宋美營,王立勇,王巧宇,張林松,徐衛(wèi)東,湯 建,聞崇煒*

1江蘇大學藥學院,鎮(zhèn)江 212013;2鎮(zhèn)江市食品藥品監(jiān)督檢驗中心,鎮(zhèn)江 212050;3亳州學院中藥學院,亳州 236800

僵蠶(Bombyx Batryticatus)為家蠶幼蟲在養(yǎng)殖中感染(或人工接種)白僵菌Beauveriabassiana(Bals.) Vuillant致死而形成的副產(chǎn)物,具有息風止痙、祛風止痛、化痰散結(jié)的功效[1]。由于我國“東桑西移”產(chǎn)業(yè)布局的實施,四川與云南成為我國蠶桑產(chǎn)業(yè)大省,也因而成為僵蠶藥材的主要產(chǎn)區(qū)。由于四川產(chǎn)僵蠶比云南產(chǎn)的性狀特征更符合歷代本草典籍及63、77年版藥典所述“身直肥壯、質(zhì)堅色白、斷面光亮”的優(yōu)質(zhì)僵蠶標準,因此市場認可度更高,銷售價格也更高[2-4]。市場調(diào)查中發(fā)現(xiàn)常有商家在銷售中故意混淆兩者產(chǎn)地以牟利,為提高臨床用藥的安全性及有效性,有必要對僵蠶產(chǎn)地鑒定方法開展研究。

眾所周知,中藥材有效成分的形成和積累與其生長的自然條件有著密切關(guān)系,因此產(chǎn)地是影響中藥材質(zhì)量的重要因素之一,建立產(chǎn)地鑒定與溯源方法對滿足消費者了解產(chǎn)品信息的需求、保護生產(chǎn)、加工、銷售企業(yè)的權(quán)益、提升我國藥材在國際市場上的競爭力具有重要作用。廖保生等提出可以基于分子生物學技術(shù)、中藥指紋圖譜技術(shù)、同位素示蹤技術(shù)、無線射頻識別溯源技術(shù)及條形碼技術(shù)進行中藥材的產(chǎn)地鑒定及溯源[5]。蛋白質(zhì)電泳為國際種子檢驗協(xié)會采納的標準品種鑒定方法,但該法尚有分辨率不高、難以進行種內(nèi)鑒定的缺點,難以用于中藥材的產(chǎn)地鑒定與溯源。有鑒于此,本文擬探索將分級沉淀及蛋白質(zhì)電泳技術(shù)相結(jié)合建立分級指紋圖譜技術(shù)的可行性,以此分析云南及四川僵蠶的蛋白質(zhì)組差異,并對所得差異分子進行鑒定及生物信息學分析,挖掘產(chǎn)地鑒定相關(guān)分子,為建立簡便易行、科學準確的產(chǎn)地鑒定方法提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥材

僵蠶藥材購自荷花池、亳州、安國及玉林中藥材市場,四川產(chǎn)僵蠶(以下均簡稱為川產(chǎn))批號分別為:150510、160106、20160420、20150703;云南產(chǎn)僵蠶(以下均簡稱為滇產(chǎn))批號分別為:130101、160512、201512082,經(jīng)江蘇大學藥學院歐陽臻教授鑒定為蠶蛾科昆蟲家蠶BombyxmoriLinnaeus 4～5齡的幼蟲感染白僵菌Beauveriabassiana(Bals.) Vuillant而致死的干燥體。

1.2 試劑

丙烯酰胺(批號:20161017,化學純)、N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺(20111012,含量≥98.0%)、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(TEMED)(含量≥99.0%)、三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)(批號:2021082,含量≥99.0%)、十二烷基硫酸鈉(SDS)(含量≥99.0%)、甘氨酸(Glycine)(批號:C1488777,含量99.0%)、牛血清白蛋白(BSA)等均購自生工生物工程(上海)有限公司。冰醋酸(批號:2016041301)、無水乙醇(批號:2211199)、過硫酸銨(批號:20181018)、三氯醋酸(TCA)(批號:C14297217)、丙酮(批號:20200107)、甘油(批號:T20090224)、EDTA(批號:20140324)純度均為分析純,考馬斯亮藍G-250(批號:71011284,有效分光含量≥85.0%)等購自國藥集團化學試劑有限公司。蛋白質(zhì)分子量標準購自Fermentas公司。

1.3 儀器

FE20型實驗室pH計(Mettler Toledo公司);SpectraMax 190酶標儀(Molecular Devices公司);VE-180垂直電泳槽(上海天能科技有限公司)、DYY-6C穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀(南京馳順科技發(fā)展有限公司);GenoSens 2100 凝膠成像系統(tǒng)(上海勤翔科學儀器有限公司);島津UV-2550紫外分光光度計(Shimadzu公司)、nanoLC-Ultra 1D plus高效液相色譜系統(tǒng)(美國Eksigent Technologies公司);配備Nanospray Flex離子源的TripleTOF 5600 系統(tǒng)(美國AB Sciex公司)。

1.4 方法

1.4.1 僵蠶蛋白質(zhì)提取及定量

僵蠶藥材水洗后置于40 ℃下烘干,粉碎后過70目篩備用。準確稱取多份僵蠶藥材粉末,分別按液料比60∶1(mL/g)加入0.1 mol/L NaAc緩沖液(pH 4.8)、60∶1(mL/g)加入0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.6)、50∶1(mL/g)加入ddH2O、25∶1(mL/g)加入40%EtOH,25 ℃震蕩提取8 h,13 000 r/min離心10 min后取上清液,即得僵蠶酸溶、堿溶、水溶、醇溶性總蛋白質(zhì)。以BSA為標準品,Bradford法測定樣品中蛋白質(zhì)含量并計算提取率,樣品置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 紫外檢測

紫外可見分光光度計在240～500 nm波長范圍內(nèi)對僵蠶蛋白質(zhì)樣品進行全波長掃描,得紫外檢測圖譜。

1.4.3 丙酮分級沉淀

取適量酸溶性蛋白質(zhì)樣品,滴加丙酮至終濃度為10%(V/V),靜置20 min,13 000 r/min離心10 min后取沉淀,得酸溶性蛋白質(zhì)10%沉淀部分,上清繼續(xù)滴加丙酮至終濃度為20%(V/V),13 000 r/min離心10 min后取沉淀,得20%沉淀部分,上清同上處理,繼續(xù)增加丙酮終濃度分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%(V/V),收集各部分沉淀,依次可得30%、40%、50%、60%、70%、80% 分級沉淀部分。同法處理堿溶、水溶、醇溶性蛋白質(zhì)樣品,可得各對應(yīng)分級沉淀樣品。

1.4.4 蛋白質(zhì)電泳(SDS-PAGE)

取上述各分級沉淀樣品,加適量ddH2O及等體積2×上樣緩沖液,煮沸10 min后進行SDS-PAGE[6]。80 V恒壓電泳至溴酚藍指示劑距膠板底部邊緣時結(jié)束電泳。結(jié)束后按常規(guī)方法進行剝膠、固定及染色,隨后脫色至背景無色,電泳條帶清晰。

1.4.5 圖像分析及數(shù)據(jù)處理

采用GenoSens2100型凝膠成像系統(tǒng)采集凝膠圖像,泳道對比以發(fā)現(xiàn)差異蛋白質(zhì)分子,Quantity One 4.6.2軟件進行圖像分析,根據(jù)條帶遷移率計算蛋白質(zhì)分子量,根據(jù)條帶灰度值計算蛋白質(zhì)含量。

1.4.6 液質(zhì)聯(lián)用分析

凝膠中差異蛋白質(zhì)樣品常規(guī)膠內(nèi)酶解后進行分析。液相條件:nanoLC-Ultra 1D plus系統(tǒng),Eksigent C18色譜柱(75 μm × 150 mm,3 μm)分離;流動相: 0.1% 甲酸水溶液(A)-含0.1% 甲酸的乙腈溶液(B);梯度洗脫(0～55 min ,5% →23% B;55～75 min,23%→52%B;75～76 min,52%→80%B;76～80 min,80%B;80～90 min,0%→5%B);流速:300 nL/min;檢測波長:275 nm;柱溫:50 ℃;進樣量:7 μL。質(zhì)譜條件:TripleTOF 5600系統(tǒng),配備Nanospray Flex離子源,正離子模式進行掃描。質(zhì)量范圍m/z:350～1 500;S-Lens RF(射頻電壓)50 V,噴霧電壓2 000 V,氣簾氣壓力2 × 106Pa,霧化氣壓力3.4 × 105Pa,加熱溫度150 ℃,質(zhì)譜掃描方式為IDA模式。一級TOF-MS單張圖譜的掃描時間為250 ms,每次IDA循環(huán)下,最多采集40張電荷為+2～+5且單秒計數(shù)大于120的二級質(zhì)譜,每張二級質(zhì)譜的累積時間為50 ms。

1.4.7 數(shù)據(jù)庫檢索

質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過ProteinPilot (V4.5)檢索,檢索算法為Paragon。使用數(shù)據(jù)庫為UniProt中Beauveria_bassiana和Bombyx_mori的蛋白質(zhì)組參考數(shù)據(jù)庫。檢索參數(shù)如下:Sample Type選Identification;Cys Alkylation選Iodoacetamide;Digestion選Trypsin;Search Effort設(shè)置為Rapid ID。檢索結(jié)果以Unused≥1.3為標準進行篩選,刪去反庫中檢索的條目和污染蛋白,余下鑒定信息用作后續(xù)分析。

1.4.8 生物信息學分析

采用eggNOG5.0(http://eggnog5.embl.de/)對檢索得到的差異表達蛋白質(zhì)分子進行基因同源性分類(Gene ontology,GO)功能注釋分析、京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes,KEGG)代謝通路分析以及蛋白相鄰類聚簇(Cluster of Orthologous Groups of Proteins,COG)功能分析。相關(guān)蛋白質(zhì)詳細信息通過Python實現(xiàn)數(shù)據(jù)可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外光譜檢測

按“1.4.2”所述對僵蠶蛋白質(zhì)樣品在240～500 nm波長范圍內(nèi)進行全波長掃描,結(jié)果顯示,滇產(chǎn)僵蠶的最大吸收波長是277 nm,川產(chǎn)僵蠶的最大吸收波長是279 nm(見圖1),因此后續(xù)液質(zhì)聯(lián)用分析中以275 nm為檢測波長。

圖1 紫外光譜掃描圖 Fig.1 Ultraviolet spectrum scan注:A:滇產(chǎn)僵蠶;B:川產(chǎn)僵蠶。Note:A:Bombyx Batryticatus from Yunnan;B:Bombyx Batryticatus from Sichuan.

2.2 酸溶性蛋白質(zhì)分級指紋圖譜及差異分子研究

以0.1 mol/L NaAc緩沖液(pH 4.8)提取兩地僵蠶藥材的酸溶性總蛋白質(zhì),并對其進行SDS-PAGE指紋圖譜分析,結(jié)果表明兩者相似度極高,難以據(jù)此進行產(chǎn)地鑒定(圖2第1、2泳道)。對酸溶性總蛋白質(zhì)進行分級處理,再對所得分級樣品進行SDS-PAGE指紋圖譜分析,結(jié)果表明10%～30%的丙酮溶液可以沉淀出分子量在27 kDa以上的蛋白質(zhì),40%～60%的丙酮溶液可以沉淀出分子量在5～36 kDa的蛋白質(zhì),70%～80%的丙酮溶液可以沉淀出分子量小于15 kDa的蛋白質(zhì)(圖2第3～18泳道)。滇產(chǎn)及川產(chǎn)僵蠶的酸溶蛋白質(zhì)均有分子量為30.6 kDa 的蛋白質(zhì)(圖2中箭頭A所示),同時分級指紋圖譜對比分析表明,兩種樣品存在4.95、27.11、29.40、30.42、36.91、38.93 kDa的差異蛋白質(zhì)條帶(圖2箭頭B、C、D、E、F、G所示)。

圖2 滇產(chǎn)及川產(chǎn)僵蠶酸溶性總蛋白質(zhì)指紋圖譜及分級指紋圖譜Fig.2 Total protein fingerprints and fractional fingerprints of acid soluble proteins of Bombyx Batryticatus from Yunnan and Sichuan注:1、2:總蛋白質(zhì);3、5、7、9、11、13、15、17:滇產(chǎn)各分級處理樣品;4、6、8、10、12、14、16、18:川產(chǎn)各分級處理樣品;M:蛋白質(zhì)分子量標準。下同。Note:1,2:Total protein;3,5,7,9,11,13,15,17:Sample treated in each grade from Yunnan;4,6,8,10,12,14,16,18:Sample treated in each grade from Sichuan;M:Protein marker.The same below.

2.3 堿溶性蛋白質(zhì)分級指紋圖譜及差異分子研究

以0.1 mol/L Tris-HCl(pH 8.6)緩沖液提取兩地僵蠶藥材的堿溶性總蛋白質(zhì),并對其進行SDS-PAGE指紋圖譜分析,結(jié)果表明兩者相似度極高,條帶覆蓋嚴重,難以據(jù)此進行產(chǎn)地鑒定(圖3第1、2泳道)。對堿溶性總蛋白質(zhì)進行分級處理,再對所得各分級樣品進行SDS-PAGE指紋圖譜分析,結(jié)果表明10%～30%的丙酮溶液可以沉淀出分子量在30 kDa以上的蛋白質(zhì),40%～60%的丙酮溶液可以沉淀出分子量在6～40 kDa的蛋白質(zhì),70%～80%的丙酮溶液可以沉淀出分子量在15 kDa以下的蛋白質(zhì)(圖3第3～18泳道)。同時分級指紋圖譜對比分析表明,兩種樣品存在36.96 kDa高豐度差異蛋白質(zhì)條帶(圖3箭頭H所示)。

圖3 滇產(chǎn)及川產(chǎn)僵蠶堿溶性總蛋白質(zhì)指紋圖譜及分級指紋圖譜Fig.3 Total protein fingerprints and fractional fingerprints of alkaline-dissolved proteins of Bombyx Batryticatus from Yunnan and Sichuan

2.4 水溶性蛋白質(zhì)分級指紋圖譜及差異分子研究

以ddH2O提取兩地僵蠶藥材的水溶性總蛋白質(zhì),并對其進行SDS-PAGE指紋圖譜分析,結(jié)果表明兩者相似度極高,難以據(jù)此進行產(chǎn)地鑒定(圖4第1、2泳道)。對水溶性總蛋白質(zhì)進行分級處理,再對所得各分級樣品進行SDS-PAGE分級指紋圖譜分析,結(jié)果表明,10%～30%的丙酮溶液可以分級沉淀出分子量在25 kDa以上的蛋白質(zhì),40%～60%的丙酮溶液可以分級沉淀出分子量在6～35 kDa的蛋白質(zhì),70%～80%的丙酮溶液可以分級沉淀出分子量在15 kDa以下的蛋白質(zhì)(圖4第3～18泳道)。同時分級指紋圖譜對比分析表明,兩種樣品存在6.84、17.62、51.32 kDa差異蛋白質(zhì)條帶(圖4箭頭I、J、K所示)。

圖4 滇產(chǎn)及川產(chǎn)僵蠶水溶性總蛋白質(zhì)指紋圖譜及分級指紋圖譜Fig.4 Total protein fingerprints and fractional fingerprints of water-dissolved proteins of Bombyx Batryticatus from Yunnan and Sichuan

2.5 醇溶性蛋白質(zhì)分級指紋圖譜及差異分子研究

以40%EtOH溶液提取兩地僵蠶藥材的醇溶性總蛋白質(zhì),并對其進行SDS-PAGE指紋圖譜分析,結(jié)果表明兩者相似度極高,難以據(jù)此進行產(chǎn)地鑒定(圖5第1、2泳道)。對醇溶性總蛋白質(zhì)進行分級處理,再對所得各分級樣品進行SDS-PAGE指紋圖譜分析,結(jié)果表明,10%的丙酮溶液可以分級沉淀出分子量在30 kDa附近的蛋白質(zhì),20%～50%的丙酮溶液可以分級沉淀出分子量在6～36 kDa的蛋白質(zhì),60%～80%的丙酮溶液可以分級沉淀出分子量在20 kDa以下的蛋白質(zhì)(圖5第3～18泳道)。同時分級指紋圖譜對比分析表明,兩種樣品存在6.51、29.19、30.06、31.45、36.57、36.72 kDa差異蛋白質(zhì)條帶(圖5箭頭L、M、N、O、P、Q所示)。

圖5 滇產(chǎn)及川產(chǎn)僵蠶醇溶性總蛋白質(zhì)指紋圖譜及分級指紋圖譜Fig.5 Total protein fingerprints and fractional fingerprints of ethanol-dissolved proteins of Bombyx Batryticatus from Yunnan and Sichuan

2.6 LC-MS/MS分析

切取包含差異蛋白質(zhì)條帶的凝膠,膠內(nèi)酶解后進行LC-MS/MS分析,得總離子流圖(見圖6),共計得到7 593個譜圖,2 238個肽段,ProteinPilot數(shù)據(jù)庫檢索及匹配分析共得到273個差異蛋白質(zhì)分子,其中主要差異蛋白質(zhì)見表1。

表1 滇產(chǎn)及川產(chǎn)僵蠶主要差異蛋白質(zhì)

圖6 僵蠶總離子流圖Fig.6 Total ion chromatograms of Bombyx Batryticatus注:A:滇產(chǎn)僵蠶;B:川產(chǎn)僵蠶。Note:A:Bombyx Batryticatus from Yunnan;B:Bombyx Batryticatus from Sichuan.

2.7 生物信息學分析

對差異蛋白質(zhì)分析進行GO概念注釋分析(見圖7),結(jié)果表明主要涉及細胞過程(20.87%)、代謝過程(19.59%)、應(yīng)答刺激(9.92%)、生物學調(diào)控(9.92%)、發(fā)育過程(6.62%)等生物過程;其中52.04%位于胞內(nèi)細胞器,16.33%位于細胞外表面,9.18%位于外囊狀結(jié)構(gòu),6.12%位于包膜;主要涉及催化活性(57.86%)、結(jié)合活性(28.57%)、抗氧化活性(5.71%)、分子功能調(diào)節(jié)活性(5.00%)、結(jié)構(gòu)分子活性(2.86%);特別是過氧化氫酶(30.77%)、硫氧還蛋白過氧化物酶(15.38%)、維生素B6結(jié)合(15.38%)、幾丁質(zhì)類角質(zhì)層(7.69%)、幾丁質(zhì)結(jié)合(7.69%)等活性。

圖7 差異蛋白質(zhì)分子GO功能注釋結(jié)果Fig.7 GO function annotation results of different protein molecules注:A:生物過程分析;B:細胞組成分析;C:分子功能分析。Note:A:Biological process;B:Cellular process;C:Molecular function.

KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)69、38、30、28個差異蛋白質(zhì)分子分別與代謝性途徑、次生代謝產(chǎn)物合成、不同環(huán)境下微生物代謝、抗生素生物合成相關(guān)。COG分析表明其中25.78%為碳水化合物運輸及代謝相關(guān),23.83%與翻譯后修飾/蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)/伴侶蛋白相關(guān),9.77%與氨基酸運輸及代謝相關(guān),5.08%與防御機制相關(guān),14.84%為功能未知的新蛋白(見圖8)。

圖8 差異蛋白質(zhì)分子KEGG及COG分析結(jié)果Fig.8 Analysis results of KEGG and COG注:A:KEGG分析;B:COG分析。Note:A:KEGG analysis;B:COG analysis results.

研究表明僵蠶形成過程中,白僵菌首先通過分生孢子膨大發(fā)芽以直接穿透表皮而感染家蠶,在入侵家蠶體壁和血腔之初分泌大量的胞外蛋白酶,家蠶因而發(fā)生相應(yīng)的防御反應(yīng),通過表達高水平的蛋白酶抑制劑以響應(yīng)白僵菌入侵[7-9]。本文結(jié)果表明滇產(chǎn)與川產(chǎn)僵蠶的抗胰凝乳蛋白酶、抗胰蛋白酶等因子的表達水平均存在顯著差異,有望用作產(chǎn)地鑒定的分子依據(jù)。此外,酪氨酸降解途徑為動植物體內(nèi)非常重要的代謝途徑,其中斷會引起嚴重的代謝紊亂,延胡索酰乙酰乙酸水解酶為該途徑的末端限速酶[10]。本文結(jié)果也表明該酶也有望用作產(chǎn)地鑒定的分子依據(jù)。

3 討論與結(jié)論

本文提取了滇產(chǎn)與川產(chǎn)僵蠶的酸溶、堿溶、水溶、醇溶性蛋白質(zhì),并分別進行總蛋白質(zhì)及分級指紋圖譜研究,結(jié)果表明兩種僵蠶的總蛋白質(zhì)指紋圖譜相似度很高,難以據(jù)此進行產(chǎn)地鑒定;兩種僵蠶的分級指紋圖譜則有顯著差異,有望用于產(chǎn)地鑒定;分級指紋圖譜提供信息的豐富程度依次為醇溶性蛋白質(zhì)>酸溶性蛋白質(zhì)>水溶性蛋白質(zhì)>堿溶性蛋白質(zhì)。依據(jù)分級指紋圖譜差異共發(fā)現(xiàn)β-葡萄糖苷酶、抗胰凝乳蛋白酶、抗胰蛋白酶、含脂肪酶結(jié)構(gòu)域蛋白等273種特征蛋白質(zhì)分子,這些分子具有轉(zhuǎn)移酶、過氧化氫酶、硫氧還蛋白過氧化物酶等活性,參與多種細胞過程、代謝過程、應(yīng)答刺激、生物學調(diào)控及發(fā)育過程,涉及次生代謝產(chǎn)物合成、不同環(huán)境下微生物代謝、抗生素生物合成、生物防御機制等途徑,體現(xiàn)了不同生境因子對家蠶-白僵菌互作及僵蠶形成具有重要影響,具有用于僵蠶產(chǎn)地鑒定的潛在價值。

道地藥材是中藥學中控制藥材質(zhì)量的一項獨具特色的綜合判別標準,深刻反映了中藥材質(zhì)量與其產(chǎn)地密切相關(guān)[11,12]。建立科學的產(chǎn)地鑒定方法可以為中藥材市場監(jiān)管提供重要的技術(shù)支撐。楊健、張洪坤、宋君等分別依據(jù)穩(wěn)定同位素、礦物元素指紋及DNA條形碼進行了鐵皮石斛、知母、黑木耳的產(chǎn)地鑒定研究[13-15]。分子生藥學研究表明,產(chǎn)地對中藥材質(zhì)量的影響是由于溫度、濕度、光照等生境因子的改變并對相關(guān)基因的表達發(fā)生影響來實現(xiàn)的。蛋白質(zhì)為基因表達的產(chǎn)物,生境因子的改變也必然影響其表達種類與表達豐度,因而其在產(chǎn)地鑒定中的應(yīng)用前景值得關(guān)注。本文結(jié)果表明,云南與四川的不同生境因子對兩地所產(chǎn)僵蠶的蛋白質(zhì)表達有顯著影響,利用分級指紋圖譜可以檢出相應(yīng)差異。與SDS-PAGE及二維凝膠電泳技術(shù)相比,分級指紋圖譜技術(shù)首先將樣品用丙酮處理,使其按疏水性強弱進行分級,再將相似樣品放在同一張凝膠對比,具有操作簡便、分辨率較高、結(jié)果準確、重現(xiàn)性高的優(yōu)點,為其他中藥材的產(chǎn)地鑒定研究提供參考。此外,僵蠶醇溶性蛋白質(zhì)中沒有顯著高豐度分子,構(gòu)建分級指紋圖譜時可以避免條帶之間的相互干擾及覆蓋,可以提供比其他種類蛋白質(zhì)更為豐富的指紋圖譜信息及更好的分辨率,上述結(jié)果也為其他中藥材產(chǎn)地鑒定相關(guān)分子的選擇提供思路。