白 娟,張 琰,洪術(shù)霞,史金平,徐麗婷,王 芳

西安國際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院藥學(xué)部,西安 710100

急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)是指多種病因和發(fā)病機制引起的突發(fā)和持續(xù)性腎功能下降,是臨床上常見的危重癥之一,具有較高的發(fā)病率、復(fù)發(fā)率和死亡率。據(jù)統(tǒng)計,全球每年約有1 300萬例患者發(fā)病,由于治療藥物及策略的缺乏,致使每年約有170萬例患者死亡,并且85%患者在發(fā)展中國家[1]。AKI的預(yù)防和治療過程中,穩(wěn)定血壓和提高有效循環(huán)血容量非常重要[2],因此,尋找預(yù)防和治療AKI的藥物,對挽救該疾病患者生命具有非常重要的意義。中藥具有多成分、多靶點的特點,在防治AKI方面取得了較大的進展[3]。

乳香(olibanum)來源于橄欖科植物乳香樹BoswelliacarteriiBirdw.及同屬植物B.bhaw-dajianaBirdw.樹皮滲出的樹脂。性溫,味辛、苦,具有“活血定痛,消腫生肌”的功效,乳香活血止痛功效的主要成分為乳香酸化合物[4]?，F(xiàn)代研究表明,乳香具有抗菌、抗癌、抗炎、抗氧化等活性[5],基于其作用特點,進一步研究乳香對AKI的作用機制。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對乳香的活性成分進行篩選,構(gòu)建藥物-活性成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò),在此基礎(chǔ)上運用體外細胞實驗進行驗證,并闡明乳香防治AKI的作用機制,為其開發(fā)為抗急性腎損傷藥物提供可靠的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 乳香相關(guān)成分及靶點預(yù)測

通過Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology(TCMSP)數(shù)據(jù)庫,以口服利用度(oral bioavailability,OB)≥30%且類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18的屬性值篩選出活性成分。結(jié)合相關(guān)文獻研究[6-8],將與研究主題相關(guān)的化合物,仍納入活性成分中。將活性成分輸入Pubchem數(shù)據(jù)庫,找到Canonical SMILES,再利用SwissTargetPrediction進行靶點預(yù)測,輸入成分的Canonical SMILES形式,物種選擇為Homo sapiens,將其中probability >0.1的活性成分的靶基因進行篩選收集。

1.2 急性腎損傷疾病靶點篩選

以“acute kidney injury” “AKI”為關(guān)鍵詞,分別通過OMIM數(shù)據(jù)庫(http://www.omim.org)、DisGeNet數(shù)據(jù)庫(http://www.disgenet.org/home/)、DRUGBANK數(shù)據(jù)庫(https://www.DrugBank.ca/)及GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org)篩選出疾病相關(guān)靶點。

1.3 共有靶點篩選

將篩選后的乳香活性成分靶點和急性腎損傷疾病靶點,統(tǒng)一利用Uniprot數(shù)據(jù)庫 (https://www.uniprot.org)進行統(tǒng)一規(guī)范。通過VENNY 2.1網(wǎng)站(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)繪制韋恩圖,取得化合物-疾病交集,映射篩選出共同靶點。

1.4 乳香與急性腎損傷共有靶點PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用 String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org),將共有靶點導(dǎo)入,選擇總得分>0.4和“Homo sapiens”,去除無交互作用的單一蛋白,其余均為默認設(shè)置,利用Cytoscape 3.7.2軟件將共有靶點PPI網(wǎng)絡(luò)可視化,分析篩選出核心靶點。

1.5 GO功能分析和KEGG通路富集分析

使用DAVID數(shù)據(jù)庫(http://www.david.niaid.nih.gov)將篩選出的乳香與急性腎損傷共有靶點錄入,設(shè)置P<0.05,分析其主要的生物學(xué)過程與代謝通路并進行富集分析,結(jié)果以條形圖或氣泡圖形式呈現(xiàn),根據(jù)核心通路富集程度探究乳香治療AKI的可能作用機制。

1.6 分子對接驗證

將乳香的主要活性成分和靶點進行分子對接驗證?；钚猿煞趾桶悬c使用Pymol和AutoDockTools進行修飾。結(jié)合能可用于評價化合物與目標物的結(jié)合程度。結(jié)合能小于-5 kJ/mol,表明目標物與組分結(jié)合效果較好[9]。

1.7 體外細胞實驗方法

1.7.1 實驗材料

α-乳香酸(貨號:20130517,純度≥95%,寶雞辰光生物科技有限公司);DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶、胎牛血清、青霉素/鏈霉素溶液(貨號分別為:SH30021、J200033、SH30396、SV30010,Hyclone);CCK-8、IL-1βELISA試劑盒、TNF-αELISA試劑盒(貨號分別為:C0037、PI328、PT516,碧云天生物技術(shù)有限公司);Hoechst33258(貨號:H1398,Thermo);人腎小管上皮細胞(HK-2),為本實驗室傳代培養(yǎng)獲得;細胞使用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.7.2 體外I/R模型制備

取復(fù)蘇后第3～4代人近曲腎小管上皮細胞(HK-2),調(diào)整細胞終濃度為l×106個/mL,種入6孔培養(yǎng)板,在37 ℃、95% O2、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)24 h,當(dāng)HK-2細胞達到80%匯合時,用Hank′s平衡鹽溶液(含有1.3 mmol/L Ca和0.8 mmol/L Mg)代替培養(yǎng)基。在初步實驗中,我們消耗ATP和葡萄糖,分別用400 μmol/L 抗霉素A(復(fù)合物III線粒體電子傳遞抑制劑)和10 mmol/L 2-脫氧葡萄糖(L-葡萄糖的非代謝異構(gòu)體)培養(yǎng)4 h,模擬HK-2細胞體外缺血,然后在完全生長培養(yǎng)基中恢復(fù)到正常條件(5% CO2和95% O2)24 h以用于復(fù)氧和再灌注[10-12]。

1.7.3 實驗分組與細胞增殖實驗

實驗分為對照組(Con)、模型組(Mod)、α-BA低劑量組(α-BA-L,10 μmol/L)、α-BA中劑量組(α-BA-M,20 μmol/L)、α-BA高劑量組(α-BA-H,40 μmol/L)。待HK-2細胞進入指數(shù)生長期,DMEM培養(yǎng)液懸浮并調(diào)整濃度為5×103個細胞/孔接種到96孔板中。缺血再灌注組用上述方法處理。在模型+治療藥物組中,HK-2分別用I/R和α-BA低、中、高劑量處理24 h。然后加入10 μL CCK-8并將細胞孵育4 h,并使用酶標儀在450 nm下測量吸光度。

1.7.4 細胞凋亡檢測

將細胞以密度為每孔5×105個接種到6孔板中。接種24 h后,細胞貼壁,待細胞充滿培養(yǎng)瓶80%時,加入α-BA,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,造體外缺血再灌注模型,造模完成后,吸去上清,用PBS沖洗2遍,用4%多聚甲醛固定15 min,PBS沖洗2遍,每孔加入10 μmol/L Hoechst 33258染色液,染色30 min。用PBS洗2遍,加一滴抗熒光淬滅液。置于熒光顯微鏡下觀察,并隨機拍照。

1.7.5 血清IL-1β、TNF-α表達水平

ELISA法對HK-2細胞培養(yǎng)上清、模型組細胞、α-BA低、中、高劑量組,細胞培養(yǎng)上清液中的IL-1β,TNF-α進行含量測定,具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.7.6 實時熒光定量PCR法檢測MAPK3和PPARG的相對表達量

取對數(shù)生長期的細胞按上述分組進行處理6 h,收集細胞,按照試劑盒說明分別提取各組細胞總RNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書對提取的mRNA進行逆轉(zhuǎn)錄。其中MAPK3上游引物序列:5′-CTACACGCAGTTGCAGTACAT-3′,下游引物序列:5′-CAGCAGGATCTGGATCTCCC-3′;PPARG上游引物序列:5′-GGGATCAGCTCCGTGGATCT-3′,下游引物序列:5′-TGCACTTTGGTACTCTTGAAGTT-3′。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共45個循環(huán)。每組設(shè)3個復(fù)孔,重復(fù)3次,以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt計算各目的基因的相對表達量。

1.7.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果

2.1.1 乳香主要活性成分及靶點預(yù)測結(jié)果

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫初步獲得乳香的活性成分共127個,經(jīng)過OB值和DL值篩選及文獻補充后,最終獲得主要活性成分共10個(見表1)?；钚猿煞謱?dǎo)入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫中進行靶點預(yù)測,去除重復(fù)值后共得到化學(xué)成分相應(yīng)靶點223個。在Cytoscape中建立了一個具有79個節(jié)點和210個邊緣的可視化網(wǎng)絡(luò)圖,如圖1所示。

圖1 乳香“化合物-靶點”的可視化網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Visualization network diagram of “compound-target” for olibanum注:淺藍色為乳香;桃粉色為基因靶點。Note:Light blue is olibanum;Peach pink is the gene target.

表1 乳香活性成分

2.1.2 急性腎損傷相關(guān)靶點的獲取

檢索OMIM、Disgenet、DrugBank、GeneCards數(shù)據(jù)庫,獲得急性腎損傷疾病靶點,篩選并去除重復(fù)值后得到疾病相應(yīng)靶點1 245個。

2.1.3 交集靶點韋恩圖繪制

將乳香活性成分靶點與AKI疾病相關(guān)靶點取交集得到共有靶點72個,繪制交集靶點基因的韋恩圖(見圖2)。

圖2 乳香-急性腎損傷交集靶點韋恩圖Fig.2 Venn diagram for the intersection targets of olibanum-AKI

2.1.4 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

將交集靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫,獲得PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)信息,利用Cytoscape 3.7.2軟件繪制靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)(見圖3)。圖中共有71個節(jié)點,479條邊緣。根據(jù)度值和緊密度進行排序,前5位分別為MAPK3、PPARG、PTGS2、HIF1α和ESR1(見表2),其中degree值越大,圖形越大,顏色越深(紅);combine scores越大,顏色越淺(藍),線條越粗。

圖3 乳香對急性腎損傷作用靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 PPI network diagram of the targets of the action of olibanum on AKI

表2 乳香-急性腎損傷匹配基因注釋及其度值和緊密度

2.1.5 GO功能富集分析

對乳香治療急性腎損傷進行GO功能分析,發(fā)現(xiàn)其可能的作用機制。GO富集分析分為3類:分別是生物過程(biological process,BP)、細胞成分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)。GO功能分析得到101個BP,主要有基因表達的正向調(diào)控、對缺氧的反應(yīng)、凋亡過程、血管收縮的正向調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)等;34個CC,主要有整合素復(fù)合物、細胞表面、質(zhì)膜、細胞質(zhì)、線粒體等;72個MF,主要有酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄共激活因子結(jié)合、細胞黏附分子結(jié)合、內(nèi)肽酶活性及MAP激酶活性等。對排名前10的GO功能分析進行展示(見圖4)。

圖4 GO功能富集分析Fig.4 GO function enrichment analysis

2.1.6 KEGG通路富集分析

通過KEGG通路富集分析,共得到117個結(jié)果,主要涵蓋包括Toll樣受體信號通路、TNF信號通路和NF-κB信號通路等,對排名前20的KEGG通路富集分析進行展示(見圖5)。

圖5 KEGG通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis

2.1.7 分子對接驗證

通過模擬有效成分3-乙酰基-11-酮-β-乳香酸(AKBA)和α-乳香酸(α-BA)分別與AKI潛在藥物核心靶點MAPK3和PPARG對接。AKBA對MAPK3(結(jié)合能為-7.79 kJ/mol)和PPARG(結(jié)合能為-9.71 kJ/mol)具有較強的結(jié)合能力;α-BA對MAPK3(結(jié)合能為-8.4 kJ/mol)和PPARG(結(jié)合能為-8.23 kJ/mol)的對接能力均較好。分子對接驗證可為進一步研究藥物靶點提供重要的參考依據(jù),對接結(jié)果如圖6所示。

圖6 分子對接模式圖Fig.6 Molecular docking diagram注:A.AKBA與MAPK3;B.AKBA與PPARG;C.α-BA與MAPK3;D.α-BA與PPARG。Note:A.AKBA and MAPK3;B.AKBA and PPARG;C.α-BA and MAPK3;D.α-BA and PPARG.

2.2 體外細胞實驗結(jié)果

2.2.1 細胞活性檢測結(jié)果

檢測結(jié)果表明,當(dāng)使用α-BA低、中、高濃度時,HK-2細胞活力與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(見圖7A);但模型組可顯著抑制HK-2細胞的增殖,α-BA以濃度依賴性方式顯著增強其活力(見圖7B)。

圖7 α-BA對HK-2細胞增殖的影響Fig.7 Effect of α-BA on proliferation of HK-2 注:與對照組比較,*P <0.01;與模型組比較,#P <0.01,下同。 Note:Compared with control group, * P <0.01;Compared with Model group,#P <0.01,the same below.

2.2.2α-BA對腎缺血再灌注細胞凋亡的影響

利用Hoechst 33258染色結(jié)果顯示模型組顯著上調(diào)凋亡細胞的比例,而α-BA顯著降低其凋亡細胞并呈濃度依賴性(見圖8)。結(jié)果表明,α-BA有效抑制I/R誘導(dǎo)的腎近端腎小管細胞凋亡。

圖8 α-BA對I/R誘導(dǎo)HK-2凋亡的影響Fig.8 Effect of α-BA on HK-2 apoptosis induced by

2.2.3α-BA對HK-2細胞中細胞因子TNF-α和IL-1β水平的影響

與對照組比較,模型組細胞中的TNF-α和IL-1β水平顯著性升高;與模型組比較,α-BA給藥組中TNF-α和IL-1β水平降低,且其變化呈現(xiàn)出劑量依

賴性關(guān)系(見圖9)。

圖9 HK-2細胞中TNF-α(A)和IL-1β(B)水平Fig.9 Levels of TNF-α (A) and IL-1β (B) in HK-2

2.2.4 HK-2細胞中關(guān)鍵靶點基因RT-qPCR檢測結(jié)果

本研究選取AKI相關(guān)的主要靶點MAPK3和PPARG基因進行驗證。與對照組比較,I/R模型組MAPK3和PPARG基因mRNA明顯上調(diào),與模型組組比較,α-BA低、中、高劑量組MAPK3和PPARG基因mRNA表達均明顯下調(diào),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(見圖10)。

圖10 α-BA對關(guān)鍵靶點基因mRNA的影響Fig.10 Effect of α-BA on the mRNA of the key target

3 討論與結(jié)論

西醫(yī)認為AKI的發(fā)生與腎臟缺血、缺氧有較大關(guān)系,目前為止臨床仍缺乏有效的治療方法和干預(yù)措施,主要通過對癥治療來改善患者疾病狀態(tài)[13]。中醫(yī)將AKI的臨床特點歸于“癃閉”“關(guān)格”“水腫”“溺毒”等范疇[14],故以清熱解毒、活血化瘀、瀉熱逐水、通腑瀉濁為治療基本法則[15]。乳香具有生肌止血、活血祛瘀,消腫止痛功效,臨床多用于治療血瘀證或痹證等[16]。因此,在急性腎損傷的早、中期加入活血化瘀藥,對患者腎功能的改善、減輕血尿等臨床表現(xiàn),以及減慢疾病的進展速度等方面有著重要的防治作用[17]。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法,系統(tǒng)地分析了乳香“多成分-多靶點-多途徑”治療AKI的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制。大量實驗證明乳香酸被認為是乳香中最具生物活性的成分。最顯著的是抗炎和抗腫瘤特性,以及許多其他藥理活性,如抗?jié)儭⒚庖哒{(diào)節(jié)、降血脂、腎保護、抗菌作用等[18]。研究結(jié)果表明,AKBA、α-BA等是治療AKI的主要活性成分。有文獻報道,α-BA可以抑制 U937巨噬細胞中LPS刺激的促炎細胞因子(TNF-α和IL-1β)的產(chǎn)生,證實了其在體外的抗炎特性[19]。乳香的生物活性成分五環(huán)三萜,通過5-脂氧合酶阻斷白三烯的生物合成并發(fā)揮其抗炎作用[20]。有研究表明,乳香酸通過抗氧化和抗炎作用對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的膀胱炎大鼠發(fā)揮尿路保護作用[21]。

由PPI網(wǎng)絡(luò)可知MAPK3、PPARG、PTGS2、HIF1α和ESR1是乳香治療急性腎損傷的核心靶點。MAPK3屬于絲裂原活化蛋白激酶MAPK家族成員。MAPK級聯(lián)激活是多種信號通路的中心,參與細胞生長、分化、凋亡等生理過程[22]。PPARG屬于核轉(zhuǎn)錄因子超家族,實驗證明PPARG缺失小鼠出現(xiàn)糖尿和白蛋白尿增加,隨著年齡的增長,小鼠出現(xiàn)腎功能不全、2 型糖尿病進一步加重[23]。據(jù)報道,PPARG激動劑通過抑制I/R損傷誘導(dǎo)的彌漫性腎小管壞死和急性炎癥,并降低一氧化氮血漿水平、ED-1+細胞浸潤,從而保護腎臟免受I/R損傷,PPAR激動劑在治療AKI方面顯示出相當(dāng)大的前景[24]。PTGS2是花生四烯酸轉(zhuǎn)化為炎癥介質(zhì)前列腺素的關(guān)鍵酶,主要分布在核膜,受炎癥因子、腫瘤生長因子等刺激后誘導(dǎo)其表達。研究表明,金骨蓮提取物劑量依賴性下調(diào)PTGS2/COX-2 mRNA表達,從而發(fā)揮抗炎作用[25]。HIF1α是對缺氧的適應(yīng)性反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子,在腎缺血-再灌注誘導(dǎo)的AKI模型中,HIF1α在腎小管上表達明顯增多[26]。

在GO富集分析的過程中,主要涉及對缺氧的反應(yīng)、凋亡過程、炎癥反應(yīng)等生物過程、線粒體等分子功能以及內(nèi)肽酶活性等細胞組分,提示乳香治療AKI的生物學(xué)途徑豐富且復(fù)雜。由KEGG通路富集分析可知,乳香治療AKI的信號通路與Toll樣受體信號通路、TNF信號通路和NF-κB信號通路相關(guān)。其中,Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)是一種膜蛋白受體,TLR4是引起AKI炎癥反應(yīng)的重要分子,可轉(zhuǎn)錄及釋放多種細胞因子和炎癥介質(zhì),引發(fā)免疫炎癥反應(yīng)[27]。有研究表明,急性腎損傷嚴重程度與血清TLR4、NF-κB水平密切相關(guān),通過抑制TLR4-NF-κB信號通路可減輕急性腎損傷嚴重程度[28]。腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor TNF) 是一種具有廣泛生物學(xué)效應(yīng)的細胞因子,一般TNF是指巨噬細胞產(chǎn)生的,即TNF-α。被激活后主要發(fā)揮促進細胞生長、分化、凋亡及誘發(fā)炎癥等重要作用[29]。AKI激活TLR4-NF-κB信號通路后,誘導(dǎo)促炎因子TNF-α釋放。故加強對TLR4、NF-κB及TNF-α水平的控制,以減輕急性腎損傷,促進患者預(yù)后改善。

采用分子對接法對乳香中主要有效成分作用于MAPK3和PPARG的結(jié)合能進行了測定,結(jié)果顯示AKBA和α-BA對MAPK3和PPARG都有良好的結(jié)合能力。

最后,本研究通過細胞培養(yǎng)模擬腎臟I/R損傷研究α-BA的作用機制。研究結(jié)果表明α-BA對HK-2細胞無毒性作用,且呈劑量依賴性提高I/R損傷模型的細胞活力,提示具有腎臟保護作用。Hoechst 33258染色顯示I/R處理顯著上調(diào)凋亡細胞的比例,而α-BA顯著降低其凋亡細胞并呈濃度依賴性。α-BA可顯著抑制由I/R誘導(dǎo)的HK-2細胞產(chǎn)生的炎性因子。同時,實時熒光定量RT-PCR檢測表明,α-BA能夠下調(diào)AKI進程中的關(guān)鍵靶點MAPK3和PPARG基因表達,這與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測的結(jié)果相一致。

本研究運用中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法,檢索出乳香的活性成分及潛在靶點,以及AKI的相關(guān)靶點,得到活性成分與疾病靶點交集為72個,再對這些靶點進行GO及KEGG信號通路富集分析,預(yù)測出主要的活性成分AKBA、α-BA等,主要通過調(diào)節(jié)MAPK3、PPARG、PTGS2等靶點,調(diào)控Toll樣受體、TNF和NF-κB等信號通路來減輕缺血、缺氧損傷、調(diào)控細胞凋亡,從而達到治療AKI的目的。同時,體外細胞實驗初步證實了預(yù)測的準確性和可靠性,為后續(xù)中醫(yī)藥研究及臨床推廣提供了參考依據(jù)。但其仍具有一定的局限性,有待動物實驗進一步驗證。