李環(huán)羽，何帆

1.江西省人民醫(yī)院（南昌醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院），江西 南昌 330006；2.江西省兒童醫(yī)院，江西 南昌 330006

隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，臨床上出現(xiàn)了越來越多的多重耐藥肺炎克雷伯菌。其有著耐抗生素、毒性強、預(yù)后差、致死率高的特點，由此也給患者的家庭和社會帶來了相應(yīng)的經(jīng)濟負擔。肺炎克雷伯菌容易耐藥的原因之一，是該細菌易黏附于組織上皮或人工材料表面，形成生物被膜，使抗生素難以在其內(nèi)部細菌中達到有效濃度［1-2］。烈性噬菌體能導(dǎo)致生物被膜的降解，然后通過吸附識別和溶菌迅速導(dǎo)致細菌的裂解死亡。噬菌體具有宿主特異性，滅病原體精度高，且增殖能力強，是高效的殺菌生物。本研究提取噬菌體和病原菌，分別進行了體內(nèi)體外實驗，研究噬菌體對克雷伯肺炎細菌的被膜抑制作用及對于肺炎小鼠模型的治療效果，旨在獲得多重耐藥肺炎克雷伯菌肺炎的治療新途徑。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 實驗動物選取80 只SPF 級的 BALB/C 雌性小鼠［6～8 周齡，北京華阜康生物科技股份有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SYXK（京）2019-0008］。

1.1.2 儀器與試劑PBS（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：ZLI-9062）；甲醇（美國Thermo Fisher Scientific 公司，20211109）；BD Phoenix TM-100 全自動細菌鑒定系統(tǒng)（美國BD 公司）；LB 液體培養(yǎng)基（上海生工生物工程上海有限公司,批號：D605KA5760）；HH-B11 電熱培養(yǎng)箱（天津天宇公司）；SW-CJ-1FD 超凈工作臺（杭州天誠公司）。

1.2 方法

1.2.1 致病菌和裂解性噬菌體的分離與鑒定（1）致病菌的分離鑒定。收集2019 年1 月至2021 年12月江西省人民醫(yī)院（以下簡稱我院）檢驗科收取的肺炎病人的痰液樣本進行病原菌的分離，經(jīng)過分析證明該菌株具有克雷伯菌屬的特征。

（2）裂解性噬菌體的分離鑒定。將制得的肺炎克雷伯菌制成宿主菌懸液，取10 mL 的處理前廢水進行噬菌體富集。證明為裂解性噬菌體。

1.2.2 噬菌體效果的體外評估（1）噬菌體對細菌生長的抑制實驗。用LB 液體培養(yǎng)基將菌液稀釋至相應(yīng)濃度用于體外抑菌實驗。實驗分為四組，B、C、D 三個實驗組感染噬菌體復(fù)數(shù)分別為0.1、1、10，A 組（陰性對照組）不感染噬菌體。37 ℃、150 rpm 培養(yǎng)，吸光度值（OD）為在650 nm 下每隔 2 h測量一次。

（2）噬菌體對生物被膜的抑制實驗。用液體培養(yǎng)基將對數(shù)期的菌液稀釋至一定濃度，用于抑菌實驗。在無菌96 孔板的l-3 列加入100 μL102cfu/mL 的菌液，4-6 列加入等量104cfu/mL 的菌液，7-9 列加入等量106cfu/mL 的菌液。A 行加入100 μL 磷酸鹽緩沖液（PBS），B 行加入100 μL 效價為107pfu/mL的噬菌體。37 ℃、100 rpm 培養(yǎng)20 h。將96 孔板取出，倒掉培養(yǎng)物。用PBS 輕輕洗掉殘留的培養(yǎng)物，晾干。甲醇固定15 min，每孔加入250 μL0.4%的結(jié)晶紫染色15 min。倒掉結(jié)晶紫，用雙蒸水沖洗，晾干。

圖1 噬菌體對生物被膜的抑制實驗設(shè)計方案

1.2.3 體內(nèi)治療實驗腹腔注射對所有小鼠 進行麻醉，滴鼻攻毒20 μL 細菌懸液，攻毒2 h 后，B、C、D 三個實驗組 分別滴鼻20 μL 感染復(fù)數(shù)分別為0.1、1、10 的噬菌體，A 組（陰性對照組）滴鼻20 μL PBS。每12 小時記錄死亡小鼠數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體體外抑菌效果

在噬菌體加入12 h 內(nèi)，A 組OD 650 值持續(xù)升高，B、C、D 三個實驗組共培養(yǎng)物OD 650 值不穩(wěn)定。感染復(fù)數(shù)（MOI）=10 吸光值下降最快，加入噬菌體的三個實驗組，吸光值趨于穩(wěn)定后遠低于陰性對照組。見表1，圖2。

表1 噬菌體與克雷伯菌共培養(yǎng)物在650 nm下的吸光度

圖2 噬菌體與克雷伯菌共培養(yǎng)物在650 nm下的吸光度

2.2 噬菌體對生物被膜的抑制作用

結(jié)果顯示加入噬菌體后明顯抑制細菌生長。比較A、B 兩行可以看出，加入噬菌體后可明顯抑制細菌生長，培養(yǎng)基顏色正常。比較C、D 兩行可以看出，7-9 列即106cfu/mL 的細菌經(jīng)20 h 培養(yǎng)后能在96 孔板上形成生物被膜，107pfu/mL 的噬菌體能抑制生物被膜形成。見圖3。

圖3 對生物被膜的抑制作用

2.3 噬菌體對小鼠存活的影響

攻毒24 h，對照組小鼠全部死亡，感染復(fù)數(shù)為0.1的小鼠存活率為20%，感染復(fù)數(shù)為1 的小鼠存活率為55%，感染復(fù)數(shù)為10的小鼠存活率為85%。見表2，圖4。

表2 噬菌體治療肺炎小鼠的實驗分組及各組小鼠結(jié)局觀察

圖4 不同感染復(fù)數(shù)（MOI）的小鼠存活影響

3 討論

肺炎克雷伯菌是院內(nèi)感染常見菌，伴隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，臨床上出現(xiàn)了越來越多的多重耐藥肺炎克雷伯菌。細菌常對多種抗生素耐藥，毒力強，感染預(yù)后較差，病死率高（嚴重病例達50%）［3］。肺炎克雷伯菌容易耐藥，因此要在體內(nèi)消滅耐藥性肺炎克雷伯菌的最佳思路，就是找到一種可以裂解且抑制表面生物被膜形成的特異性生物。研究表明，相對于游離細菌，生物被膜中的細菌可以抵抗10～1 000 倍濃度的抗生素［4］。本研究從檢驗科收集的患者痰液中提取并提純獲得一株克雷伯菌，并進行擴增得到穩(wěn)定菌液，耐藥性檢測表明其為一株多重耐藥肺炎克雷伯菌，符合耐藥菌的一般特點，能夠產(chǎn)超廣譜B-內(nèi)酰胺酶，對臨床首選的A 類抗生素均已產(chǎn)生耐藥性，可用于進行耐藥菌的進一步實驗檢測。在體外和體內(nèi)，通過控制感染復(fù)數(shù)作為變量，研究噬菌體對于不同感染復(fù)數(shù)的細菌感染肺炎的治療和體外裂解效果。評估噬菌體在治療細菌性肺炎時的作用。

耐藥肺炎克雷伯菌感染首次出現(xiàn)在亞洲，隨后難以治療的耐藥性疾病在世界各國均有發(fā)現(xiàn)［5］，造成的不良社會經(jīng)濟影響不容小覷［6］。人們曾經(jīng)嘗試使用免疫增強的手段實現(xiàn)對其的防治，但結(jié)果卻不盡如人意的，浪費了大量的醫(yī)療資源并對患者的生命健康和家庭帶來了重負。

烈性噬菌體能導(dǎo)致生物被膜的降解，然后通過吸附識別和溶菌迅速導(dǎo)致細菌的裂解死亡。噬菌體是高效的滅菌生物，具有特異性，且繁殖快。這種特點就決定了噬菌體可治療肺炎克雷伯菌感染所導(dǎo)致的肺炎，是良好的生物滅菌劑［7］，并且不會傷及人體內(nèi)其他菌類。噬菌體有著較長的細菌性疾病治療歷史［8］，近年來由于出現(xiàn)大量耐藥菌，噬菌體的研究又重新回到了科研熱點中。查閱國內(nèi)外文獻［9-10］，目前僅有少量研究是關(guān)于噬菌體和多重耐藥肺炎克雷伯菌所致的肺組織感染的［11-14］。探討噬菌體對氣管插管表面細菌生物被膜的作用，以及噬菌體不同給藥途徑對小鼠肺炎作用的研究在國內(nèi)尚無相關(guān)報道。本研究以我院檢驗科分離的多重耐藥肺炎克雷伯菌肺炎亞種為宿主菌，從醫(yī)院污水處理站處理前污水中分離相應(yīng)的噬菌體，對其體外和體內(nèi)殺菌能力進行評估，并對比不同 給藥濃度進行體內(nèi)殺菌試驗的療效。探索多重耐藥肺炎克雷伯菌肺炎的治療新途徑。

本研究采用敏感的噬菌體來破壞多重耐藥肺炎克雷伯菌形成的生物被膜，并通過不同給藥 濃度治療該細菌導(dǎo)致的小鼠肺炎，觀察其療效。本研究解決的技術(shù)關(guān)鍵在于對噬菌體進行分離、篩選和擴增。因此在分離噬菌體后，應(yīng)采用相應(yīng)的細菌進行篩選、驗證，并將噬菌體與之共同培養(yǎng)，進行純化、增殖，獲得足量的噬菌體。實驗結(jié)果顯示，體外實驗的吸光度值表明噬菌體在體外具有很好的裂解效果。噬菌體對小鼠感染肺炎的保護作用與感染復(fù)數(shù)呈正相關(guān)。

本研究的結(jié)果提示了噬菌體可用于臨床治療多重耐藥肺炎克雷伯菌感染。探究了噬菌體治療多重耐藥菌感染引起小鼠肺炎的實際應(yīng)用效果，說明噬菌體對多重耐藥菌引起的感染具有治療潛力，為今后多重耐藥肺炎克雷伯菌肺炎提供了治療新途徑。