3 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗精密稱取小兒咳喘靈顆粒（編號S1）1 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6 次，計算小兒咳喘靈顆粒樣品指紋圖譜中9 個已知共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD（以綠原酸為參照峰）。結(jié)果9 個已知共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD 均小于3%，表明高效液相色譜儀的精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗精密稱取同一批次的小兒咳喘靈顆粒（編號S1）6 份，按照“2.2.2”項下方法制備6 份供試品溶液，注入高效液相色譜儀中，進(jìn)行測定，計算小兒咳喘靈顆粒樣品指紋圖譜中9 個已知共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD（以綠原酸為參照峰）。結(jié)果9 個已知共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD 均小于3 %，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗精密稱取小兒咳喘靈顆粒（編號S1）1 份，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在室溫環(huán)境下，分別在0、6、12、24、48 h 注入高效液相色譜儀中，進(jìn)行測定，計算小兒咳喘靈顆粒樣品指紋圖譜中9 個已知共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD（以綠原酸為參照峰）。結(jié)果9 個已知共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD 均小于3%，表明供試品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 小兒咳喘靈顆粒HPLC 指紋圖譜的建立及相似度評價

2.4.1 指紋圖譜的建立取收集的10 批小兒咳喘靈顆粒樣品（S1～S10），按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定。將得到的10 批小兒咳喘靈顆粒HPLC 色譜圖數(shù)據(jù)以cdf 文件的格式導(dǎo)出，再將所導(dǎo)出的cdf 文件導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012A 版）進(jìn)行分析，以S1 的色譜圖作為參照圖譜，時間窗寬設(shè)定0.1 min，經(jīng)多點校正后生成10 批樣品色譜圖的疊加指紋圖譜，并采用中位數(shù)法生成對照指紋圖譜R［19-22］，結(jié)果見圖1。

圖1 小兒咳喘靈顆粒HPLC指紋圖譜及對照指紋圖譜

2.4.2 共有峰的指認(rèn)上述10 批樣品的指紋圖譜中，以綠原酸為參照物峰，共有16 個保留時間相對穩(wěn)定的共有峰，結(jié)合對照品的保留時間及光譜圖，共確認(rèn)了9 個已知共有峰，分別為4,5-O-二咖啡?？鼘幩?、木犀草苷、鹽酸麻黃堿、苦杏仁苷、R,S-告依春、綠原酸、甘草苷、3,5-O-二咖啡?？鼘幩岷透什菟徜@，見圖2。

圖2 小兒咳喘靈顆粒色譜圖：A.對照品溶液；B.供試品溶液

2.4.3 相似度評價10 批小兒咳喘靈顆粒樣品與對照圖譜的相似度均在0.901～0.962 之間，說明10 批小兒咳喘靈顆粒的化學(xué)組分基本相似，10 家生產(chǎn)廠家的制劑生產(chǎn)工藝基本穩(wěn)定，所建立的指紋圖譜可以用于小兒咳喘靈顆粒的整體質(zhì)量控制。

2.5 聚類分析

利用SPSS 25.0 軟件，將10 批小兒咳喘靈顆粒指紋圖譜9 個已知共有峰面積的標(biāo)準(zhǔn)化值作為參量，采用組間聯(lián)接法，平方歐式距離測量法進(jìn)行聚類分析，并繪制樹狀圖［23-24］。結(jié)果顯示，當(dāng)組間距為10 時，樣品可聚為2 類，第一類為1 號樣品，其他樣品為一類，見圖3。中藥色譜指紋圖譜相似度分析可見10 個不同生產(chǎn)廠家小兒咳喘靈顆粒的指紋圖譜相似度較好，而聚類分析卻將10 組樣品分為2 類，說明這10 批樣品的化學(xué)成分雖然種類相近，但其具體含量可能存在一定差異。四川A廠為I 類，其余9 個生產(chǎn)廠家為Ⅱ類，I 類相對于Ⅱ類中R，S-告依春、綠原酸、甘草苷、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰奎寧酸及4,5-O-二咖啡?？鼘幩岬南鄬Ψ迕娣e較大，對聚類分析結(jié)果的影響較大。

圖3 10批小兒咳喘靈顆粒聚類分析結(jié)果

2.6 主成分分析

以9 個已知共有峰面積作為變量，利用SPSS 25.0 軟件對10 批小兒咳喘靈顆粒的各峰面積進(jìn)行主成分分析，得到相關(guān)矩陣的特征值與方差貢獻(xiàn)率、因子載荷矩陣，結(jié)果見表2，表3。以主成分的特征值大于1 為標(biāo)準(zhǔn)，分析各成分方差貢獻(xiàn)率發(fā)現(xiàn)，主成分1，主成分2 的貢獻(xiàn)率較大，分別為64.379%，15.342%。前2 個主成分累計方差貢獻(xiàn)率為79.722%，能較好地涵蓋9 個已知共有峰的信息，具有代表性，故選取前2 個成分為主成分進(jìn)行分析評價［25］。

表2 小兒咳喘靈顆粒共有峰特征值與方差貢獻(xiàn)率

表3 小兒咳喘靈顆粒因子載荷矩陣

結(jié)合表2，計算得到9 個已知共有峰的權(quán)重系數(shù)，推出各主成分方程式，再將標(biāo)準(zhǔn)化后的10 批小兒咳喘靈顆粒已知組分的峰面積數(shù)據(jù)代入方程式中，分別得到10 批次小兒咳喘靈顆粒的主成分得分。結(jié)合各主成分方差貢獻(xiàn)率綜合評價各批次小兒咳喘靈顆粒樣品（綜合得分=0.643 79×Y1+0.153 42×Y2，其中Y1、Y2 分別為各樣品第一主成分、第二主成分得分），并根據(jù)得分對10 家不同生產(chǎn)企業(yè)的小兒咳喘靈顆粒進(jìn)行排名，結(jié)果見表4。

表4 小兒咳喘靈顆粒因子得分和綜合排名

再利用SIMCA 14.1 軟件對10 批小兒咳喘靈顆粒的各峰面積進(jìn)行主成分分析數(shù)據(jù)，以2 個主成分建立坐標(biāo)系，得到10 批小兒咳喘靈顆粒PCA 分析圖，見圖4。由PCA 分析圖可見，小兒咳喘靈顆粒明顯分布于2 個區(qū)域，可以被分為2 類，1 號為一類，其余為另一類，與SPSS 25.0 軟件的主成分分析排名及聚類分析結(jié)果一致。

圖4 小兒咳喘靈顆粒主成分分析圖

3 結(jié)果與討論

3.1 供試品提取條件的優(yōu)化

本試驗分別對小兒咳喘靈顆粒用不同提取溶劑（甲醇、乙醇、70%甲醇、70%乙醇、50%甲醇、50%乙醇），不同提取時間（15、30、45、60 min），不同提取方式（加熱回流、超聲）進(jìn)行了比較。結(jié)果表明采用70%甲醇為提取溶劑的超聲提取方法簡單，能體現(xiàn)多個組分，且提取效率較高。

3.2 檢測波長的選擇

設(shè)定在190 nm～400 nm 全波長下掃描小兒咳喘靈顆粒樣品，對色譜峰的全面性、基線平穩(wěn)性、各峰分離度等方面進(jìn)行分析，結(jié)果表明210 nm 波長下峰形良好，色譜峰較多，峰面積數(shù)值合適，所以選擇210 nm 波長為測定波長。

3.3 流動相的選擇

比較了不同的流動相系統(tǒng)，分別為甲醇-水、乙腈-水，發(fā)現(xiàn)甲醇-水系統(tǒng)的分離度較差；乙腈-水流動相系統(tǒng)分離度較好，但峰型較差，部分組分存在嚴(yán)重拖尾情況。在乙腈-水流動相系統(tǒng)基礎(chǔ)上增加磷酸，當(dāng)流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液時，既可以較好地分離各個組分，又可保持較好的峰形。因此選擇乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動相，并采用梯度洗脫方式。

3.4 不同色譜柱及高效液相色譜儀之間比較

分別考察了不同色譜柱及不同品牌的高效液相色譜儀對該方法的影響。分別使用了WelchXtimate（4.6 mm×250 mm，5 μm），AgilentTC-C18（2）（4.6 mm×250 mm，5 μm），Grace SmarC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；Agilent1260 高效液相色譜儀、賽默飛U3000 高效液相色譜儀。不同品牌、不同型號的色譜柱及不同品牌高效液相色譜儀對各峰的保留時間和峰面積有一定影響，但對指紋圖譜的整體影響均很小。

3.5 指紋圖譜評價

主成分分析對高維數(shù)據(jù)進(jìn)行降維，將多個變量的原始數(shù)據(jù)變換為幾個主成分，這些主成分可以反映原始數(shù)據(jù)的絕大部分信息［26-27］。本研究借助相似度評價、聚類分析和主成分分析方法對10 批小兒咳喘靈顆粒的指紋圖譜進(jìn)行評價，均表明10 批小兒咳喘靈顆粒樣品可聚為2 類，1 號為一類，其他樣品為一類，從得分看1 號生產(chǎn)廠家的綜合分?jǐn)?shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他生產(chǎn)廠家，分析可能因為1 號生產(chǎn)廠家采用的藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為局頒標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容包含薄層色譜及含量測定等內(nèi)容，可能在生產(chǎn)過程中對中藥材原料的控制較好。其余生產(chǎn)廠家的綜合得分較低，這可能是中藥材及中藥飲片原料質(zhì)量的不同及小兒咳喘靈顆粒生產(chǎn)過程中的投料規(guī)范性等原因?qū)е碌摹?/p>

本研究建立的指紋圖譜確定了16 個共有峰，通過與對照品的保留時間及光譜圖進(jìn)行比對，確認(rèn)了其中綠原酸等9 個化學(xué)組分。10 批樣品與對照圖譜的相似度均在0.901～0.962 之間，再結(jié)合化學(xué)模式識別分析，可用于分析及評價小兒咳喘靈顆粒的質(zhì)量，為小兒咳喘靈顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供參考依據(jù)。