劉曉然，李志齊，李雅娜，姜文國(guó)，夏振紅

濱州醫(yī)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264003

2 型糖尿病是世界上發(fā)病率持續(xù)上升的流行病之一[1-2]，其特征是由胰腺β 細(xì)胞的進(jìn)行性丟失或胰島素抵抗和高胰島素血癥誘導(dǎo)的高血糖[3]，這與肥胖、氧化應(yīng)激和炎癥密切相關(guān)[4-6]。胰島素抵抗主要發(fā)生在肌肉、脂肪和肝臟組織細(xì)胞中，胰島素抵抗導(dǎo)致細(xì)胞攝取葡萄糖減少[7-8]；在肝細(xì)胞中，胰島素抵抗導(dǎo)致糖異生和葡萄糖輸出增加[9]。隨著2 型糖尿病的加重，由于糖脂毒性β 細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，產(chǎn)生胰島素的能力逐漸降低[10]。2 型糖尿病可引起多種發(fā)癥，包括糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病和糖尿病心血管功能障礙等疾病[11]，因此糖尿病患者的需求不僅要控制血糖，還要預(yù)防和治療由于長(zhǎng)期高血糖引起的并發(fā)癥。

目前臨床上有許多治療2 型糖尿病的藥物，但這些藥物在降血糖的同時(shí)，具有一些不良反應(yīng)[12]。此外，糖尿病并發(fā)癥的發(fā)展并未得到完全根治，因此開(kāi)發(fā)新的、更有效和更安全的藥物以治療2 型糖尿病及其并發(fā)癥的需求仍然存在，據(jù)報(bào)道天然化合物及其有效成分在2 型糖尿病的防治中不良反應(yīng)少、療效穩(wěn)定、可長(zhǎng)期使用，還通過(guò)多靶標(biāo)、多途徑調(diào)節(jié)代謝紊亂，改善葡萄糖穩(wěn)態(tài)。因此，一些具有降血糖活性的中藥越來(lái)越受到人們的關(guān)注。

補(bǔ)骨脂已被用于治療多種疾病，包括癌癥、炎癥性疾病、神經(jīng)退行性疾病等。補(bǔ)骨脂提取物通過(guò)抗凋亡和抗纖維化功能降低糖尿病的糖毒性，改善糖尿病腎病[13-14]。補(bǔ)骨脂乙素是一種從補(bǔ)骨脂種子中提取的黃酮類(lèi)化合物，傳統(tǒng)上用作膳食成分，類(lèi)黃酮對(duì)糖尿病具有多重保護(hù)作用[15]，補(bǔ)骨脂乙素作為黃酮類(lèi)的化合物，可能對(duì)2 型糖尿病產(chǎn)生有益影響。研究表明，補(bǔ)骨脂乙素具有抗菌、抗炎、抗癌、抗結(jié)核和抗氧化活性[16]；補(bǔ)骨脂乙素可以通過(guò)核因子-κB（NF-κB）通路抑制糖尿病大鼠腎炎，改善糖尿病大鼠的腎損傷[17]；補(bǔ)骨脂乙素還可以抑制脂肪細(xì)胞和斑馬魚(yú)體內(nèi)的脂質(zhì)積聚[18]，表明補(bǔ)骨脂乙素和2 型糖尿病和脂質(zhì)代謝有一定的相關(guān)性，但補(bǔ)骨脂乙素治療2 型糖尿病尚缺乏相關(guān)報(bào)道。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)作為樣本，并使用網(wǎng)絡(luò)可視化工具分析和發(fā)現(xiàn)潛在的藥物和疾病靶點(diǎn)，以預(yù)測(cè)藥物的潛在作用靶點(diǎn)和途徑，揭示中藥或其復(fù)雜成分的作用機(jī)制。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)分析以揭示補(bǔ)骨脂乙素在2 型糖尿病治療中的潛在作用，探究補(bǔ)骨脂乙素在2 型糖尿病治療中的作用機(jī)制，在細(xì)胞水平構(gòu)建胰島素抵抗細(xì)胞模型并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為補(bǔ)骨脂乙素在2 型糖尿病治療中的應(yīng)用提供一個(gè)新的研究視角和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 補(bǔ)骨脂乙素作用靶點(diǎn)的獲取

采用 ECTM 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://tcmip.cn/ECTM/index.php），查找補(bǔ)骨脂的活性成分補(bǔ)骨脂乙素相應(yīng)的候選靶基因。將PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://Pub Chem.ncbi.nim.nih.gov）提供標(biāo)準(zhǔn)的補(bǔ)骨脂乙素的Canonical SMILES 格式，導(dǎo)入為“Homo sapiens”預(yù)設(shè)的SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.SwissTargetPrediction.ch）中，預(yù)測(cè)補(bǔ)骨脂乙素潛在目標(biāo)。整理補(bǔ)骨脂乙素作用靶點(diǎn)并刪除重復(fù)靶點(diǎn)。

1.2 疾病靶點(diǎn)的獲取

基于GeneCards 以“type 2 diabetes”為關(guān)鍵詞獲取與2型糖尿病相關(guān)的靶點(diǎn)，靶點(diǎn)根據(jù)“Relevance score”降序排列，通過(guò) MEDIAN 函數(shù)，保留Relevance score＞5.795 82 的靶點(diǎn)，通過(guò)查閱文獻(xiàn)補(bǔ)充靶點(diǎn)并刪除重復(fù)的靶點(diǎn)。

1.3 補(bǔ)骨脂乙素抗2 型糖尿病作用靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

將上述得到的補(bǔ)骨脂乙素作用的相關(guān)靶點(diǎn)以及2 型糖尿病相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入Venn 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html）中進(jìn)行交互分析，獲得交集靶點(diǎn)作為補(bǔ)骨脂乙素治療2 型糖尿病的作用靶點(diǎn)。

1.4 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將相互交集的靶點(diǎn)導(dǎo)入 STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://sting-db.org），計(jì)算蛋白相互網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，物種選“Homo sapiens”，以節(jié)點(diǎn)（node）和“邊”（edge）表示靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)程度。同時(shí)采用Cytoscape 3.9.1 軟件對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行拓?fù)浞治觯ㄟ^(guò)插件MCODE 進(jìn)行基因簇的分析，結(jié)合插件Cytohubba 的MCC 算法篩選核心靶標(biāo)。

1.5 富集分析

將關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov）做聚類(lèi)分析，并對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)所涉及的細(xì)胞功能（CC）、分子功能（MF）、生物功能（BP）進(jìn)行富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路分析。以P＜0.05 為閾值，完成關(guān)鍵靶點(diǎn)富集分析。通過(guò)微生信（http://bioinformatics.com.cn）平臺(tái)得出相應(yīng)的富集結(jié)果，根據(jù)P值將前20 個(gè)結(jié)果繪制氣泡圖和通路氣泡圖。

1.6 藥物與試劑

補(bǔ)骨脂乙素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，貨號(hào)20784-50-3）購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；二甲雙胍（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%，貨號(hào)1115-70-4）購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；棕櫚酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)97%，貨號(hào)57-10-3）購(gòu)自上海麥克林生化科技股份有限公司；DMEM 高糖液體培養(yǎng)基[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，貨號(hào)11995065]；DMEM 無(wú)糖培養(yǎng)基[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，貨號(hào)11966025]；胎牛血清（FBS）[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，貨號(hào)C0232]；胰島素（貨號(hào)11061-68-0）購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；熒光D-葡萄糖類(lèi)似物2-NBDG（貨號(hào)186689-07-6）購(gòu)自武漢安捷凱生物醫(yī)藥科技有限公司。

Western 及IP 細(xì)胞裂解液（碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)P0013J）；胰島素受體（INS-R）抗體（ImmunoWay Biotechnology Company，貨 號(hào)YT2361）；胰島素受體底物1（IRS1）抗體（沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司，貨號(hào)WL03123）；磷脂肌醇-3-激酶（PI3K）抗體（CellSignaling Technology,Inc，貨號(hào)4257S）；蛋白激酶B（Akt）抗體（Proteintech Group,Inc，貨號(hào)10176-2-AP）；Anti-葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（GLUT2）Rabbit pAb（沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司，貨號(hào)WL03363）。

1.7 胰島素抵抗細(xì)胞模型的建立、劑量確定及分組

1.7.1 胰島素抵抗細(xì)胞模型的建立 HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)條件：DMEM 培養(yǎng)基＋10%胎牛血清＋1%青-鏈霉素，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱。細(xì)胞貼壁培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度約為90%時(shí)，計(jì)數(shù)傳代于6 孔板培養(yǎng)皿中，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在細(xì)胞生長(zhǎng)處于對(duì)數(shù)期時(shí)，通過(guò)無(wú)糖DMEM 培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞12 h，接著用200 μmol/L 棕櫚酸處理細(xì)胞24 h。

1.7.2 細(xì)胞活性的檢測(cè) 按照1×104HepG2 個(gè)細(xì)胞/mL（100 μL/孔）的密度將細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板。設(shè)置對(duì)照組、DMSO 組、補(bǔ)骨脂乙素（4、8、10、12、14 μmol/L）組，每組7 個(gè)復(fù)孔。加藥物處理24 h 后，棄培養(yǎng)液，PBS 洗滌2 遍，使用DMEM培養(yǎng)基按照1∶10 比例稀釋CCK8 試劑，加CCK8后置于培養(yǎng)箱中作用30 min。后用酶標(biāo)儀（TECAN）檢測(cè)細(xì)胞在450 nm 處A值。

1.7.3 2-NBDG 檢測(cè)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取 按照1×104個(gè)細(xì)胞/mL（100 μL/孔）的密度將細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板。設(shè)置對(duì)照組、模型組、補(bǔ)骨脂乙素組、二甲雙胍組，每組7 個(gè)復(fù)孔。模型組、補(bǔ)骨脂乙素組、二甲雙胍組細(xì)胞按1.7.1 項(xiàng)下方法進(jìn)行胰島素抵抗誘導(dǎo)。補(bǔ)骨脂乙素組和二甲雙胍（200 μmol/L）組在胰島素抵抗模型基礎(chǔ)上分別加藥物處理24 h 后，棄培養(yǎng)液，PBS 洗滌2 遍，更換為含有1×10-6mol/L 胰島素的無(wú)糖DMEM 培養(yǎng)基處理10 min，更換至含50 nmol/L 2-NBDG 的無(wú)糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)30 min 后PBS 清洗2 次，最后每孔加100 μL PBS 溶液，用酶標(biāo)儀（TECAN）檢測(cè)細(xì)胞在475、550 nm 處的A值。

1.7.4 細(xì)胞的分組及加藥處理 胰島素抵抗細(xì)胞細(xì)胞模型隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍組、補(bǔ)骨脂乙素組。二甲雙胍組用200 μmol/L 二甲雙胍處理24 h，補(bǔ)骨脂乙素組用10 μmol/L 補(bǔ)骨脂乙素處理24 h，正常培養(yǎng)條件的HepG2 細(xì)胞作為對(duì)照組。

1.8 總RNA 提取和濃度測(cè)定

6 孔板每孔細(xì)胞中加入1 mL Trizol 裂解液，冰上裂解15 min；加200 μL 三氯甲烷劇烈振蕩，4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，取上清液；加入與上清等體積的異丙醇后混勻，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min 后棄上清液；加DEPC 水配制的75%乙醇洗滌RNA 沉淀；4 ℃、7 500 r/min 離心5 min 后棄上清液；RNA 沉淀晾至透明，根據(jù)沉淀的體積加適量DEPC 水充分溶解RNA。通過(guò)DEPC 水空白檢測(cè)，通過(guò)Nano 儀器（Nanodrop，美國(guó)）檢測(cè)RNA 濃度，260、280 nm 的吸光度（A）比值需在1.8～2.1。

1.9 RT-PCR 法檢測(cè) PI3K/Akt 信號(hào)通路相關(guān)mRNA 的水平

使用高容量cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Vazyme，HiScript?III.RT SuperMix）將RNA 逆轉(zhuǎn)成cDNA用于qPCR，在QuantStudio 3 Flex 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 系統(tǒng)（美國(guó)Thermo Fisher 公司）檢測(cè)相對(duì)基因表達(dá)，將mRNA 水平歸一化至Actin 表達(dá)水平，數(shù)據(jù)按qRT-PCR 熒光定量數(shù)據(jù)分析法計(jì)算2-ΔΔCt。檢測(cè)模型組與對(duì)照組細(xì)胞中PI3K/Akt 信號(hào)通路指標(biāo)mRNA 含量，并檢測(cè)補(bǔ)骨脂乙素干預(yù)后的變化。

1.10 Western blotting 檢測(cè)PI3K/Akt 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的水平

細(xì)胞加藥處理結(jié)束后加入 RIPA 裂解液、Cocktail 冰上裂解30 min 后將細(xì)胞碎片混懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，12 000 r/min，4 ℃離心20 min，取上清裝至離心管中以待檢測(cè)。使用BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒測(cè)定蛋白含量。取適量上清，加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，95 ℃蛋白變性10 min。電泳后，轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h。加入一抗（INS-R 按1∶1 000 稀釋?zhuān)琁RS1 按1∶1 500 稀釋?zhuān)珿LUT2 按1∶1 000 稀釋?zhuān)琍I3K 按1∶500 稀釋?zhuān)琾-PI3K 按1∶500 稀釋?zhuān)珹kt 按1∶1 000 稀釋?zhuān)琾-Akt按1∶1 000 稀釋?zhuān)珹ctin 按1∶1 000 稀釋?zhuān)? ℃孵育過(guò)夜后TBST 溶液洗3 遍，加入二抗（按1∶20 000 稀釋?zhuān)?，室溫孵? h。TBST 溶液3 遍，使用ECL 試劑盒進(jìn)行顯影。以Actin 為內(nèi)參，計(jì)算INS-R、IRS1、GLUT2、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用GraphPad Prism9 軟件用于所有數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以表示。使用雙尾、未配對(duì)的Student T檢驗(yàn)來(lái)評(píng)估兩組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，使用單因素方差分析（單因子方差分析）。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)骨脂乙素抗2 型糖尿病的相關(guān)靶點(diǎn)

通過(guò)PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取補(bǔ)骨脂乙素的化學(xué)結(jié)構(gòu)。從ECTM 數(shù)據(jù)庫(kù)、Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)和結(jié)合文獻(xiàn)挖掘方法收集到的基因刪除重復(fù)項(xiàng)后，共得到100 個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)；利用GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取了與2 型糖尿病相關(guān)的靶點(diǎn)共8 279 個(gè)。將收集到的補(bǔ)骨脂乙素靶點(diǎn)與2 型糖尿病疾病靶點(diǎn)交互分析，結(jié)果表明，補(bǔ)骨脂乙素對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)中有92 個(gè)與2 型糖尿病有關(guān)，見(jiàn)圖1。

圖1 補(bǔ)骨脂乙素作用靶點(diǎn)與2 型糖尿病疾病靶點(diǎn)相互取交集情況Fig.1 Intersection between isobavachalcone target and type 2 diabetes target

2.2 PPI 分析結(jié)果

將92 個(gè)重疊基因進(jìn)一步擬合到STRING 中，PPI 網(wǎng)絡(luò)（交互得分≥0.150），包含補(bǔ)骨脂乙素和2型糖尿病的共同目標(biāo)的86 個(gè)節(jié)點(diǎn)和379 個(gè)“邊”（圖2）。Cytoscape 3.9.1 軟件中插件MCODE 分析了具有MCODE 默認(rèn)值的整個(gè)網(wǎng)絡(luò)，這產(chǎn)生了3 個(gè)Score＞5 的模塊，即集群1（節(jié)點(diǎn)：16，得分：6.8）（圖3A），集群2（節(jié)點(diǎn)：16，得分：6.4）（圖3B），集群3（節(jié)點(diǎn)：6，得分：5.2）（圖3C）。其中使用Cytohubba 和最大團(tuán)中心性（MCC）算法作為潛在目標(biāo)預(yù)測(cè)的過(guò)濾條件，篩選了從2 個(gè)聚類(lèi)中提取的前38 個(gè)節(jié)點(diǎn)（圖3D～F）。在MCODE 和Cytohubba的篩選結(jié)果交叉后，獲得了35 個(gè)共同靶點(diǎn)，其中包括常見(jiàn)的雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、酪氨酸蛋白激酶（SRC）、磷脂酰肌醇激酶-3 催化亞單位α 基因（PIK3CA）、絲裂原激活蛋白激酶14（MAPK14）、酪氨酸激酶受體2（ERBB2）、低氧誘導(dǎo)因子-1（HIF1A）、間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子（MET）、碳酸酐酶9（CA9）等。

圖2 藥物與疾病共同靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 PPI network diagram of drug and disease common targets

圖3 補(bǔ)骨脂乙素治療2 型糖尿病核心靶點(diǎn)的篩選Fig.3 Screening of core targets of isobavachalcone for the treatment of type 2 diabetes

2.3 GO 分析和KEGG 富集分析結(jié)果

有177 個(gè)BP、28 個(gè)CC、54 個(gè)MF 和113 個(gè)KEGG 途徑滿足P＜0.05 的條件。KEGG 途徑富集分析揭示了與2 型糖尿病治療靶點(diǎn)密切相關(guān)的途徑，包括PI3K/Akt 信號(hào)通路、胰島素信號(hào)通路和2型糖尿病信號(hào)通路。在BP 分析中，靶基因主要富集于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白磷酸化的調(diào)節(jié)、參與跨膜受體酪氨酸激酶信號(hào)通路的調(diào)節(jié)以及炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)等。核膜、質(zhì)膜和細(xì)胞器包膜內(nèi)腔被發(fā)現(xiàn)參與CC富集分析，MF 分析發(fā)現(xiàn)靶點(diǎn)參與結(jié)合SH2 結(jié)構(gòu)域激活激酶活性、結(jié)合ephrin 受體參與細(xì)胞增殖活動(dòng)以及氧化還原反應(yīng)，見(jiàn)圖4。

圖4 補(bǔ)骨脂乙素35 個(gè)潛在治療2 型糖尿病靶點(diǎn)的GO 富集和KEGG 途徑富集分析Fig.4 GO enrichment and KEGG pathway enrichment analysis of isobavachalcone 35 potential therapeutic targets for type 2 diabetes

2.4 體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.4.1 補(bǔ)骨脂乙素最佳刺激濃度篩選 為了探尋補(bǔ)骨脂乙素最佳作用濃度，使用0、4、8、10、12、14 μmol/L 補(bǔ)骨脂乙素作用HepG2 細(xì)胞24 h，檢測(cè)細(xì)胞活力，與對(duì)照組相比，當(dāng)補(bǔ)骨脂乙素濃度為4、8、10 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞活力均沒(méi)有下降，當(dāng)濃度為12 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞活力開(kāi)始有顯著下降趨勢(shì)（P＜0.05），因此選擇干預(yù)濃度為4、8、10 μmol/L。當(dāng)補(bǔ)骨脂乙素濃度為10 μmol/L 時(shí)能顯著提高模型細(xì)胞的葡萄糖攝取能力（P＜0.01），因此后續(xù)研究選用補(bǔ)骨脂乙素的干預(yù)濃度為10 μmol/L，見(jiàn)圖5。

圖5 補(bǔ)骨脂乙素對(duì)HepG2 細(xì)胞活力及葡萄糖攝取能力的影響（，n=3）Fig.5 Effect of isobavachalcone on HepG2 cell viability and glucose uptake capacity (,n=3)

2.4.2 補(bǔ)骨脂乙素對(duì)胰島素抵抗細(xì)胞葡萄糖攝取能力的影響 與對(duì)照組相比，模型組HepG2 細(xì)胞攝取2-NBDG 的熒光強(qiáng)度顯著降低（P＜0.001）；與模型組比較，二甲雙胍組和補(bǔ)骨脂乙素組細(xì)胞熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)（P＜0.01）。二甲雙胍組和補(bǔ)骨脂乙素組顯著提高了棕櫚酸處理細(xì)胞后葡萄糖的攝取能力，見(jiàn)圖6。

圖6 葡萄糖的攝取能力的檢測(cè)結(jié)果（，n=3）Fig.6 Detection of 2-NBDG (,n=3)

2.5 補(bǔ)骨脂乙素對(duì)胰島素抵抗細(xì)胞模型PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA 表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，模型組INS-R、IRS1、GLUT2、PI3K、AktmRNA 水平均顯著降低（P＜0.05、0.01、0.001）。補(bǔ)骨脂乙素組INS-R、IRS1、GLUT2、PI3K、AktmRNA 的表達(dá)水平顯著高于模型組（P＜0.01、0.001），見(jiàn)圖7。

圖7 補(bǔ)骨脂乙素對(duì)胰島素抵抗細(xì)胞模型PI3K/Akt 信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA 表達(dá)的影響（，n=3）Fig.7 Effect of isobavachalcone on mRNA expression of PI3K/AKT signaling pathway in insulin resistant cell model (,n=3)

2.6 補(bǔ)骨脂乙素對(duì)胰島素抵抗細(xì)胞模型PI3K/Akt信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，模型組處理顯著降低了INS-R、IRS1、GLUT2、Akt、PI3K、p-Akt、p-PI3K 蛋白表達(dá)（P＜0.05、0.001）。與模型組相比，二甲雙胍組和補(bǔ)骨脂乙素組的INS-R、IRS1、GLUT2、Akt、PI3K、p-Akt、p-PI3K 的蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01、0.001），見(jiàn)圖8。

圖8 補(bǔ)骨脂乙素對(duì)胰島素抵抗細(xì)胞模型PI3K/Akt 信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響（，n=3）Fig.8 Effect of isobavachalcone on protein expression of PI3K/Akt signaling pathway in insulin resistant cell model (,n=3)

3 討論

2 型糖尿病是多基因、多因素作用的疾病，僅根據(jù)單一作用靶點(diǎn)難以達(dá)到良好的治療效果[19]。中藥或天然藥物具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，被視為藥物開(kāi)發(fā)的重要來(lái)源[20]。由于中藥成分復(fù)雜且涉及靶點(diǎn)較多，從多成分中尋找具有潛在開(kāi)發(fā)價(jià)值的天然產(chǎn)品通常具有挑戰(zhàn)性。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一種新的方法，從系統(tǒng)層次和生物網(wǎng)絡(luò)的整體角度出發(fā)，解析藥物與疾病之間的靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)[21]。補(bǔ)骨脂乙素是補(bǔ)骨脂中的黃酮類(lèi)的化合物，補(bǔ)骨脂乙素可以抑制NF-κB 通路改善大鼠糖尿病腎病，抑制腎臟炎癥，改善腎損傷[22]，表明補(bǔ)骨脂乙素與2 型糖尿病有一定的相關(guān)性。但補(bǔ)骨脂乙素在2 型糖尿病中的作用效果及機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究。

通過(guò)補(bǔ)骨脂乙素作用靶點(diǎn)與2 型糖尿病靶點(diǎn)的交集得到多個(gè)重疊的基因及核心靶點(diǎn)，PPI 顯示補(bǔ)骨脂乙素作用于2 型糖尿病的靶蛋白之間具有密切的相互作用，KEGG 分析表明靶基因富集在PI3K/Akt 信號(hào)通路，GO 分析表明補(bǔ)骨脂乙素治療2 型糖尿病的核心靶點(diǎn)參與PI3K 酶活性及PI3K 復(fù)合物的形成，表明PI3K/Akt 在補(bǔ)骨脂乙素治療2 型糖尿病機(jī)制可能起著重要的作用。PI3K/Akt 及其相關(guān)信號(hào)通路在生物體生長(zhǎng)和關(guān)鍵BP（如葡萄糖穩(wěn)態(tài)、脂質(zhì)代謝、蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞增殖和存活）中起著關(guān)鍵的作用[23]。在血糖調(diào)節(jié)過(guò)程中，胰島素與靶細(xì)胞膜上的胰島素受體（IR）結(jié)合促進(jìn)IRS-1 磷酸化，IRS1 通過(guò)SH2 結(jié)構(gòu)域激活PI3K，PI3K 與下游效應(yīng)物Akt 結(jié)合并激活其表達(dá)，進(jìn)一步導(dǎo)致GLUT4 易位至細(xì)胞膜，增加細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，調(diào)節(jié)血糖平衡[24]，GLUT4 表達(dá)的改變會(huì)導(dǎo)致葡萄糖攝取或輸出障礙，導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生[25]。補(bǔ)骨脂乙素的潛在靶點(diǎn)與2 型糖尿病靶點(diǎn)的交集中均發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt 通路相關(guān)靶點(diǎn)，如PIK3CA、磷酸肌醇-3-激酶催化亞基β 肽（PIK3CB）、mTOR 等。PI3K/Akt 通過(guò)下游叉頭框蛋白O1（FOXO1）和糖原合成酶激酶3（GSK3）調(diào)節(jié)葡萄糖代謝，通過(guò)mTOR 蛋白復(fù)合體1（mTORC1）和固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBP）調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[26]。KEGG 富集分析中發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂乙素靶點(diǎn)也富集在PI3K/Akt 下游FOXO 和mTOR 信號(hào)通路。本研究利用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果PI3K/Akt 信號(hào)通路進(jìn)行了驗(yàn)證。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，胰島素抵抗細(xì)胞經(jīng)補(bǔ)骨脂乙素處理后，胰島素抵抗細(xì)胞的葡萄糖攝取能力明顯增強(qiáng)，胰島素抵抗細(xì)胞中PI3K、Akt、INS-R、IRS1的mRNA 顯著升高，與葡萄糖攝取相關(guān)的GLUT2mRNA 表達(dá)水平也顯著增加。PI3K 和Akt 蛋白及其磷酸化也顯著升高，INS-R、IRS1、GLUT2 的蛋白表達(dá)水平與轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)趨勢(shì)一致，說(shuō)明補(bǔ)骨脂乙素通過(guò)PI3K/Akt 信號(hào)通路增加葡萄糖的攝取改善胰島素抵抗，從而發(fā)揮抗2 型糖尿病的作用。

綜上所述，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)對(duì)補(bǔ)骨脂乙素靶點(diǎn)及作用通路進(jìn)行分析，表明補(bǔ)骨脂乙素治療2 型糖尿病是多成分、多靶點(diǎn)、多途徑協(xié)同作用的結(jié)果。補(bǔ)骨脂乙素可能通過(guò)PI3K/Akt 信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)2 型糖尿病的治療作用，為其后續(xù)進(jìn)一步深入研究提供了基礎(chǔ)和參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突