段興漢,吳 峰,張素青,鮑 蕾,王紅芳,*

1 生物多樣性與生態(tài)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100875 2 東北虎豹國家公園保護(hù)生態(tài)學(xué)國家林草局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100875 3 北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,北京 100875

空間遺傳格局是物種在種群內(nèi)或種群間遺傳多樣性的空間分布格局,種群遺傳學(xué)過程是空間遺傳格局形成的基礎(chǔ),而景觀中斑塊、基質(zhì)的空間配置、物種性狀差異可能增加了空間遺傳格局的復(fù)雜性[1]。然而,在不同物種或者不同生境下,這一期望格局的強(qiáng)度卻存在較大變異,主要原因是景觀基質(zhì)可能影響種群間的功能連通度。多項(xiàng)研究表明,地理距離、地形、人造景觀、土壤類型、溫度、濕度等都對(duì)動(dòng)植物分布有顯著的影響[2—5]。因此,探究物種的空間遺傳格局,分析格局形成的過程,有效識(shí)別可能的基因流障礙,可為制定有效種群保護(hù)策略提供依據(jù)。

東北梅花鹿(Cervusnipponhortuloru)是我國僅存梅花鹿三個(gè)亞種之一,種群數(shù)量相對(duì)較大。主要分布于我國吉林省、黑龍江以及俄羅斯濱海邊疆區(qū)連片的廣大地區(qū)。然而東北梅花鹿的空間分布十分不均勻。在我國,東北梅花鹿種群密度最高的地區(qū)為吉林省琿春市境內(nèi)的中俄邊境線附近,而在其他大部分地區(qū)東北梅花鹿種群密度低[6]。梅花鹿作為食物鏈的初級(jí)消費(fèi)者,該物種對(duì)植物群落的結(jié)構(gòu)與功能具有很強(qiáng)的塑造作用[7]。此外,梅花鹿也是該地區(qū)旗艦物種東北虎(Pantheratigrisaltaica)、遠(yuǎn)東豹(Pantherapardusorientalis)主要獵物,大型有蹄類動(dòng)物的可獲得性與捕食者密度增加直接相關(guān)[8],因此梅花鹿對(duì)虎豹種群的分布與密度具有一定的限制作用。

本研究基于非損傷樣品對(duì)虎豹國家公園的梅花鹿進(jìn)行遺傳多樣性和空間遺傳格局分析,以期了解該種群現(xiàn)有遺傳多樣性水平以及影響其空間遺傳格局的環(huán)境因素和人為因素。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

本研究于2018年8月至2020年1月多次在東北虎豹國家公園東部的中俄邊境附近采集梅花鹿糞便樣品110份(圖1)。為了滿足本研究需要,本研究采取嵌套式采樣策略[9],即在大、中、小不同距離等級(jí)下確保采集到的一定數(shù)量的樣品。

圖1 梅花鹿糞便樣品分布圖Fig.1 Map of the sika deer fecal samples

糞便樣品采集時(shí)佩戴一次性聚乙烯手套(PE手套)或使用一次性筷子,為防止交叉污染,采樣工具用后即換。采集的樣品原則上僅采集新鮮的糞便。每堆糞便挑取5—8粒,裝入50ml離心管中,記錄全球定位系統(tǒng)(GPS)坐標(biāo),避光處理;為了更好保存糞便樣品中的DNA,需要對(duì)樣品盡快干燥處理:(1)倒入適量95%無水乙醇,液面高度以沒過管內(nèi)樣品為宜;(2)浸泡24h后將無水乙醇倒出,加入足量變色硅膠,加入無水乙醇或變色硅膠后,樣品可以常溫保存,否則應(yīng)當(dāng)?shù)蜏鼗蚶鋬霰４?(3)每隔一周檢查離心管內(nèi)硅膠的顏色,應(yīng)在硅膠完全變紅之前及時(shí)更換,多數(shù)樣品在更換1—3次即可保持硅膠不再變色。

樣品質(zhì)量信息的現(xiàn)場判斷較為重要,因?yàn)闃悠吩叫迈r,DNA降解越少,質(zhì)量較差的樣品往往導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。在野外可根據(jù)如下標(biāo)準(zhǔn)判斷梅花鹿糞便樣品的新鮮程度:

a)分散程度。糞球不成堆分布的,形態(tài)大小明顯不同的幾堆糞便混雜在一起的,應(yīng)當(dāng)舍棄。

b)表面物理特征。新鮮糞便表面一般呈現(xiàn)黃色或深褐色,糞球形狀飽滿,表面光亮、黏滑,沒有裂紋,不長霉。糞便在野外暴露一定時(shí)間后表面一般會(huì)變黑、變硬,表面出現(xiàn)裂紋,裂紋越多說明在野外暴露時(shí)間越久。

c)軟硬程度。一般來說糞便越軟越新鮮。

d)被枯枝落葉、積雪等覆蓋的一般不新鮮,可根據(jù)降雪時(shí)間判斷糞便質(zhì)量。

e)梅花鹿臥跡內(nèi)或1m范圍內(nèi)、撥雪取食痕跡附近一般可尋獲糞便,因此可根據(jù)臥痕、咬痕、足跡等新鮮程度判斷糞便新鮮程度。

f)冬季采集的糞便一般都能夠滿足樣品DNA提取和分型的需要,但是冬季采集時(shí)要注意不要采集表面開裂、位于落葉層以下或與土壤黏連的糞便。

1.2 糞便基因組提取、個(gè)體鑒定

本研究使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit (QIAamp)進(jìn)行糞便基因組提取。為確認(rèn)糞便樣品所屬物種,選用Riaz等[10]開發(fā)的鹿科動(dòng)物通用引物12srRNA對(duì)糞便DNA進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列如下,F: TAG AAC AGG CTC CTC TAG;R: TTA GAT ACC CCA CTA TGC。PCR反應(yīng)體系為40μL:20μL 2×EasyTaq PCR SuperMix,0.8μL BSA,引物各0.8μL(10μMol),4μLDNA模板,加13.6μL超純水補(bǔ)足。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5min;94℃變性30s,51℃退火30s,72℃延伸30s,35個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。本研究測序和引物合成由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成。測序結(jié)果質(zhì)量使用Codoncode Aligner 6.0.2進(jìn)行檢測。利用美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行數(shù)據(jù)比對(duì)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/),設(shè)置匹配度100%,確定糞便樣品所屬物種。

1.3 微衛(wèi)星的篩選和分型

本研究根據(jù)過去使用率較高的有蹄類動(dòng)物微衛(wèi)星序列,篩選出9對(duì)穩(wěn)定擴(kuò)增且多態(tài)性較高的引物(表2)。擴(kuò)增體系:Takara Taq HS 0.5μL,10X PCR Buffer (Mg2+Plus) 2μL,dNTP Mixture 2μL,引物各0.5μL,BSA 1μL,DNA模板 3μL,加超純水至20μL。擴(kuò)增程序:95℃預(yù)變性5min;95℃變性30s,退火30s,72℃延伸1min,進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72℃終延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用ABI 3730測序儀測序。微衛(wèi)星數(shù)據(jù)的讀取和校正在Genemapper 4.0中完成。

表1 各種變量對(duì)梅花鹿種群遺傳格局影響的假設(shè)Table 1 Hypothesis of the influence of different variables on genetic pattern of sika deer population

表2 野生東北梅花鹿種群9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)分析Table 2 The analysis of 9 microsatellites locus in wild sika deer population

由于糞便DNA質(zhì)量差,等位基因容易丟失。為了避免這種現(xiàn)象,本研究采用多管擴(kuò)增法(multi-tube PCR)進(jìn)行個(gè)體基因型確定[11],基本方法如下:雜合子由至少兩次相同的分型結(jié)果確定,而純合子則由3次相同分型結(jié)果確定。每份樣品每個(gè)位點(diǎn)先進(jìn)行4次重復(fù)擴(kuò)增,判斷基因型結(jié)果;對(duì)仍然無法確定分型情況的樣品再進(jìn)行3次獨(dú)立擴(kuò)增,判斷基因型。此后仍無法確定基因型的樣品,則將該個(gè)體的該位點(diǎn)處理為缺失數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1遺傳多樣性

利用GIMLET 1.3.1[12]計(jì)算微衛(wèi)星位點(diǎn)的鑒別能力:同一性概率(PID)和同懷群同一性概率(PIDsibling);使用MICRO-CHECKER[13]檢查各微衛(wèi)星位點(diǎn)是否存在無效等位基因、等位基因丟失的現(xiàn)象。使用CERVUS和FSTAT 2.9.3.2[14]計(jì)算位點(diǎn)等位基因數(shù)量(Na)、有效等位基因數(shù)量(Ne)、觀測雜合度(HE)、期望雜合度(HO)、多態(tài)信息含量(PIC)等種群遺傳學(xué)指標(biāo);使用Genepop 3.4[15]檢查每個(gè)位點(diǎn)的哈溫平衡和連鎖平衡。

使用CERVUS[16]進(jìn)行個(gè)體鑒別。

1.4.2聚類分析

使用STRUCTURE 2.3.4[17]軟件對(duì)鑒定的所有梅花鹿個(gè)體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。計(jì)算過程采用混合祖先模型和等位基因關(guān)聯(lián)模型,開始時(shí)的預(yù)迭代次數(shù)為105,馬爾可夫鏈蒙特卡羅迭代(MCMC)重復(fù)次數(shù)為104次,K值范圍定為K=1—6,對(duì)每個(gè)K進(jìn)行20次重復(fù)運(yùn)算。利用Structure Harvester最大似然值以及ΔK隨K值的變化,綜合判斷梅花鹿種群的最優(yōu)分組。

使用GenAlEx 6.5[18]對(duì)鑒定的所有梅花鹿個(gè)體做主坐標(biāo)分析。

1.4.3空間自相關(guān)分析

有限的擴(kuò)散能力常常導(dǎo)致種群在遺傳距離上具有顯著的空間自相關(guān)模式[19]。本研究首先使用MSA 4.05[20]軟件計(jì)算個(gè)體兩兩之間的遺傳距離,距離指標(biāo)為共有等位基因比例。個(gè)體間的地理距離,以及空間自相關(guān)檢驗(yàn)都在GenAIEx中進(jìn)行。空間自相關(guān)檢驗(yàn)的置換數(shù)設(shè)置為999次。

1.4.4空間變量對(duì)遺傳分化影響分析

本研究主要分析了海拔、坡度、坡向、地表起伏率(Surface Relief Ratio, SRR)、人類干擾5個(gè)變量對(duì)梅花鹿種群遺傳結(jié)構(gòu)的影響。這5個(gè)變量多被認(rèn)為與大中型哺乳動(dòng)物擴(kuò)散阻礙相關(guān)[21]。前四個(gè)變量來自于分辨率30m×30m的DEM 數(shù)據(jù)(http://www.usgs.gov/)。人類干擾使用道路、居民點(diǎn)圖層進(jìn)行模擬。

各種環(huán)境變量的阻力模型通過ArcGIS 10.1中的“空間分析工具”下的“重分類工具”建立。

(1)海拔:隨海拔升高溫度降低,因此海拔可能影響梅花鹿的食物可獲得性,對(duì)梅花鹿來說可能存在一個(gè)最適海拔。本研究利用逆高斯方程模擬[22]海拔高度對(duì)擴(kuò)散的影響:

海拔高度分為9組,每組間距100m。Rmax為最大阻力值,分別設(shè)為2、10、100、500、1000。Eopt為梅花鹿擴(kuò)散最適海拔高度,分別設(shè)為200、300、400、500m。ESD分別設(shè)為50、100、200m?；谝陨?個(gè)參數(shù),建立60個(gè)海拔高度阻力模型。

(2)坡度:從運(yùn)動(dòng)時(shí)的能量消耗角度推測,梅花鹿可能更傾向于利用較緩坡度。本研究用逆高斯方程模擬坡度對(duì)梅花鹿擴(kuò)散的阻礙作用:

坡度分為9組,每組間距7°。Rmax為最大阻力值,分別設(shè)為2、10、100、500、1000,θopt為梅花鹿擴(kuò)散最適坡度,分別設(shè)為5°、10°、15°、20°、30°,θSD分別設(shè)為2°、5°、10°?；谝陨?個(gè)參數(shù),建立75個(gè)坡度阻力模型。

(3)坡向:坡向不同,溫度、濕度等微生境不同,從而可能影響梅花鹿的生境選擇和擴(kuò)散通道的選擇。用熱負(fù)荷指標(biāo)函數(shù)模擬坡向?qū)γ坊沟臄U(kuò)散阻礙[22]:

坡向分為9組,8組為坡向組,一組為平面組(-1°)。坡向組每組范圍為45°,平面組賦值為Rmax/2,其他按上述函數(shù)進(jìn)行賦值。Rmax分別設(shè)為2、10、100、500、1000,θopt分別設(shè)為0°、45°、90°、135°、180°、225°、270°、315°。x設(shè)為0.5、2、10。基于以上3個(gè)參數(shù),建立坡向阻力模型120個(gè)。

(4)地表起伏率:地表復(fù)雜程度將影響梅花鹿運(yùn)動(dòng)時(shí)的能量消耗,地形復(fù)雜程度越高,梅花鹿擴(kuò)散時(shí)的能量消耗越大。SRR對(duì)動(dòng)物擴(kuò)散的阻力由以下函數(shù)進(jìn)行模擬[22]:

R=(SRRx)×Rmax+1

建立SRR阻力模型之前,首先下載Geomorphometry and Gradient Metrics 2.0工具(https://github.com/jeffreyevans/GradientMetrics),并使用ArcCatalog加載至工具箱中,然后打開ArcMap,使用該工具中的Surface Relief Ratio工具對(duì)研究區(qū)域的DEM進(jìn)行重分類:分析窗口設(shè)置為“Circle”,半徑分別設(shè)置為2、10、25、50,分析單元為“Cell”。再對(duì)4個(gè)不同半徑的SRR柵格圖層分別進(jìn)行重分類,SRR值共分為10組,每組組距為0.1。Rmax分別設(shè)為2、10、100、500、1000,x分別為0.5、2、10。建立SRR阻力模型60個(gè)。

(5)建立人類干擾阻力模型6個(gè)。根據(jù)居民點(diǎn)、道路分布情況,首先在ArcMap中使用BufferWizard工具,對(duì)道路、村、鎮(zhèn)矢量分別設(shè)置1km、1.5km、3km緩沖區(qū);然后使用Union工具,將3個(gè)緩沖區(qū)圖層合并,在屬性表中新建一列,使用“Field calculator”將該列賦值為10,同時(shí)用同樣的方法將研究區(qū)矢量圖的該列賦值為1;再次使用Union工具將兩個(gè)圖層合并。最后使用“Circuitscape for Arcgis”工具,將矢量轉(zhuǎn)換為柵格格式。使用重分類功能,將不包含居民點(diǎn)和道路的柵格的阻力值設(shè)置為1,其他柵格的阻力值R分別設(shè)為2、10、100、250、500、1000。

(6)建立空間距離阻力模型1個(gè)。對(duì)DEM柵格進(jìn)行重分類,將所有柵格賦值為1,以便后續(xù)分析中排除空間自相關(guān)對(duì)遺傳距離的影響。

(7)利用生境適宜性模型建立15個(gè)阻力模型。首先使用MaxEnt 3.4.1[23]制作生境適宜性圖層,選取的變量為海拔、坡度、坡向、地表起伏率等4個(gè)環(huán)境變量以及與居民點(diǎn)距離、與省道距離2個(gè)人類干擾變量。這些變量數(shù)據(jù)來源及處理方法如上所述。考慮到變量間可能存在相關(guān)性影響模型精度,先對(duì)所有變量因子做相關(guān)性分析,去除相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值大于0.75的變量。共計(jì)379個(gè)梅花鹿出現(xiàn)點(diǎn)數(shù)據(jù)來源于梅花鹿糞便樣品坐標(biāo)以及本實(shí)驗(yàn)室近幾年紅外相機(jī)數(shù)據(jù)。本研究選擇線性、二次方、乘積和多拐點(diǎn)閾值關(guān)系等4種運(yùn)算方法的綜合運(yùn)用;由于測試樣本比例對(duì)模型預(yù)測精度有一定影響,所以本研究首先以不同的測試樣本比例進(jìn)行模擬,每個(gè)比例重復(fù)10次,篩選出平均AUC最高(25%,0.861)的一個(gè)生境適宜性圖層。

隨后依據(jù)該模型建立15個(gè)阻力模型。由于該圖層取值范圍為H=0—1,值越大代表生境適宜性越高,所以根據(jù)以下方式進(jìn)行重分類:

R=(1-H)x×Rmax+1

生境適宜性值共分為10組,每組組距為0.1。Rmax分別設(shè)為2、10、100、500、1000,x分別為0.5、2、10。

阻力模型建立完成后,使用Circuitscape for ArcGIS工具生成各變量的不同模型的阻力矩陣。計(jì)算模式為成對(duì)的模式、連接附近8個(gè)柵格。

使用R包ecodist[24]進(jìn)行偏曼特爾檢驗(yàn),在排除空間自相關(guān)(IBD)的影響后,分析遺傳距離(GD)和景觀阻力(LR)的相關(guān)性。可表示為GD-LR|IBD,其中GD為遺傳距離,LR為景觀變量阻力,IBD為空間自相關(guān)。對(duì)任一景觀變量模型進(jìn)行檢驗(yàn)時(shí),當(dāng)GD—LR|IBD的結(jié)果顯著,而GD—IBD|LR的結(jié)果不顯著時(shí),才認(rèn)定該模型能夠解釋個(gè)體間的遺傳變異模式[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 物種鑒定和微衛(wèi)星分型

使用12srRNA對(duì)110份糞便樣品進(jìn)行擴(kuò)增,其中101份樣品測序成功。通過基于局部比對(duì)算法的搜索工具(BLAST)分析,除了7份樣品為狍(Capreoluscapreolus)糞便外,其他94份樣品均為梅花鹿糞便樣品。利用Gimlet軟件計(jì)算發(fā)現(xiàn),這9對(duì)微衛(wèi)星位點(diǎn)的聯(lián)合識(shí)別分辨率較高。PIDunbiased=7.892×10-10,PIDbiased=1.468×10-9,PIDsibling=3.663×10-4;通過Cervus軟件進(jìn)行個(gè)體鑒別,在成功擴(kuò)增的87份樣品中,鑒別出86個(gè)個(gè)體。在所使用的9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中,所有位點(diǎn)都符合遺傳連鎖平衡,RT1、RM188、BM6506顯著的偏離哈溫平衡,且可能存在無效等位基因。由于這三個(gè)位點(diǎn)在梅花鹿種群遺傳多樣性研究中廣泛使用,且RT1和RM188具有較高的等位基因數(shù)量和遺傳多樣性,為個(gè)體鑒定提供了更精準(zhǔn)的信息,本研究保留這三個(gè)位點(diǎn)。

2.2 種群遺傳多樣性

本研究所使用的9對(duì)微衛(wèi)星的等位基因數(shù)量在4—11之間,共擴(kuò)增出68個(gè)等位基因(表2)。平均每個(gè)位點(diǎn)有7.56個(gè)等位基因,其中RT1等位基因最多,有11個(gè)等位基因,BM6506位點(diǎn)等位基因最少,有4個(gè)等位基因。這9個(gè)梅花鹿微衛(wèi)星位點(diǎn)平均多態(tài)信息含量(PIC)為0.683,除BM6506(PIC=0.410)之外,其余位點(diǎn)的多態(tài)信息含量都在0.631—0.798之間,由于PIC>0.5為高度多態(tài)性,0.25≤PIC≤0.5為中度多態(tài)性,因此,BM6506為中度多態(tài)性位點(diǎn),其余均為高度多態(tài)性位點(diǎn)。觀測雜合度位于0.346—0.886之間,平均觀測雜合度為0.689;期望雜合度位于0.472—0.842之間,平均期望雜合度為0.721。期望雜合度普遍高于觀測雜合度。

2.3 種群遺傳結(jié)構(gòu)

STRUCTURE得出聚類數(shù)量估計(jì)值。L(K)峰值出現(xiàn)在K=1(圖2),因此該地區(qū)梅花鹿最有可能的分群數(shù)量為K=1,當(dāng)K>1時(shí),種群中的個(gè)體被分到不同群的比例大致相當(dāng),說明本研究的目標(biāo)種群棲息的景觀中不存在顯著的屏障效應(yīng)。

圖2 采用貝葉斯聚類分析方法得到的聚類數(shù)量估計(jì)值 Fig.2 Estimated number of clusters inferred using Bayesian clustering analysisL(K)的峰值出現(xiàn)在K=1處

主坐標(biāo)分析(PCoA)表明(圖3),所有樣品點(diǎn)未形成明顯的聚集分布。結(jié)合STRUCTURE和PCoA結(jié)果,推測該地區(qū)沒有明顯的遺傳分組,該種群處于哈溫平衡。

圖3 梅花鹿種群的主坐標(biāo)分析Fig.3 Principal Coordinates (PCoA) Analysis of the sika deer population圖中各點(diǎn)為本研究的全部樣品

Ta:退火溫度 Annealing temperature;N:樣本量 Sample Size;Na:等位基因數(shù)量 No. Alleles;Ne:有效等位基因數(shù)量 No. Effective Alleles;PIC:多態(tài)信息含量 Polymorphic Information Content;HO:觀測雜合度 Observed Heterozygosity;HE為期望雜合度 Expected Heterozygosity;*代表該位點(diǎn)偏離哈溫平衡并且存在無效等位基因

2.4 空間自相關(guān)分析

對(duì)該地區(qū)東北梅花鹿種群85km范圍內(nèi)的空間自相關(guān)分析表明,該地區(qū)的梅花鹿出現(xiàn)一定的空間結(jié)構(gòu)。在第一個(gè)(0—5km,r=0.017,P=0.003)、第二個(gè)(5—10km,r=-0.009,P=0.043)空間等級(jí)表現(xiàn)為顯著的空間自相關(guān)系數(shù)。在0—85km內(nèi)的所有距離等級(jí)內(nèi),r值有正有負(fù),呈現(xiàn)明顯的波動(dòng)格局(圖4)。

圖4 梅花鹿種群空間自相關(guān)分析Fig.4 Spatial autocorrelation analysis of sika deer population

對(duì)該地區(qū)東北梅花鹿種群10km范圍內(nèi)的空間自相關(guān)分析表明,該地區(qū)的梅花鹿出現(xiàn)一定的空間結(jié)構(gòu)。在第1個(gè)(0—1km,r=0.043,P=0.002)、第9個(gè)(8—9km,r=-0.030,P=0.039)、第10個(gè)(9—10km,r=-0.025,P=0.016)空間等級(jí)表現(xiàn)為顯著的空間自相關(guān)系數(shù)。在0—10km內(nèi)的所有距離等級(jí)內(nèi),r值有正有負(fù),呈現(xiàn)明顯的波動(dòng)格局(圖4)。

2.5 空間變量對(duì)遺傳分化影響分析

利用ArcGIS建立共計(jì)336個(gè)阻力模型,其中海拔阻力模型60個(gè),坡度阻力模型75個(gè),坡向阻力模型120個(gè),地表起伏率阻力模型60個(gè),人類干擾阻力模型6個(gè),生境適宜性阻力模型15個(gè)。

在所有336個(gè)模型中,依據(jù)海拔、坡向、地表起伏率、人類干擾假設(shè)建立的246個(gè)阻力模型與遺傳距離之間的關(guān)系并不顯著(P>0.05)。在依據(jù)坡度假設(shè)建構(gòu)的75個(gè)阻力模型中,只有1個(gè)模型與遺傳距離有顯著的正相關(guān)關(guān)系(P<0.05,表3),該模型同時(shí)也是在控制空間自相關(guān)影響后,在所有模型中與遺傳距離相關(guān)性最高(r=0.088)的模型。綜合所有變量的15個(gè)生境適宜性模型阻力模型與遺傳距離的關(guān)系也都不顯著。

表3 排除空間自相關(guān)影響后最佳阻力模型Table 3 Best resistance models when partialling out the effect of IBD

3 討論

3.1 遺傳多樣性

遺傳多樣性是衡量生物種群健康程度的一項(xiàng)重要指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn),虎豹國家公園梅花鹿種群每個(gè)位點(diǎn)平均有7.56個(gè)等位基因,平均觀測雜合度為0.689,平均期望雜合度為0.721。梅花鹿各地區(qū)亞種的遺傳多樣性已有許多報(bào)道(表4),劉鑫鑫[30]、王美楠[31]、朱明月[32]的目標(biāo)種群均為野生東北亞種,且采樣點(diǎn)與本研究采樣區(qū)域臨近,均位于東北虎豹國家公園內(nèi)或臨近區(qū)域。本研究期望雜合度數(shù)值略低于或等于以上三項(xiàng)研究。東北梅花鹿在琿春保護(hù)區(qū)、汪清保護(hù)區(qū)、黑龍江綏陽老爺嶺保護(hù)區(qū)等地呈現(xiàn)連續(xù)分布的格局,該地區(qū)沒有阻礙梅花鹿擴(kuò)散的高速公路、大型山脈或大型河流。同時(shí),各項(xiàng)研究采樣時(shí)間也在5年之內(nèi),可認(rèn)為該地區(qū)梅花鹿種群沒有較大波動(dòng)。

表4 不同地區(qū)野生梅花鹿基于微衛(wèi)星的遺傳多樣性比較Table 4 Comparison of genetic diversity based on microsatellite of wild sika deer in different regions

通過與其他地區(qū)梅花鹿亞種對(duì)比發(fā)現(xiàn),東北梅花鹿期望雜合度普遍高于其他亞種(表4)。東北梅花鹿可能比其他地區(qū)梅花鹿亞種保存有更多的遺傳多樣性。

棲息地范圍以及生境質(zhì)量可能是影響梅花鹿遺傳多樣性的一個(gè)重要因素。我國境內(nèi)的野生東北梅花鹿種群靠近中俄邊境線,主要分布在東北虎豹國家公園東部地區(qū)。而在俄羅斯一側(cè)的濱海邊疆區(qū)(Primorsky Krai)存在著西南、中部、東南等3個(gè)相互聯(lián)系著的大型梅花鹿種群,其中,西南種群分布范圍位于中俄邊境附近[35]。經(jīng)粗略估計(jì),俄羅斯梅花鹿種群的分布面積約為中國境內(nèi)野生東北梅花鹿分布區(qū)的17倍。中國的梅花鹿種群很可能是俄羅斯一側(cè)梅花鹿的擴(kuò)散種群。同時(shí),俄羅斯濱海邊疆區(qū)人煙稀少,人類對(duì)生態(tài)環(huán)境的干擾較小,有利于梅花鹿種群的繁衍和擴(kuò)散。更大的分布面積和更小的人類干擾則意味著可以供養(yǎng)更大的梅花鹿種群,就可能會(huì)產(chǎn)生較高的遺傳多樣性。

在中國的其他梅花鹿分布區(qū),梅花鹿原有生境逐漸被人類擠占,棲息地破碎化不斷加劇。例如,梅花鹿四川亞種種群被限制在四川若爾蓋縣凍列、崇爾、熱爾、占哇、降扎5個(gè)地區(qū)[36];梅花鹿華南亞種種群分布區(qū)被分割為位于江西、安徽和浙江的桃紅嶺、天目山、黃袞山、大會(huì)山等多個(gè)相互隔離的區(qū)域內(nèi)[37]。

3.2 遺傳結(jié)構(gòu)及影響因素分析

通過分析該種群的遺傳結(jié)構(gòu)可知,本研究區(qū)梅花鹿種群沒有明顯的遺傳結(jié)構(gòu),這可以由研究區(qū)范圍內(nèi)的地理、水文、人類干擾情況所解釋。該地區(qū)不存在大型山脈、大型河流和高等級(jí)的道路,因此也沒有能夠影響梅花鹿擴(kuò)散的客觀障礙。在梅花鹿分布區(qū)內(nèi),雖然存在一些硬化道路,但在野外可經(jīng)常觀察到有鹿群穿越。此外,保護(hù)區(qū)內(nèi)的居民點(diǎn)規(guī)模較小,也不太可能影響梅花鹿擴(kuò)散。

對(duì)該地區(qū)東北梅花鹿種群10km范圍內(nèi)的空間自相關(guān)分析表明,在第1個(gè)(0—1km)、第9個(gè)(8—9km)、第10個(gè)(9—10km)空間等級(jí)表現(xiàn)為顯著的空間自相關(guān)系數(shù),而其他距離等級(jí)的個(gè)體之間沒有顯著的相關(guān)關(guān)系。這說明遺傳相關(guān)性僅存在于臨近的個(gè)體之間。據(jù)此可推測,該地區(qū)梅花鹿擴(kuò)散距離為1km左右。

利用GPS項(xiàng)圈方法,Kim等[38]得出韓國俗離山國家公園的梅花鹿的年度家域面積為(2.24±1.50)km2;Yu[39]在日本日光國立公園測得雄鹿夏季家域面積(1.93±0.51)km2,雌鹿夏季家域面積(1.12±0.57)km2;而Takafumi[40]發(fā)現(xiàn)日本釧路濕地的梅花鹿平均家域面積為(6.8±1.8)km2。有研究表明,梅花鹿家域面積隨著單位面積內(nèi)個(gè)體數(shù)量的增加而減小。雖然梅花鹿存在季節(jié)性遷徙現(xiàn)象,但是梅花鹿一般在生長季又會(huì)遷回并利用原來的棲息地,具有較強(qiáng)的家域固定性[41],因此,梅花鹿在交配時(shí)可能也會(huì)選擇空間臨近的個(gè)體。本研究結(jié)果在一定程度上與前人研究相符。

在梅花鹿的棲息地,除空間距離以外,還有很多其他環(huán)境因素可潛在影響梅花鹿種群的遺傳模式。過去大量研究集中于梅花鹿的生境選擇偏好,而基本沒有研究探討環(huán)境因素對(duì)梅花鹿遺傳格局的影響。本研究中,只有坡度被證明與該地區(qū)梅花鹿種群遺傳多樣性的空間格局相關(guān)。對(duì)梅花鹿生境選擇和占域研究表明,梅花鹿傾向于利用坡度小于25°的區(qū)域[42],坡度平緩的區(qū)域,梅花鹿的占域率也相對(duì)較高[43]。這與梅花鹿生存策略相一致。梅花鹿傾向于在緩坡進(jìn)行求偶、交配等活動(dòng),為了節(jié)約能量,梅花鹿也傾向于從平緩地帶擴(kuò)散。

納入研究的其他幾個(gè)變量被認(rèn)為是影響動(dòng)物種群遺傳模式的潛在因素,如Ma等[21]發(fā)現(xiàn)地表起伏率和坡向影響了秦嶺大熊貓的遺傳格局;美洲旱獺的遺傳格局受到海拔、道路、樹木胸高直徑、植被覆蓋等因素的影響[44]。同時(shí),河流、坡向、水系等因素對(duì)美洲鼠兔種群的基因流造成顯著影響[22]。然而,當(dāng)棲息地高度連接或棲息地與非棲息地之間的阻力差異較小,即景觀結(jié)構(gòu)無法對(duì)基因流造成限制時(shí),往往無法檢測到景觀遺傳效應(yīng)[45]。

本研究雖然為每個(gè)變量構(gòu)建一系列不同的阻力模型,但仍然未能探明其余變量與梅花鹿遺傳格局的相關(guān)性。其他幾個(gè)環(huán)境變量對(duì)梅花鹿遺傳格局的影響可能受到遺傳取樣策略、景觀要素分布格局等因素的共同影響。由于國家公園西部梅花鹿分布較為稀少,糞便采集難度大,因此本研究未能將研究區(qū)向西拓展,未能將國家公園西部更大范圍、更為復(fù)雜的各種環(huán)境特征納入景觀遺傳學(xué)分析中,客觀限制了本研究的深度和廣度。Manel等[46]研究表明,樣本量的多少以及樣本的空間布局將極大地影響后續(xù)空間統(tǒng)計(jì)方法檢測模式的能力,非最佳采樣方案需要更高的樣本量。此外,有關(guān)模擬研究證明,一種景觀變量在棲息地和非棲息地間若存在較高的對(duì)比度,則對(duì)該變量對(duì)種群遺傳的影響的檢測將更容易[47],而本研究所在區(qū)域未見有明顯的邊界將梅花鹿種群相互分隔開來。

遺傳位點(diǎn)取樣的偏差也可能引起檢驗(yàn)偏差。當(dāng)微衛(wèi)星位點(diǎn)存在無效等位基因時(shí),即在該位點(diǎn)存在不能成功擴(kuò)增的等位基因,一方面可能低估群體的遺傳多樣性,另一方面也容易使親緣關(guān)系分析結(jié)果產(chǎn)生偏差。盡管如此,本文的遺傳多樣性估計(jì)結(jié)果基本和文獻(xiàn)報(bào)道一致(表4)。因此,盡管少部分使用的微衛(wèi)星位點(diǎn)存在無效等位基因?qū)Y(jié)果存在影響,但這種影響是有限的。

若想進(jìn)一步驗(yàn)證梅花鹿的擴(kuò)散是否傾向于避開陡坡或與其他變量相關(guān),研究可結(jié)合無線電項(xiàng)圈技術(shù)以及運(yùn)動(dòng)生理學(xué)相關(guān)研究,如將由項(xiàng)圈得到實(shí)際運(yùn)動(dòng)路徑與模型模擬路徑進(jìn)行比較分析,或從生理學(xué)角度探討穿越不同景觀要素時(shí)給動(dòng)物帶來的能量損耗。為進(jìn)一步研究東北虎豹國家公園各種環(huán)境變量對(duì)動(dòng)物遺傳格局的影響,可選擇旗艦物種東北虎、東北豹,或全域分布的狍、野豬等作為研究對(duì)象,可進(jìn)一步為野生動(dòng)物擴(kuò)散廊道設(shè)計(jì)提供指導(dǎo)。高通量測序技術(shù)的發(fā)展為檢測大量遺傳標(biāo)記與環(huán)境變量之間的關(guān)聯(lián)提供技術(shù)支撐,景觀基因組學(xué)相關(guān)方法將彌補(bǔ)傳統(tǒng)景觀遺傳學(xué)方法的不足,可以更加高效和準(zhǔn)確地檢測動(dòng)物種群的微進(jìn)化格局。