周雷罡，馬銀松，喻何云，袁銘銘，吳西

江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評價重點實驗室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術研究中心，江西 南昌 330029

連錢草為唇形科植物活血丹Glechoma longituba（Nakai）Kupr 的干燥地上部分。春至秋季采收，除去雜質(zhì)，曬干。主要產(chǎn)于河南、安徽、江西、江蘇等地，具有利濕通淋，清熱解毒的功效，臨床用于石淋、熱淋、瘡癰腫痛、濕熱黃疸、跌打損傷［1］?，F(xiàn)代藥理研究證實，連錢草的急性毒性很小，具有利尿利膽、調(diào)血脂、溶石、降血糖、抗炎、抗菌、抗癌等作用［2-4］。連錢草的化學成分主要是黃酮類、有機酸類、萜類等化合物［5-9］。

現(xiàn)行質(zhì)量標準收載于2020 年版《中國藥典》一部［1］，建立了木犀草素和連錢草對照藥材為指標的薄層鑒別。但木犀草素存在于多種藥用植物中，專屬性較差，不能全面準確地反映連錢草的內(nèi)在質(zhì)量，同時現(xiàn)行標準無含量測定項。同時以連錢草作為君藥的中成藥排石顆粒在2020 年版《中國藥典》一部［1］中新增了以迷迭香酸含量作為連錢草質(zhì)控指標的含量測定項。迷迭香酸有著廣泛的生物學活性，如抗菌、抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗血栓及對細胞的保護作用［10-11］。同時排石顆粒標準保留了熊果酸的薄層鑒別方法，而作為原藥材的連錢草卻無含量指標以及熊果酸的薄層鑒別。以上情況表明，現(xiàn)有標準難以有效控制連錢草的質(zhì)量，影響連錢草及其相關產(chǎn)品臨床用藥的有效性和安全性，有必要對連錢草的標準進行提高，為此根據(jù)2022 年度國家藥典委標準提高任務書要求，新增了熊果酸的薄層鑒別和迷迭香酸的含量測定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

安捷倫公司Agilent 1260 型高效液相色譜儀；賽多利斯公司Sartorius BT25S 電子天平（十萬分之一），Sartorius BSA124S-CW 電子天平（萬分之一）。

1.2 試劑和試藥

對照藥材連錢草（批號121386-201302），對照品熊果酸（批號110742-201823）和迷迭香酸（批號111871-201414，含量98.1%）均購自中國食品藥品檢定研究院；硅膠G 薄層板（青島海洋化工有限公司生產(chǎn)）；水為娃哈哈飲用純凈水；乙腈為色譜純。26 批連錢草藥材由企業(yè)提供及課題組實地采收，詳細情況見表1。

表1 26批連錢草詳細信息

2 方法與結果

2.1 薄層鑒別

取連錢草粉末0.5 g，加入乙酸乙酯40 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。另取連錢草對照藥材0.5 g，同法制成對照藥材溶液。再取熊果酸對照品，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法［《中國藥典》2020 年版四部（通則0502）］試驗，吸取供試品溶液和對照藥材溶液各2～5 μL 對照品溶液5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸（3∶1∶0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置日光下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，見圖1。

圖1 熊果酸TLC色譜圖

2.2 含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備精密稱取迷迭香酸對照品23.55 mg，置50 mL 量瓶中，加50%甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液，精密量取對照品貯備液1.0 mL，置10 mL 量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得迷迭香酸對照品溶液（含量為0.046 2 mg/mL）。

2.2.2 供試品溶液制備取連錢草藥材粉末（過3 號篩）約0.5 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流45 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 色譜條件采用資生堂waters SunFire C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫30 ℃，以乙腈-0.1%磷酸溶液（21∶79）為流動相，流速1.0 mL/min，檢測波長330 nm，進樣量10 μL。在上述色譜條件下，供試品色譜中與對照品對應的吸收峰的理論板數(shù)不低于3 000，且空白溶劑無干擾，色譜圖見圖2。

圖2 系統(tǒng)適用性色譜圖：A.對照品；B.連錢草藥材；C.空白溶劑

2.2.4 線性關系的考察精密量取“2.2.1”項下對照品貯備液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，分別置10 mL 量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得標準系列對照品溶液。按“2.2.3”項下色譜條件進樣測定，以濃度為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸，繪制標準曲線，回歸方程為y=0.134x-30.499，r=0.999 9。結果表明迷迭香酸在4.62～231.03 μg/mL 之間呈良好的線性。

2.2.5 精密度試驗取“2.2.1”項下對照品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件重復進樣測定6 次，測得迷迭香酸峰面積RSD 為0.26%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗取同一份連錢草供試品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h 進樣測定，測得迷迭香酸峰面積RSD 為0.28%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復性試驗取同一批連錢草樣品（批號220712），按“2.2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件進樣測定，測得迷迭香酸含量為4.428 mg/g，RSD 為0.48%，表明方法重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗取已知含量的同一批連錢草樣品（批號220712）6 份，每份約0.25 g,精密稱定，精密加入含迷迭香酸對照品（0.023 1 mg/mL）的50%甲醇溶液50 mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件進樣測定，計算回收率，結果回收率良好，結果見表2。

表2 回收率試驗結果

2.2.9 色譜柱耐用性考察取同一批連錢草樣品（批號220712）約0.5 g，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別采用waters SunFire C18（250 mm×4.6 mm,5 μm），InertSustainSwift C18（250 mm×4.6 mm,5 μm），YMC-Pack C18（250 mm×4.6 mm,5 μm）三種不同的色譜柱進行測定，結果迷迭香酸峰在各色譜柱均分離良好，測得含量無明顯差異。

2.2.10 含量測定分別取26 批連錢草樣品各0.5 g，每批取3 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，并按“2.2.3”項下色譜條件進行分析，測定峰面積，用外標法計算出迷迭香酸的含量，結果含量在0.827～12.484 mg/g 之間，見表3。

表3 樣品含量測定結果（n=3） mg/g

3 討論

3.1 熊果酸的薄層鑒別

本研究建立的連錢草中熊果酸的薄層色譜，方法簡便，斑點清晰，分離度好，專屬性強。且相對于《中國藥典》中相關熊果酸薄層色譜的展開劑三氯甲烷、丙酮、甲苯等，本實驗采用的環(huán)己烷、乙酸乙酯更為低毒性，更為環(huán)保。

3.2 迷迭香酸的含量測定研究

由表3 可知，測得的26 批次連錢草藥材迷迭香酸平均含量為5.146 mg/g，限度按平均值的70%計算得3.60 mg/g。通過分析收集到的26 批藥材的信息，可以很明顯地發(fā)現(xiàn)二茬采收的連錢草藥材均不合格，頭茬藥材均符合規(guī)定，推測第二次采收時間與第一次采收時間間隔較短，藥材二次生長的時間還不夠，導致含量較低。

本試驗建立連錢草中熊果酸的薄層鑒別和迷迭香酸的含量測定方法，該方法簡便、可靠，能有效地提高連錢草的質(zhì)量控制水平。