趙雙雙 吳玉娟

（上海上藥第一生化藥業(yè)有限公司 上海 200240）

注射用尿促性素是一種促性腺激素類藥[1]。主要具有促卵泡生成素（FSH）的作用，促進(jìn)卵巢中卵泡發(fā)育成熟并分泌甾體性激素[2]。可與絨促性素合用，用于治療促性腺激素分泌不足所致的原發(fā)性或繼發(fā)性閉經(jīng)、無(wú)排卵所致的不孕癥等[3]?，F(xiàn)有的注射用尿促性素凍干工藝存在凍干周期長(zhǎng)[4]、凍干過(guò)程不穩(wěn)定[5]、生產(chǎn)能耗高等缺點(diǎn)[6-7]。本研究通過(guò)參數(shù)檢測(cè)確定供試品溶液的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度[8-9]、塌陷溫度[10]，建立響應(yīng)面模型，進(jìn)行全因子和挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)優(yōu)化注射用尿促性素生產(chǎn)工藝參數(shù)，從而實(shí)現(xiàn)縮短凍干周期，降低生產(chǎn)制造能耗，節(jié)約用電成本，使優(yōu)化后的凍干工藝，能夠有效提高注射用尿促性素制品生產(chǎn)過(guò)程穩(wěn)定性和產(chǎn)品質(zhì)量。

1 材料和方法

1.1 試劑與設(shè)備

尿促性素（上海天偉生物制藥有限公司）；Lyostat 5 型凍干顯微鏡（英國(guó)Biopharma 科技有限公司）；DSC 1 型差示掃描量熱儀[梅特勒托利多科技（中國(guó)）有限公司]；Lyo-0.2、0.4 型凍干機(jī)（上海東富龍科技股份有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 差示掃描量熱儀檢測(cè)

將裝有微量液體樣品（約25 μL）的鋁制40 μL 坩堝放置于差示掃描量熱儀檢測(cè)平臺(tái)上，同時(shí)在參比槽上放置空白對(duì)照，采用Star E 程序設(shè)置溫度控制程序，第1 階段從25 ℃降溫至-70 ℃，降溫速率-10 ℃/min，第2 階段由-70 ℃升溫至25 ℃，升溫速率5 ℃/min。檢測(cè)結(jié)束后通過(guò)該程序?qū)Σ钍緬呙枇繜岱ㄇ€（圖1）進(jìn)行分析，在降溫段中出現(xiàn)的放熱峰為樣品的結(jié)晶峰，尿促性素溶液的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度為-23.16 ℃。

圖1 尿促性素溶液示掃描量熱法檢測(cè)曲線

1.2.2 凍干顯微鏡檢測(cè)

吸取2 μL 的樣品置于凍干顯微鏡控溫平臺(tái)上，通過(guò)顯微鏡溫度控制程序Linksys 32 設(shè)置控溫平臺(tái)溫度變化進(jìn)行預(yù)凍，首先降溫至-45 ℃，然后開(kāi)啟真空，在升華過(guò)程中以一定速率升溫（2 ℃/min）。

通過(guò)凍干顯微鏡監(jiān)測(cè)軟件觀測(cè)樣品圖像，-17.3 ℃時(shí)在干燥表面出現(xiàn)亮斑，確定尿促性素的崩解溫度為-17.3 ℃。預(yù)凍制品溫度應(yīng)低于制品的凝固點(diǎn)（玻璃轉(zhuǎn)化溫度）10 ～20 ℃，即尿促性素制品預(yù)凍溫度合理控制范圍應(yīng)為-33.16 ～-43.16 ℃。

2 結(jié)果

2.1 凍干工藝參數(shù)研究

2.1.1 預(yù)凍工藝研究

收集舊凍干工藝預(yù)凍階段板層溫度（理論溫度）與制品溫度數(shù)據(jù)并進(jìn)行擬合（圖2），發(fā)現(xiàn)在-20 ～-30 ℃的溫度區(qū)間，因制品發(fā)生液態(tài)到固態(tài)的物理性質(zhì)轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生放熱，溫度下降速率變慢，導(dǎo)致在該區(qū)間板層溫度與制品溫度線性擬合度降低。

圖2 板層控制溫度與制品溫度擬合圖

為使制品溫度均勻下降，在-25 ℃增加保溫階段。隨著保溫時(shí)間的逐漸增加，制品溫度逐漸降低，保溫65 min 后，制品溫度降至-20.6 ℃，且降溫速率變緩（圖3），因此-25 ℃保溫階段時(shí)長(zhǎng)確定為65 min。

圖3 不同溫度保溫時(shí)間對(duì)制品溫度的影響

在-25 ℃保溫65 min 后，將板層溫度繼續(xù)降溫至-40 ℃并保溫（圖3），隨著保溫時(shí)間的逐漸增加，制品溫度逐漸降低，保溫50 min 后，制品溫度低于-33.2 ℃，滿足溫度控制范圍-33.16 ～-43.16 ℃，保溫滿120 min后，溫度趨于穩(wěn)定不再下降，因此-40 ℃保溫階段時(shí)長(zhǎng)確定為120 min。

2.1.2 一次升華工藝研究

以舊工藝一次升華溫度為參考，選擇（-12.5±7.5）℃為保溫溫度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（圖4），發(fā)現(xiàn)以-20 ℃保溫時(shí)，制品溫度維持在-37.1 ～-26.5 ℃。以-12.5 ℃保溫時(shí)，制品溫度維持在-25.0 ～-20.3 ℃。以-5 ℃保溫時(shí)，制品溫度維持在-18.2 ～-13.1 ℃，且保溫5 ～6 min 后，制品溫度便超出尿促性素樣品的崩解溫度（-17.3 ℃）。因此選擇-12.5 ～-5 ℃為保溫范圍進(jìn)行進(jìn)一步篩選。

圖4 一次升華板層控制溫度和制品溫度變化趨勢(shì)

以2.5 ℃為溫度區(qū)間，分別對(duì)一次升華溫度-12.5 ℃、-10 ℃、-7.5 ℃進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并收集對(duì)應(yīng)的制品溫度（圖5）。一次升華溫度為-7.5 ℃和-10 ℃時(shí)，保溫120 min后制品溫度超出崩解溫度，一次升華溫度為-12.5 ℃時(shí)，保溫120 min 后制品溫度穩(wěn)定低于崩解溫度，因此確定-12.5 ℃為一次升華溫度。

圖5 一次升華溫度對(duì)制品溫度的影響

以-12.5 ℃為一次升華溫度，對(duì)樣品進(jìn)行保溫，通過(guò)水跡線褪去情況考察最優(yōu)的保溫時(shí)間。經(jīng)過(guò)觀察，當(dāng)保溫時(shí)間達(dá)到70 min 后水跡線完全褪去，可認(rèn)為樣品已完成一次升華，可進(jìn)入下一階段。因此，確定一次升華時(shí)間為70 min。

2.1.3 二次升華第一階段工藝研究

對(duì)舊工藝進(jìn)行分析，通過(guò)顯著性分析實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)二次升華溫度（A）、二次升華保持時(shí)間（B）、二次升華箱體真空度（C）對(duì)制品干燥失重（Y）的影響是顯著的，將這3 個(gè)因素作為響應(yīng)因子，壓力升測(cè)試結(jié)果（Y）為響應(yīng)值，通過(guò)Minitab 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，建立3 因素2 水平優(yōu)化表（表1），實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面模型分析3 個(gè)因素之間的交互作用，并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二階多項(xiàng)式擬合，最終得到成品干燥失重得 率與3 個(gè)變量的二次方程模型：

檢驗(yàn)結(jié)果采用方差分析和多元線性回歸分析，使用P和F值評(píng)價(jià)回歸方程的顯著性，模型的P＜0.000 1，表明整個(gè)模型極為顯著，可以用來(lái)研究3 個(gè)因素和響應(yīng)值的交互作用。模型相關(guān)系數(shù)為0.988 3，表明實(shí)際值與模型的預(yù)測(cè)值在絕大多數(shù)情況下高度相關(guān)；修正相關(guān)系數(shù)（0.983 1）略小于模型相關(guān)系數(shù)（0.988 3）且預(yù)測(cè)修正相關(guān)系數(shù)（0.970 4）與修正相關(guān)系數(shù)（0.983 1）的差值＜0.120 0。上述結(jié)果均能表明該響應(yīng)曲面能夠充分反映響應(yīng)值與影響因素之間的準(zhǔn)確聯(lián)系。

通過(guò)響應(yīng)優(yōu)化器對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行尋優(yōu)，預(yù)測(cè)得到二次升華最佳工藝參數(shù)：二次升華溫度5 ℃，二次升華箱體真空度10 Pa，二次升華溫度保持時(shí)間300 min，使用干燥失重法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，壓力升測(cè)試合格（≤1.0 Pa/min）的制品干燥失重結(jié)果為6.5%，超出質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（≤5%），需對(duì)解析干燥階段的工藝參數(shù)進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

2.1.4 二次升華后續(xù)階段工藝研究

對(duì)樣品的保溫溫度進(jìn)行挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示板層溫度最高設(shè)置在40 ℃時(shí)，樣品外觀正常，因此確定二次升華控制溫度設(shè)置為40 ℃。在40 ℃保溫過(guò)程中，觀察發(fā)現(xiàn)部分樣品在制品溫度升至20 ℃時(shí)浮起，測(cè)量溫度發(fā)現(xiàn)浮起的樣品制品溫度明顯低于正常樣品。

在干燥過(guò)程中因升溫速率快、升華速率增快，導(dǎo)致部分樣品浮起，為使制品溫度均勻上升，增加20 ℃保溫階段。以20 ℃為保溫溫度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察保溫時(shí)間及箱體真空度。

分別考察箱體真空度為1、10、20 和30 Pa 時(shí)，制品溫度變化情況。當(dāng)箱體真空度數(shù)值設(shè)置為30 Pa 時(shí)，制品溫度最高可升至19.4 ℃，在保溫110 min 后制品溫度不再上升（圖6）。因此確定20 ℃保溫階段時(shí)，箱體真空度30 Pa，保溫時(shí)間110 min。

圖6 二次升華不同真空度對(duì)制品溫度的影響

在40 ℃保溫階段，通過(guò)2×2 全因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（表3），考察箱體真空度（D）和保溫時(shí)間（E）對(duì)注射用尿促性素的干燥失重（R）的影響。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表4），真空度為30 Pa，40 ℃保溫720 min 后注射用尿促性素干燥失重值最低。

表3 全因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

表4 全因子實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為提高生產(chǎn)效率，減少能源消耗，縮短凍干周期，以真空度30 Pa，保溫溫度40 ℃為條件，干燥失重≤1.0%為目標(biāo)值，對(duì)保溫時(shí)間進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。保溫210 min 后注射用尿促性素干燥失重＜1.0%，220 min 后干燥失重隨保溫時(shí)間的延長(zhǎng)趨于穩(wěn)定，因此將保溫時(shí)間確定為220 min（圖7）。

圖7 二次升華保溫時(shí)間對(duì)干燥失重的影響

2.2 凍干工藝驗(yàn)證

使用優(yōu)化后的凍干工藝，連續(xù)進(jìn)行3 個(gè)批次的樣品凍干，在每一批的板層的四角和中心布置5 個(gè)取樣點(diǎn)，分別對(duì)不同凍干板層的樣品進(jìn)行抽樣，并檢測(cè)其干燥失重，以驗(yàn)證優(yōu)化后的凍干工藝的凍干效果。

對(duì)3 批15 個(gè)樣品的干燥失重進(jìn)行檢測(cè)，最大值為0.9%，最小值為0.5%，平均值為0.74%（表5）。優(yōu)化后凍干工藝條件下，凍干出的制品干燥失重符合中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)。

表5 3批樣品干燥失重分布（%）

3 討論

優(yōu)化得到的注射用尿促性素的新凍干工藝：預(yù)凍溫度-25 ℃和-40 ℃，分別維持65 min 和120 min；一次升華溫度-12.5 ℃，維持70 min；二次升華溫度分別為5、20、40 ℃，維持300、110、220 min。

本工藝相對(duì)舊工藝，明確凍干各階段的關(guān)鍵工藝參數(shù)并新增多個(gè)溫度平臺(tái)細(xì)化，有效降低產(chǎn)品干燥失重，提高產(chǎn)品質(zhì)量和穩(wěn)定性；將凍干周期從22 h 縮短至18.5 h，實(shí)現(xiàn)降低生產(chǎn)能耗，提高生產(chǎn)效率和過(guò)程穩(wěn)定性的目的。本工藝小規(guī)模生產(chǎn)結(jié)果良好，表明本研究的方法和實(shí)驗(yàn)路徑科學(xué)，但仍需在正式生產(chǎn)線上進(jìn)行更多批次的生產(chǎn)，收集更多數(shù)據(jù)從以驗(yàn)證本工藝是否適宜應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中。