王慶婷,耿曉桐,李雅靜,張 娟,劉慶普,龔海燕,雷敬衛(wèi),謝彩俠*

1河南中醫(yī)藥大學(xué) 河南省中藥質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心,鄭州 450046;2信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院,信陽(yáng) 464000;3上海中醫(yī)藥大學(xué),上海 201203

磷作為植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的大量元素之一,參與了植物的光合作用、能量轉(zhuǎn)化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),以及酶活性等的調(diào)節(jié),可以提高植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性[1]。植物獲取磷素的主要來(lái)源為土壤,但由于土壤中的磷轉(zhuǎn)移性差,極易被固定,因此其生物有效性低[2]。施用磷肥雖能夠緩解有效磷的缺失,但易與土壤中的鐵、鋁、鈣等離子或土壤顆粒結(jié)合而難以被植物攝取。此外,過(guò)度施用磷肥不僅會(huì)加劇磷礦的衰竭,還會(huì)造成周圍水體富營(yíng)養(yǎng)化的環(huán)境污染問(wèn)題[3-5]。因此研究植物低磷脅迫下的響應(yīng)機(jī)制,篩選并培育耐低磷品種迫在眉睫。低磷脅迫下,植物會(huì)通過(guò)表型性狀和生理代謝的調(diào)節(jié)來(lái)響應(yīng)低磷信號(hào),以改變磷的存在形態(tài),提高植物對(duì)磷的吸收率。植物根系通過(guò)分泌酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP)提高根際土壤的酸性磷酸酶活性,實(shí)現(xiàn)對(duì)土壤中難溶性有機(jī)磷的活化利用[6]。ACP是一種能水解單磷酸酯鍵釋放無(wú)機(jī)磷的水解酶類,一般ACP活性的增高被視為植物響應(yīng)低磷脅迫的重要機(jī)制之一[7]。另外,植物的根系發(fā)育情況[8-10]及抗氧化系統(tǒng)[11-13]也會(huì)產(chǎn)生變化來(lái)響應(yīng)低磷脅迫。

在漫長(zhǎng)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中,植物自成一套抗低磷的機(jī)制。低磷脅迫下,植物會(huì)通過(guò)改變一系列基因表達(dá)水平來(lái)調(diào)控自身生理生化過(guò)程,從而盡快適應(yīng)低磷環(huán)境延長(zhǎng)生存時(shí)間。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)(RNA-Seq)可以研究組織在特定條件下的基因轉(zhuǎn)錄情況、定位并注釋基因,是研究植物生理過(guò)程分子機(jī)理的有效手段[14]。目前RNA-Seq被廣泛應(yīng)用于植物響應(yīng)外界脅迫的分子機(jī)制研究[15,16],極大推動(dòng)了植物抗逆分子機(jī)制的研究進(jìn)展。因此利用RNA-Seq研究植物的耐低磷分子機(jī)制,對(duì)尋找植物響應(yīng)低磷脅迫的代謝通路進(jìn)而篩選出響應(yīng)低磷脅迫的潛在關(guān)鍵基因具有重要意義。

盾葉薯蕷(DioscoreazingiberensisC.H.Wright)為薯蕷科(Dioscoreaceae)薯蕷屬植物,俗稱黃姜、火頭根。盾葉薯蕷為我國(guó)特有品種,是世界上薯蕷皂素含量最高的植物。盾葉薯蕷是提取薯蕷皂素重要的藥源植物,同時(shí)也是合成甾體類激素藥物的重要原料[17]。除此之外盾葉薯蕷還是治療心腦血管疾病的臨床用藥[18],這極大促進(jìn)了盾葉薯蕷相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。前期研究發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)期種植盾葉薯蕷后會(huì)降低土壤有效磷含量,造成低磷脅迫,導(dǎo)致盾葉薯蕷植株生長(zhǎng)發(fā)育受阻,影響其甾體皂苷類成分的合成。目前關(guān)于低磷脅迫對(duì)盾葉薯蕷生長(zhǎng)及甾體皂苷代謝的影響還未見(jiàn)報(bào)道,因此,本文根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取河南南陽(yáng)產(chǎn)盾葉薯蕷為研究對(duì)象,以無(wú)機(jī)磷分級(jí)含量、根系發(fā)育情況、根際基質(zhì)酸性磷酸酶(soil acid phosphatase,S-ACP)活性、植物過(guò)氧化物酶(peroxidase,POD)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、各部位甾體皂苷類成分含量等為評(píng)價(jià)指標(biāo)考察低磷脅迫下盾葉薯蕷的生理變化及甾體皂苷類成分的代謝特征,并利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)關(guān)鍵時(shí)期盾葉薯蕷不同組織部位的基因表達(dá)特征進(jìn)行分析,為進(jìn)一步研究盾葉薯蕷應(yīng)答低磷脅迫的分子機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent1100型高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司);2000ES型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(奧特奇公司);1510型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技公司);SX2-18-12型馬弗爐(蘇州江東精密儀器有限公司);LA-90型根系掃描儀(蘇州信華特檢測(cè)技術(shù)有限公司);10～100 μL和100～1 000 μL移液槍(艾本德國(guó)際貿(mào)易有限公司)。

1.2 試劑

乙腈(安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰?純度:HPLC≥99.9%;生產(chǎn)批號(hào):AS1122-801-22075302);三角葉薯蕷皂苷、盾葉新苷(成都克洛瑪生物科技有限公司;純度≥98%;生產(chǎn)批號(hào):CHB17051、CHB170718);薯蕷皂苷、原薯蕷皂苷、偽原薯蕷皂苷(成都曼思特生物科技有限公司;純度≥98%;生產(chǎn)批號(hào)分別為:MUST-17090203、MUST-17100901、MUST-17110504);甲苯(煙臺(tái)市雙雙化工有限公司;純度≥99.5%;生產(chǎn)批號(hào):20101201);酒石酸銻鉀(武漢克米克生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司;純度≥99%;生產(chǎn)批號(hào):11071-15-1);碳酸氫鈉(天津市永大化學(xué)試劑有限公司;純度≥99.5%;生產(chǎn)批號(hào):20210506)苯酚(天津市瑞金特化學(xué)品有限公司;純度≥99%;生產(chǎn)批號(hào)分別為:HG/T4367-2012);抗壞血酸(天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司;純度≥99.7%;生產(chǎn)批號(hào):GB/T 15347-1994);土壤酸性磷酸酶(S-ACP)活性檢測(cè)試劑盒(索萊寶生化試劑盒事業(yè)部);甲硫氨酸(上海源葉生物科技有限公司;純度≥99%;生產(chǎn)批號(hào):J15J8R39920);氮藍(lán)四唑(山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司;純度≥98%;生產(chǎn)批號(hào):ST362);核黃素(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;純度98%～102%;生產(chǎn)批號(hào):20141008);愈創(chuàng)木酚(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;純度≥99%;生產(chǎn)批號(hào):B1227012);MiniBEST試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)。

1.3 樣品

1.3.1 植物材料培養(yǎng)與處理

以珍珠巖、蛭石(3∶1)作為培養(yǎng)基質(zhì),進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)為正常供磷(N)、中度低磷脅迫(H)、重度低磷脅迫(Z)3個(gè)處理,每個(gè)處理設(shè)置重復(fù)30次。正常供磷組以霍格蘭完全營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行澆灌,中度低磷脅迫組與重度低磷脅迫組分別澆灌中度缺磷營(yíng)養(yǎng)液(完全營(yíng)養(yǎng)液中一半的磷含量)與重度缺磷營(yíng)養(yǎng)液(剔除磷組分的完全營(yíng)養(yǎng)液,剔除的K用KCl進(jìn)行補(bǔ)充)。選取大小一致已有芽點(diǎn)的種根,栽種于不同磷處理的盆栽基質(zhì)中,統(tǒng)一管理。分別在苗齡30 d的脅迫初期(5月30日,標(biāo)記為5)、苗齡60 d的脅迫中期(6月30日,標(biāo)記為6)、苗齡90 d的脅迫后期(7月30日,標(biāo)記為7)進(jìn)行采樣,每次采樣10株。

1.3.2 樣品采集

采集盾葉薯蕷新生根莖(R)、地上莖(S)、老根(O)、須根(FR)與葉片(L)后,清洗,用吸水紙吸干后快速用錫箔紙包裝,置于液氮中,用于抗氧化酶(SOD、POD)活性實(shí)驗(yàn);采集盾葉薯蕷根際基質(zhì)(RM),自然風(fēng)干后混勻,置干燥器中保存,用于全磷、速效磷、磷酸鋁鹽(aluminophosphate,AL-P),磷酸鐵鹽(phosphoric acid iron salt,Fe-P)、磷酸鈣鹽(calcium phosphate,Ca-P)含量和土壤酸性磷酸酶(S-ACP)活性測(cè)定;另采集單株樣品,測(cè)定其根系發(fā)育特征。剩余各處理各部位樣品,凈制切制后置烘箱中45 ℃烘干,粉碎,過(guò)4號(hào)藥典篩,置干燥器中保存,用于盾葉薯蕷各部位甾體皂苷類成分的含量測(cè)定,各樣品以“部位-采樣日期-處理方式”的方式命名,如名稱為S-5-Z的樣品代表5月30日采集的重度低磷脅迫處理組的地上莖。

1.4 根際基質(zhì)中各級(jí)磷含量測(cè)定

根際基質(zhì)全磷的測(cè)定方法參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《土壤全磷測(cè)定法》中的氫氧化鈉熔融-鉬銻抗比色法;采用0.5 mol/L NaHCO3法測(cè)定速效磷含量[19];無(wú)機(jī)磷(Al-P、Fe-P、Ca-P)測(cè)定方法參照Huang等[20]分級(jí)磷測(cè)定方法;根際基質(zhì)的磷含量利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行分析。

1.5 根際基質(zhì)中酸性磷酸酶(S-ACP)活性測(cè)定

稱取風(fēng)干混勻的根際基質(zhì)0.1 g,加入0.05 mL甲苯溶液,輕搖15 min,加0.4 mL試劑1搖勻后,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱,開(kāi)始計(jì)時(shí),催化反應(yīng)24 h;到時(shí)間后迅速加入1 mL試劑2充分混勻,終止催化反應(yīng)。10 000 r/min室溫離心10 min,取上清液10 μL,加入20 μL試劑3、4 μL試劑4,充分混勻,顯色后再加166 μL蒸餾水,混勻后于室溫下靜置30 min,在660 nm處測(cè)定吸光度;空白管與標(biāo)準(zhǔn)管分別以10 μL蒸餾水和10 μL 0.5 μmol/mL苯酚標(biāo)準(zhǔn)液替換提取液測(cè)定吸光值。以37 ℃下中每克土壤每天釋放1 μmol酚為一個(gè)酶活力單位,根際基質(zhì)的ACP活性結(jié)果利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行分析。計(jì)算公式如下:

ACP(U/g)=

0.725×(OD測(cè)定-OD空白)÷(OD標(biāo)準(zhǔn)-OD空白)÷W

式中,W為根際基質(zhì)的質(zhì)量。

1.6 盾葉薯蕷根系發(fā)育測(cè)定

利用根系掃描儀對(duì)不同處理不同時(shí)期下盾葉薯蕷的須根進(jìn)行掃描,得到總根長(zhǎng)、總投影面積與總表面積,并利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行分析。

1.7 盾葉薯蕷不同部位抗氧化酶(SOD、POD)活性測(cè)定

SOD活性采用氮藍(lán)四唑光化還原法測(cè)定,POD活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定,實(shí)驗(yàn)方法參考Li[21]實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)中的測(cè)定方法,并利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行分析。

1.8 盾葉薯蕷不同部位甾體皂苷類成分含量測(cè)定

1.8.1 色譜條件

Athena C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流速1.0 mL/min;柱溫30 ℃;流動(dòng)相為乙腈(A)∶水(B)梯度洗脫(0～5 min,15%A→25%A;5～6 min,25%→20%A;6～12 min,20%→30%A;12～14 min,30%→34%A;14～15 min,34%→37%A;15～20 min,37%→38.6%A;20～25 min,38.6%→60%A;25～30 min,60%→70%A;30～40 min,70%→100%A);進(jìn)樣量5 μL。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)參數(shù):氣體流量2.5 L/min,漂移管溫度115 ℃,增益值為2。盾葉薯蕷甾體皂苷類成分對(duì)照品(A)與供試品(B)的HPLC圖見(jiàn)圖1。

圖1 盾葉薯蕷甾體皂苷類成分對(duì)照品(A)和供試品(B)的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substance (A) and test substance (B) of steroidal saponins in D.zingiberensis注:1.原薯蕷皂苷;2.偽原薯蕷皂苷;3.盾葉新苷;4.三角葉薯蕷皂苷;5.薯蕷皂苷。Note:1.Protodioscin;2.Pseudoprotodioscin;3.Zingiberensis newsaponin;4.Deltonin;5.Dioscin.

1.8.2 對(duì)照品溶液和供試品溶液的制備

對(duì)照品溶液的制備:分別精密稱定一定量的原薯蕷皂苷、偽原薯蕷皂苷、盾葉新苷、三角葉薯蕷皂苷、薯蕷皂苷對(duì)照品樣品置于10 mL容量瓶中,用甲醇(色譜純)溶解并定容制成濃度分別為0.676、0.39、0.75、0.425、0.378 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò),即得對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備:精密稱取盾葉薯蕷樣品0.5 g置于具塞錐形瓶中,加入90%乙醇30 mL,85 ℃加熱回流2 h,冷卻至室溫,用90%乙醇補(bǔ)足失重,濾紙過(guò)濾,取續(xù)濾液20 mL置于蒸發(fā)皿中,揮干,用甲醇(色譜純)溶解并定容至5 mL容量瓶,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò),即得供試品溶液。

1.8.3 方法學(xué)考察

1.8.3.1 線性關(guān)系

將5個(gè)對(duì)照品分別稀釋后按照“1.8.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定其峰面積,以峰面積為縱坐標(biāo),對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)表1)。5種皂苷類成分在各質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

表1 5種皂苷類成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

1.8.3.2 重復(fù)性、穩(wěn)定性及精密度試驗(yàn)

精密取同一樣品,按“1.8.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液,分別進(jìn)行重復(fù)性、穩(wěn)定性及精密度實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明各試驗(yàn)的RSD均符合要求,因此該儀器的精密度和方法重復(fù)性良好,樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.8.3.3 加樣回收率試驗(yàn)

精密取同一樣品6份,每份0.25 g,分別精密加入適量原薯蕷皂苷、偽原薯蕷皂苷、盾葉新苷、三角葉薯蕷皂苷、薯蕷皂苷混合對(duì)照品溶液適量,按“1.8.2”項(xiàng)下方法制備。按“1.8.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,測(cè)定原薯蕷皂苷、偽原薯蕷皂苷、盾葉新苷、三角葉薯蕷皂苷、薯蕷皂苷的含量,計(jì)算平均加樣回收率與RSD,結(jié)果表明原薯蕷皂苷、偽原薯蕷皂苷、盾葉新苷、三角葉薯蕷皂苷、薯蕷皂苷的平均加樣回收率分別為98.38%、99.32%、97.68%、102.33%、100.41%,RSD分別為2.38%、2.41%、2.40%、2.69%、1.77%,說(shuō)明該方法可以準(zhǔn)確測(cè)定盾葉薯蕷中5種甾體皂苷類成分的含量。

1.8.4 樣品測(cè)定

按上述建立的方法測(cè)定盾葉薯蕷各部位甾體皂苷類成分的含量,每個(gè)樣品重復(fù)3次,測(cè)定結(jié)果取其平均值,并利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行分析。

1.9 盾葉薯蕷不同部位響應(yīng)低磷脅迫關(guān)鍵時(shí)期的基因表達(dá)特征分析

1.9.1 盾葉薯蕷不同部位的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及組裝

選擇5月30日(脅迫初期)不同處理下盾葉薯蕷的新生根莖、地上莖、葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。用MiniBEST試劑盒進(jìn)行柱式法提取盾葉薯蕷3個(gè)部位的總RNA,通過(guò)NanoDrop和Agilent 2100系統(tǒng)檢測(cè)得到的總RNA濃度和完整性,利用提取的樣品總RNA構(gòu)建文庫(kù)。

采用BGISEQ-500平臺(tái)測(cè)定轉(zhuǎn)錄組樣本,由測(cè)序所得的數(shù)據(jù)稱為raw reads。raw reads去污染、去接頭后得到clean reads,使用Trinity對(duì)合格的clean reads進(jìn)行組裝,然后使用Tgicl對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行聚類去冗余得到Unigene。

1.9.2 盾葉薯蕷不同部位的基因表達(dá)量統(tǒng)計(jì)、差異基因篩選、GO注釋及KEGG功能分析

利用SOAP和LASTZ軟件計(jì)算各基因的表達(dá)量,用FPKM表示。參照Audic等[22]基于測(cè)序的差異基因檢測(cè)方法,根據(jù)基因的表達(dá)量(FPKM值)計(jì)算該基因在不同樣本間的差異表達(dá)倍數(shù),篩選出樣品間的差異表達(dá)基因(DEGs)。在分析中,差異表達(dá)基因默認(rèn)定義為錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,FDR)小于等于0.05且倍數(shù)差異在2倍以上的基因[23]。根據(jù)DEGs進(jìn)行GO數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)和KEEN代謝通路定位分析,通過(guò)幾何檢驗(yàn)篩選差異最顯著富集的前20個(gè)通路。

2 結(jié)果與分析

2.1 盾葉薯蕷響應(yīng)低磷脅迫的生理變化特征

2.1.1 不同處理各時(shí)期根際基質(zhì)中各級(jí)磷含量和酸性磷酸酶(S-ACP)活性分析

從不同處理各時(shí)期根際基質(zhì)中各級(jí)磷含量及酸性磷酸酶(S-ACP)活性的測(cè)定結(jié)果(見(jiàn)圖2)上可看出,隨著低磷脅迫程度的增加,盾葉薯蕷根際基質(zhì)中各級(jí)磷含量呈下降趨勢(shì)。盾葉薯蕷根際基質(zhì)的速效磷含量和Ca-P在低磷脅迫過(guò)程中其含量變化不大,且各處理組速效磷含量之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;Al-P與Fe-P作為土壤中較為活潑的磷形態(tài),在各處理組間的含量差異較大,其含量均呈階梯狀下降趨勢(shì),根際基質(zhì)中Al-P含量對(duì)低磷脅迫的響應(yīng)程度大于其他磷。由盾葉薯蕷根際基質(zhì)中S-ACP活性可知,脅迫初期和中期S-ACP活性均高于脅迫后期。整個(gè)脅迫過(guò)程中重度脅迫組根際基質(zhì)中的S-ACP活性最高,在脅迫前期和脅迫后期其S-ACP活性與正常組之間的差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 不同處理各時(shí)期盾葉薯蕷根際基質(zhì)中的全磷(A)、速效磷(B)、AL-P(C)、Fe-P(D)、Ca-P(E)含量及S-ACP(F)的活性Fig.2 Content of total phosphorus (A),available phosphorus (B),AL-P (C),Fe-P (D),Ca-P (E) and activity of S-ACP (F) in rhizosphere matrix of D.zingiberensis in different treatments and stages注:同一采樣時(shí)期內(nèi)不同小寫(xiě)字母表示各磷脅迫組之間差異顯著。Note:In the same sampling date,different lowercase letters indicate significant difference among phosphorus stress groups.

2.1.2 不同處理各時(shí)期盾葉薯蕷的根系發(fā)育情況

根系發(fā)育情況表明(見(jiàn)圖3),重度脅迫組的須根明顯稀少且呈細(xì)長(zhǎng)狀,根莖發(fā)育遲緩;脅迫中期3個(gè)處理組間的須根發(fā)育特征差異性不明顯,根莖均可以發(fā)育,但重度脅迫組根莖萌發(fā)點(diǎn)數(shù)目相對(duì)較少;脅迫后期脅迫組處理下的須根變黃,而正常組的變化不明顯,且正常組的根莖萌發(fā)點(diǎn)較多。根系掃描結(jié)果表明(見(jiàn)圖4),脅迫初期重度脅迫組盾葉薯蕷的總投影面積與另外兩組之間的差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？傮w來(lái)看,脅迫初期3個(gè)處理之間的根系發(fā)育差異性大于脅迫中后期。

圖3 不同處理各時(shí)期盾葉薯蕷的根系發(fā)育情況Fig.3 Root development of D.zingiberensis in different treatments and stages

圖4 不同處理各時(shí)期盾葉薯蕷須根的總根長(zhǎng)(A)、總投影面積(B)、總表面積(C)Fig.4 Total root length (A),total projected area (B) and total surface area (C) of D.zingiberensis in different treatments and stages注:同一采樣時(shí)期內(nèi)不同小寫(xiě)字母表示各磷脅迫組之間差異顯著。Note:In the same sampling date,different lowercase letters indicate significant difference among phosphorus stress groups.

2.1.3 不同處理各時(shí)期盾葉薯蕷各組織部位抗氧化酶(SOD、POD)的活性分析

不同處理不同時(shí)期盾葉薯蕷5個(gè)組織部位的SOD活性和POD活性變化結(jié)果表明(見(jiàn)表2),各處理之間盾葉薯蕷SOD及POD活性的變化呈現(xiàn)一定的規(guī)律性。盾葉薯蕷各組織部位中POD的活性對(duì)低磷脅迫的響應(yīng)程度大于SOD,在整個(gè)脅迫過(guò)程中,盾葉薯蕷5個(gè)組織部位各脅迫組的POD活性整體上高于正常組,其中新生根莖表現(xiàn)最為明顯。差異性分析表明,在脅迫過(guò)程中盾葉薯蕷5個(gè)組織部位各組之間的SOD活性差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上未達(dá)顯著水平,新生根莖各脅迫組以及地上莖重度脅迫組的POD活性與正常組之間的差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上達(dá)顯著水平,另外,各組織部位脅迫組與正常組POD活性存在差異的表現(xiàn)時(shí)期不同,其中,老根主要表現(xiàn)在脅迫后期,須根主要表現(xiàn)在脅迫初期和中期,而葉片主要表現(xiàn)在脅迫初期和后期。

表2 不同處理各時(shí)期盾葉薯蕷5個(gè)組織部位的SOD、POD活性

2.2 不同處理各時(shí)期盾葉薯蕷各部位甾體皂苷類成分的含量特征分析

盾葉薯蕷新生根莖(R)、莖部(S)、老根(O)、須根(FR)、葉片(L)中5種甾體皂苷的含量測(cè)定結(jié)果表明(見(jiàn)圖5),甾體皂苷類成分在盾葉薯蕷植株中的分布表現(xiàn)出明顯的組織特異性,其中新生根莖和老根中均檢測(cè)到原薯蕷皂苷、偽原薯蕷皂苷、盾葉新苷、三角葉薯蕷皂苷、薯蕷皂苷5種皂苷,地上莖中檢測(cè)到原薯蕷皂苷和盾葉新苷2種皂苷,須根中檢測(cè)到原薯蕷皂苷、偽原薯蕷皂苷、薯蕷皂苷3種皂苷,葉片中檢測(cè)到偽原薯蕷皂苷、盾葉新苷和三角葉薯蕷皂苷3種皂苷。另外,各組織部位對(duì)低磷脅迫的響應(yīng)特征存在差異,由差異性分析結(jié)果可知脅迫初期盾葉薯蕷脅迫組老根、須根、葉片中甾體皂苷含量明顯低于正常組,而新生根莖與地上莖中皂苷含量整體高于正常組。脅迫初期盾葉薯蕷不同處理不同部位甾體皂苷類成分含量差異較大,而脅迫中后期整體差異減小,其中根莖對(duì)低磷脅迫的響應(yīng)程度大于其他組織部位。

圖5 不同處理時(shí)期盾葉薯蕷不同部位5種甾體皂苷的含量Fig.5 Contents of five steroid saponins in rhizome of D.zingiberensis in different treatments and stages注:A.脅迫初期;B.脅迫中期;C.脅迫后期。Note:A.Early stage of stress;B.Middle stage of stress;C.Late stage of stress.

2.3 不同處理盾葉薯蕷脅迫初期各組織部位基因表達(dá)特征分析

低磷脅迫下盾葉薯蕷的生理代謝特征表明,脅迫初期為盾葉薯蕷響應(yīng)低磷脅迫的關(guān)鍵時(shí)期。生理代謝是基因表達(dá)的最終表現(xiàn)形式,為了從基因水平上探討盾葉薯蕷響應(yīng)低磷脅迫的機(jī)制,我們利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)γ{迫初期不同處理盾葉薯蕷根莖、葉片及地上莖的基因表達(dá)特征進(jìn)行分析。

2.3.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與數(shù)據(jù)組裝結(jié)果分析

采用BGISEQ-500平臺(tái)對(duì)不同處理組盾葉薯蕷根莖、葉片、地上莖共9個(gè)轉(zhuǎn)錄組樣本分別測(cè)序,得到raw reads,去污染、去接頭后得到clean reads。利用Trinity對(duì)質(zhì)量合格的clean reads進(jìn)行組裝,9個(gè)樣本測(cè)序結(jié)果進(jìn)行de novo組裝共得到101 593個(gè)Unigene,總長(zhǎng)度為1.28×108nt,平均長(zhǎng)度為1 256 nt,N50為1 918 nt,GC含量為43.67%。

2.3.2 轉(zhuǎn)錄組基因功能GO注釋與分布

所有Unigene結(jié)果注釋到GO數(shù)據(jù)庫(kù)的細(xì)胞組成、生物過(guò)程、分子功能三個(gè)方面,有26 090個(gè)Unigene獲得注釋,其中參與細(xì)胞組成分類的主要集中在細(xì)胞(8 069個(gè))、膜部分(6 897個(gè))和細(xì)胞器(3 125個(gè));生物過(guò)程分類的主要集中在細(xì)胞過(guò)程(7 897個(gè))、生物調(diào)節(jié)(2 635個(gè))和代謝過(guò)程(2 072個(gè));分子功能分類的主要集中在催化活性(12 115個(gè))和結(jié)合蛋白(12 009個(gè))。

2.3.3 盾葉薯蕷不同部位各處理基因表達(dá)水平分析

由盾葉薯蕷不同部位各處理基因表達(dá)量的箱線圖(見(jiàn)圖6A)可知,相同部位各處理組基因表達(dá)水平的波動(dòng)較小。主成分分析(見(jiàn)圖6B)結(jié)果表明各處理不同部位樣品基因表達(dá)存在差異,同一部位的樣本各自聚集在一起,但同一部位不同處理的樣品離散分布。

圖6 盾葉薯蕷不同部位各處理基因表達(dá)量的箱線圖(A)及主成分得分圖(B)Fig.6 Boxplot (A) and principal component score chart (B) of gene expression in different parts of D.zingiberensis

2.3.4 盾葉薯蕷不同部位各處理組間差異表達(dá)基因的統(tǒng)計(jì)分析

由盾葉薯蕷不同部位H組與Z組(部位-Hvs部位-Z)、N組與Z組(部位-Nvs部位-Z)差異基因統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知(見(jiàn)圖7),在L-HvsL-Z和L-NvsL-Z中分別有8 448、5 009個(gè)基因上調(diào)表達(dá),8 589、3 103個(gè)基因下調(diào)表達(dá);R-HvsR-Z和R-NvsR-Z中分別有11 591、11 739個(gè)基因上調(diào)表達(dá),6 374、5 802個(gè)基因下調(diào)表達(dá);S-HvsS-Z和S-NvsS-Z中分別有9 881、6 066個(gè)基因上調(diào)表達(dá),6 835、13 145個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。

圖7 盾葉薯蕷不同部位各處理組間差異表達(dá)基因的統(tǒng)計(jì)分析Fig.7 Statistical analysis of differentially expressed genes in different parts of D.zingiberensis and treatment groups

2.3.5 盾葉薯蕷各部位不同處理差異表達(dá)基因的KEGG代謝通路分析

2.3.5.1 根莖部位不同處理組差異表達(dá)基因的KEGG代謝通路分析

根莖部位中度脅迫組與重度脅迫組(R-HvsR-Z)、正常組與重度脅迫組(R-NvsR-Z)兩組對(duì)比所得差異基因在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋到132條代謝通路,對(duì)最顯著富集的前20個(gè)通路進(jìn)行分析(見(jiàn)圖8)。兩組共同富集的代謝通路有10條,分別為淀粉和蔗糖代謝(ko00500)、吲哚生物堿生物合成途徑(ko00901)、異黃酮生物合成途徑(ko00943)、精氨酸和脯氨酸代謝(ko00330)、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解(ko00280)、光合作用-天線蛋白質(zhì)(ko00196)、葉酸生物合成(ko00790)、氰氨基酸(ko00460)、苯丙烷類生物合成(ko00940)、二苯乙烯、二芳基庚烷和姜辣素的生物合成途徑(ko00945)。在重度脅迫組與中度脅迫組中,與谷胱甘肽代謝途徑(ko00480)相關(guān)的基因有145個(gè);在重度脅迫組與正常組中,與糖基磷脂酰肌醇(GPI)生物合成途徑(ko00563)相關(guān)的基因有51個(gè),與甘油磷脂代謝(ko00564)相關(guān)的基因有168個(gè)。此外,兩組均有多個(gè)差異基因富集到有機(jī)酸類物質(zhì)的代謝途徑。

圖8 盾葉薯蕷根莖不同處理組差異基因的KEGG代謝通路富集氣泡圖Fig.8 KEGG Pathway enrichment bubble map of differential genes in root of D.zingiberensis in different treatment groups注:A.R-H vs R-Z;B.R-N vs R-Z。

2.3.5.2 葉片部位不同處理組差異表達(dá)基因的KEGG代謝通路分析

葉片部位中度脅迫組與重度脅迫組(L-HvsL-Z)、正常組與重度脅迫組(L-NvsL-Z)兩組對(duì)比所得差異基因在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋到132條代謝通路,對(duì)最顯著富集的前20個(gè)通路進(jìn)行分析(見(jiàn)圖9)。兩組對(duì)比共同富集的代謝通路有6條,分別為磷酸戊糖途徑(ko00030),倍半萜類化合物和三萜類化合物的生物合成(ko00909),硒復(fù)合代謝(ko00450),類黃酮生物合成(ko00941),丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝(ko00250),淀粉和蔗糖代謝(ko00500)。此外,在重度脅迫組與中度脅迫組中,有38個(gè)差異基因富集在倍半萜類化合物和三萜類化合物的生物合成途徑(ko00909)中;在重度脅迫組與正常組中,分別有90、73、32個(gè)差異基因富集在磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)途徑(ko04070)、肌醇磷酸代謝途徑(ko00562)和糖基磷脂酰肌醇(GPI)生物合成途徑(ko00563)。

圖9 盾葉薯蕷葉片不同處理組差異基因的KEGG代謝通路富集氣泡圖Fig.9 KEGG pathway enrichment bubble map of differential genes in D.zingiberensis leaves from different treatment groups注:A.L-H vs L-Z;B.L-N vs L-Z。

2.3.5.3 地上莖部位不同處理差異表達(dá)基因的KEGG代謝通路分析

地上莖部位中度脅迫組與重度脅迫組(S-HvsS-Z)、正常組與重度脅迫組(S-NvsS-Z)兩組對(duì)比所得差異基因在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋到132條代謝通路,對(duì)最顯著富集的前20個(gè)通路進(jìn)行分析(見(jiàn)圖10)。兩組對(duì)比共同富集的代謝通路有11條,分別為甘油磷脂代謝(ko00564),丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝(ko00250),亞油酸代謝(ko00591),精氨酸生物合成(ko00220),萜類骨架生物合成(ko00900),倍半萜類化合物和三萜類化合物的生物合成(ko00909),氰氨基酸代謝(ko00460),基礎(chǔ)切除修復(fù)(ko03410),苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成(ko00400),卟啉和葉綠素代謝(ko00860),氨基酸的生物合成(ko01230)。

圖10 盾葉薯蕷地上莖不同處理組差異基因的KEGG代謝通路富集氣泡圖Fig.10 KEGG Pathway enrichment bubble map of differential genes in the stems of D.zingiberensis from different treatment groups注:A.S-H vs S-Z;B.S-N vs S-Z。

3 討論與結(jié)論

植物的生長(zhǎng)是基因與環(huán)境共同作用的結(jié)果,低磷脅迫下,植物會(huì)通過(guò)體內(nèi)的信號(hào)感受器獲得土壤磷缺乏的信號(hào),通過(guò)復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),啟動(dòng)體內(nèi)與低磷脅迫相關(guān)的基因表達(dá),調(diào)控植物體內(nèi)的生理生化過(guò)程,最終表現(xiàn)出一系列應(yīng)答低磷脅迫的形態(tài)和生理生化特征[24]。本實(shí)驗(yàn)從盾葉薯蕷地下部分發(fā)育特征、各部位SOD、POD活性、根際基質(zhì)S-ACP活性、根際基質(zhì)中磷含量及形態(tài)等多個(gè)指標(biāo)分析低磷脅迫不同磷濃度處理下盾葉薯蕷各部位的響應(yīng)特征,研究表明,Al-P、Fe-P與速效磷等較易被利用的磷在正常組中含量均高于重度脅迫組,尤其是Al-P含量在正常組、中度脅迫組、重度脅迫組依次減少,而且,盾葉薯蕷5個(gè)組織部位各脅迫組的POD活性整體上高于正常組,3個(gè)時(shí)期重度脅迫組根際基質(zhì)酸性磷酸酶的活性均明顯高于正常組,這與土壤磷缺乏時(shí)植物發(fā)生的磷饑餓響應(yīng)相一致[25];另外,研究結(jié)果表明,生長(zhǎng)發(fā)育前期盾葉薯蕷對(duì)低磷脅迫的響應(yīng)較為明顯,后期隨著盾葉薯蕷對(duì)低磷脅迫環(huán)境的適應(yīng),響應(yīng)則逐漸減弱,反應(yīng)特征趨于一致,這在一定程度上說(shuō)明盾葉薯蕷對(duì)低磷脅迫的響應(yīng)及調(diào)節(jié)是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過(guò)程。

代謝調(diào)節(jié)是植物適應(yīng)低磷脅迫的重要機(jī)制,甾體皂苷類成分是盾葉薯蕷主要的次生代謝產(chǎn)物和有效成分,本研究結(jié)果表明低磷脅迫影響盾葉薯蕷中甾體皂苷的合成,而且和生理特征的表現(xiàn)相同,各處理下不同部位的甾體皂苷類成分差異主要表現(xiàn)在脅迫初期。為了進(jìn)一步從基因?qū)用嫣接懚苋~薯蕷對(duì)低磷脅迫的響應(yīng)特征,本研究對(duì)脅迫初期不同處理盾葉薯蕷根莖、葉片、地上莖部位的基因表達(dá)特征進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)從三個(gè)部位中篩選到響應(yīng)低磷脅迫潛在的差異基因主要涉及有機(jī)酸、肌醇、萜類骨架的生物合成及磷酸鹽等多個(gè)代謝途徑,這與根際基質(zhì)中S-ACP活性增強(qiáng)、肌醇參與植物的信號(hào)傳導(dǎo)和逆境調(diào)節(jié)等生命活動(dòng)[26]、萜類物質(zhì)在植物抵抗逆境脅迫發(fā)揮重要作用[27]、磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(PHT)編碼基因在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育、根形態(tài)建成以及調(diào)節(jié)磷素平衡方面起著重要作用[28]一致。

文獻(xiàn)研究[29]報(bào)道盾葉薯蕷中的薯蕷皂苷元主要在葉片中合成,經(jīng)糖基化生成水溶性更好的皂苷后通過(guò)莖轉(zhuǎn)移到根狀莖中儲(chǔ)存,說(shuō)明葉片可能是皂苷類成分主要的合成部位,根莖則為儲(chǔ)存部位,而本研究中低磷脅迫后各處理組差異基因最顯著富集的前20個(gè)通路表明,葉片部位最顯著富集的通路包括磷酸戊糖途徑、倍半萜類和三萜類化合物、肌醇的生物合成等,而根莖部位最顯著富集的通路則為淀粉和蔗糖代謝、吲哚生物堿生物合成途徑等。研究發(fā)現(xiàn)[23,30]參與甾體皂苷合成的相關(guān)基因涉及到萜類化合物合成的甲羥戊酸(MVA)途徑、2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(MEP)途徑以及膽固醇生物合成途徑,這也進(jìn)一步證實(shí)了葉片可能是盾葉薯蕷中皂苷類成分主要的合成部位,那么葉片中和皂苷類成分合成相關(guān)的基因如何響應(yīng)低磷脅迫,后期可利用實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR技術(shù)對(duì)低磷脅迫下盾葉薯蕷葉片中篩選到的涉及萜類骨架、有機(jī)酸、肌醇的生物合成的差異基因的表達(dá)模式進(jìn)行驗(yàn)證,進(jìn)一步確定候選基因并對(duì)其進(jìn)行表征與功能分析,探討其與植物的磷饑餓響應(yīng)和甾體皂苷合成之間的關(guān)聯(lián)性,為研究盾葉薯蕷耐低磷的調(diào)控機(jī)制提供依據(jù)。