田甜，李軍喬，馬斌，王鑫慈，曲俊儒

（1. 青海民族大學(xué)生態(tài)環(huán)境與資源學(xué)院，青海 西寧 810007；2. 青海省特色經(jīng)濟(jì)植物高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810007；3. 青藏高原蕨麻產(chǎn)業(yè)研究院，青海 西寧 810007；4. 青海省湟源縣種子站，青海 西寧 811699）

蕨麻（Potentilla anserina）屬薔薇科（Rosaceae）委陵菜屬，是鵝絨委陵菜的變種。鵝絨委陵菜在世界及中國分布廣泛，只在青藏高原等高寒地區(qū)根系才膨大為塊根，稱為“蕨麻”。蕨麻塊根為圓球狀、紡錘狀或棒狀，可食用或藥用，俗稱“人參果”“延壽果”，《晶珠本草》《西寧府新志》《中國藏藥志》《四部醫(yī)典》中均有記載[1-5］。據(jù)本課題組測(cè)定，塊根富含淀粉、蛋白質(zhì)、氨基酸、礦質(zhì)元素、多糖、皂苷、總黃酮和鞣質(zhì)等營養(yǎng)及活性成分，質(zhì)糯，味甜，口感佳，具有抗缺氧、增強(qiáng)免疫力、保肝護(hù)肝、干擾病毒復(fù)制、抑制腫瘤細(xì)胞生長等功效[6-10］。民間將其作為食品及藏藥已經(jīng)使用了上千年，市場(chǎng)價(jià)值有增無減。農(nóng)牧民將采挖野生蕨麻作為主要的經(jīng)濟(jì)來源，導(dǎo)致當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境的惡化，野生蕨麻儲(chǔ)藏量和品質(zhì)逐年下降。為了解決生態(tài)、生產(chǎn)和發(fā)展的矛盾，本課題組對(duì)蕨麻進(jìn)行了人工馴化、品種審定，通過20 年的研究，蕨麻種植已成為青海省和甘肅省的一個(gè)產(chǎn)業(yè)。

蕨麻系典型的克隆植物，具有豐富的匍匐莖，人工栽培條件下以無性繁殖為主。無性繁殖時(shí)，由塊根長出基株，基株向四周生長出10~20 條一級(jí)匍匐莖，紫紅色或綠色，生長迅速，匍匐莖每隔3~5 cm 生長出一個(gè)分株，分株處又生長出2、3 級(jí)匍匐莖。一株蕨麻一年生長量可覆蓋3~5 m2土地。每個(gè)分株下的根系均可膨大，來年每個(gè)塊根均可作為基株繼續(xù)繁殖，如此周而復(fù)始，覆蓋面積逐年增大，野外條件下具體繁殖面積不明。蕨麻還具有完整的花器，花冠5 枚，雄蕊和雌蕊20 枚以上，可產(chǎn)生生物學(xué)種子。人工條件下花朵種子結(jié)實(shí)率不足10%，種子萌發(fā)率約為2%，難以成活。課題組前期試驗(yàn)結(jié)果表明，蕨麻有性和無性繁殖并存，人工栽培時(shí)，蕨麻繁殖以無性為主，自然條件下，無性和有性繁殖比率相當(dāng)，有性繁殖占比高于人工栽培，花粉傳播主要依靠昆蟲[11］，傳播距離不明。由于野外條件下蕨麻生長了幾千年甚至上萬年，每年蕨麻都以無性繁殖及有性繁殖方式進(jìn)行繁殖，個(gè)體遺傳距離不明確，更無法確定野外狀況下的采樣距離，導(dǎo)致采樣時(shí)居群內(nèi)個(gè)體間和居群間的距離無法確定，對(duì)采樣及遺傳分析造成了極大的困擾。

目前對(duì)于蕨麻有性繁育和遺傳學(xué)方面的研究較少，課題組通過對(duì)蕨麻簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat， SSR）研究發(fā)現(xiàn)，地理距離較遠(yuǎn)的兩個(gè)樣本在親緣關(guān)系上可以非常近，聚為一支[9，12］，這與蕨麻是兼性克隆植物有關(guān)[13］。SSR 多用于研究物種遺傳多樣性、指紋圖譜、遺傳結(jié)構(gòu)等，馬斌等[14］利用SSR 分子標(biāo)記構(gòu)建了蕨麻3 個(gè)品種的指紋圖譜，魏姍姍等[15］用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)分析了95 份桃（Prunus persica）品種的遺傳多樣性。課題組使用磁珠富集法開發(fā)的SSR 引物，為蕨麻基因組學(xué)研究、育種進(jìn)程提供了新的分子標(biāo)記技術(shù)[12］。

野外采樣時(shí)，如何有效避免采集的樣品來自同一親本，主要考慮因素為蕨麻無性繁殖距離為多遠(yuǎn)，是否存在有性繁殖，有性繁殖花粉能傳播多遠(yuǎn)等。國內(nèi)外關(guān)于蕨麻的研究主要側(cè)重于克隆習(xí)性、化學(xué)成分、藥理活性等方面，蕨麻栽培技術(shù)、生物學(xué)特性、有性繁殖、分子標(biāo)記等方面的研究均為本課題組發(fā)表的論文，關(guān)于蕨麻采樣策略的分子生物學(xué)研究未見報(bào)道[16-24］。蕨麻無性繁殖的距離在人工種植情況下從形態(tài)上難以區(qū)分蕨麻的不同親本，而蕨麻種子結(jié)實(shí)率低，萌發(fā)率低，雜交不親和，常規(guī)方法無法完成蕨麻有性繁殖的研究。為明確蕨麻個(gè)體和居群間的采樣距離，本研究利用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)研究野生蕨麻的遺傳相似性，確定自然狀態(tài)下野生蕨麻的采樣策略和距離，為野生蕨麻樣品采集、選育和馴化等方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況與試驗(yàn)材料

基于蕨麻在西北高原地區(qū)的分布面積，試驗(yàn)分別選取青海省、甘肅省、四川省和西藏自治區(qū)為主要地區(qū)，分別在不同地區(qū)選取不同的居群數(shù)量進(jìn)行試驗(yàn)。2017 年5-7 月，采樣路線及地點(diǎn)結(jié)合蕨麻分布面積和青藏高原山脈分布選定。甘肅省和四川省蕨麻分布面積小，各設(shè)置1 個(gè)居群，甘肅省為碌曲縣（原點(diǎn)：34°48′54″E，102°43′38″N），四川省為若爾蓋縣（原點(diǎn)：33°59′52″ E，102°46′14″ N）；青海省和西藏自治區(qū)蕨麻分布面積大，各設(shè)置2 個(gè)居群，青海省為河南縣（原點(diǎn)：34°47′21″ E，101°33′06″ N）和祁連縣（原點(diǎn)：37°38′35″ E，101°25′31″ N），西藏自治區(qū)為八宿縣（原點(diǎn)：31°20′51″ E，97°36′27″ N）和南木林縣（原點(diǎn)：29°33′59″ E，89°04′32″ N）。樣品采集共6 個(gè)居群。采樣方法為選取一個(gè)原點(diǎn)，沿直線采樣。其中，由于青藏高原海拔高、地形復(fù)雜，山脈眾多，蕨麻居群采樣并不完全是直線（采樣分布見圖4，圖6，圖8，圖10，圖12 和圖14）。

圖1 6 個(gè)蕨麻居群的UPGMA 聚類樹Fig.1 UPMGA cluster trees for six P. anserina populations

采樣時(shí)，以第一個(gè)采樣點(diǎn)為原點(diǎn)，后分別在距離原點(diǎn)1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50、60、80、90、100、120、150、160、200、250、300、400、500、1000、1500、2000、2500、5000、10000、15000、20000、30000、40000、50000 m處采樣，1000 m 以內(nèi)的距離用測(cè)輪測(cè)量，1000 m 以上的距離用汽車測(cè)量。采集新鮮、無病斑、幼嫩的蕨麻葉片，放入硅膠袋中，備用。調(diào)查、記錄每一個(gè)樣本的采集地海拔和經(jīng)緯度等信息。采樣點(diǎn)基本信息見表1（伴生植物所列物種在所有采樣點(diǎn)中均有）。

表1 采樣點(diǎn)基本信息Table 1 Basic information of sampling points

1.2 試劑與儀器

1.2.1 DNA 提取試劑 1 mol·L-1Tris-HCL （pH 8.0）、0.5 mol·L-1EDTA（pH 8.0）、5 mol·L-1NaCl、2×CTAB 緩沖溶液、氯仿/異戊醇（24∶1）、異丙醇、75%乙醇、無水乙醇、50×TAE 緩存溶液、4S Red Plus 核酸染色劑（10000×水溶液）、6×Loading buffer 上樣緩沖液，試劑均為分析純。

1.2.2 PCR 反應(yīng)試劑 Taq 酶、dNTP、10×PCR Buffer，由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。

1.2.3 試驗(yàn)儀器 GR60DP 高壓蒸汽滅菌鍋（ZEAL WAY INSTRUMENT INC）、Neofuge 23R 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（香港）、Scientz-192 高通量組織研磨儀（寧波）、MiniBIS pro 凝膠成像系統(tǒng)（以色列）、Mastercycle pro PCR 儀（德國）、3730XL3730XL 測(cè)序儀（美國）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 DNA 提取及檢測(cè) 本試驗(yàn)采用試劑盒改良CTAB 法[25-26］提取6 個(gè)居群210 份樣本的DNA。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA 濃度，用滅菌的去離子水稀釋濃度至50 ng·μL-1，保存于4 ℃冰箱中備用。

1.3.2 引物信息與SSR 標(biāo)記擴(kuò)增 試驗(yàn)所用引物為課題組已篩選出的具有高度多態(tài)性的SSR 引物[9，12］，具體信息見表2。

表2 SSR 引物序列信息Table 2 The information of SSR primer sequence

用篩選出的SSR 引物對(duì)210 個(gè)蕨麻個(gè)體材料進(jìn)行SSR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增體系總體積為20 μL：Taq（5 U·μL-1）0.14 μL、dNTP（15 mmol·L-1）1.6 μL、Buffer（10×） 2.0 μL、正向引物（20 μmol·L-1）0.4 μL、反向引物（20 μmol·L-1） 0.4 μL、DNA（50 ng·μL-1）2.5 μL、ddH2O 12.96 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，54 ℃（退火溫度以優(yōu)化的為標(biāo)準(zhǔn)）復(fù)性35 s，72 ℃延伸40 s，共35 個(gè)循環(huán)，最終72 ℃延伸3 min。PCR 產(chǎn)物保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 毛細(xì)管電泳 將甲酰胺與分子量內(nèi)標(biāo)按體積比100∶1 混合均勻，在測(cè)序儀上樣板中加入9 μL，再加入1 μL 稀釋10 倍的PCR 產(chǎn)物[26］。毛細(xì)管電泳使用3730XL 測(cè)序儀進(jìn)行，利用GeneMarker 中的Fragment（Plant）片段分析軟件對(duì)得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。比較各泳道內(nèi)分子量內(nèi)標(biāo)的位置與各樣品峰值的位置，分析片段大小[27］。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用GeneMarker 軟件的等位基因峰圖對(duì)210 份材料、20 對(duì)引物組合擴(kuò)增得到的4200 個(gè)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，根據(jù)擴(kuò)增有條帶和無條帶統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，修正后（有條帶為擴(kuò)增陽性，記為1；相應(yīng)位置無條帶為擴(kuò)增陰性，記為0）轉(zhuǎn)為0/1 的數(shù)列格式，建立原始數(shù)列矩陣，利用POPGENE 32[28］、NTSYS-pc 2.10e[29］和GenAIEx 6.5[30］等軟件進(jìn)行后續(xù)分析。

利用POPGENE 32 軟件對(duì)6 個(gè)居群210 份樣本的原始（0，1）數(shù)值矩陣進(jìn)行遺傳多樣性分析，并計(jì)算多態(tài)性指數(shù)（polymorphic information content， PIC）[31］，計(jì)算公式為：

式中：Pij表示標(biāo)記i的第j個(gè)等位基因在群體中的分布頻率；標(biāo)記i的總等位基因?yàn)?~n[32］，n是等位基因數(shù)目。

利用NTSYS-pc 2.10e 軟件對(duì)6 個(gè)居群210 份樣本的原始（0，1）數(shù)值矩陣進(jìn)行處理，運(yùn)用clustering 程序中的SHAN 程序進(jìn)行非加權(quán)組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means， UPGMA）聚類分析，繪制親緣關(guān)系樹狀圖。

運(yùn)用GenAlEx 6.5 軟件，依據(jù)居群遺傳距離對(duì)6 個(gè)居群作主成分分析，同時(shí)進(jìn)行空間自相關(guān)分析，以揭示空間距離和遺傳距離之間的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR 擴(kuò)增結(jié)果

提取的DNA 質(zhì)量為500 ng·μL-1以上，純度為1.8，達(dá)到SSR-PCR 擴(kuò)增條件。利用20 對(duì)核心引物對(duì)蕨麻210 份材料進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，然后通過毛細(xì)管電泳檢測(cè)分析。20 對(duì)引物一共擴(kuò)增出93 個(gè)多態(tài)性片段（表3），擴(kuò)增片段大小為78~306 bp。擴(kuò)增片段最小引物為P40，最大引物是P24。在20 對(duì)SSR 位點(diǎn)共檢測(cè)出93 個(gè)等位基因，每對(duì)引物檢測(cè)出2~7 個(gè)等位基因，平均為4.65 個(gè)。20 個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性指數(shù)（PIC）變化為0.25~0.82，平均為0.61；SSR 引物P3 和P19 獲得的等位基因數(shù)最多（7 個(gè)），PIC 值分別為0.82 和0.80；引物P34 獲得的等位基因數(shù)最少（2個(gè)），PIC 值為0.25。PIC 值可作為判斷SSR 引物多態(tài)性高低的指標(biāo)[31］，本試驗(yàn)中90%以上的引物PIC>0.5，表明試驗(yàn)中所篩選的引物具有高度多態(tài)性，擴(kuò)增結(jié)果可反映蕨麻資源的遺傳多樣性。

表3 20 對(duì)核心引物多態(tài)性指數(shù)Table 3 The polymorphic information content of 20 SSR primers

2.2 遺傳多樣性分析

利用POPGENE 32 軟件分析得到蕨麻6 個(gè)居群的遺傳參數(shù)（表4），祁連縣居群（QLX）的遺傳多樣性最高[平均雜合度（average heterozygosity，H）=0.2797，香農(nóng)指數(shù)（Shannon index，I）=0.4287］。河南縣居群（HNX）的遺傳多樣性最低（H=0.2273，I=0.3542）。6 個(gè)居群遺傳多樣性由高到低依次為QLX>LQX>BSX>NMX>REG>HNX。

表4 6 個(gè)蕨麻居群的遺傳多樣性Table 4 Genetic diversity of the six P. anserina populations

利用GenAIEx 6.5 對(duì)蕨麻6 個(gè)居群進(jìn)行AMOVA 分析，結(jié)果顯示（表5），主要變異來源于居群內(nèi)，占比84%，居群間占有16%的遺傳變異。

表5 蕨麻6 個(gè)群體分子方差分析Table 5 AMOVA analysis of six P. anserina populations

通過計(jì)算群體間的遺傳分化系數(shù)及基因流，河南縣居群和碌曲縣居群之間的基因流最大（Nm=0.986），說明兩個(gè)居群之間進(jìn)行基因交流的頻率較多，從而使得遺傳分化指數(shù)較低（Fst=0.014），這與遺傳分析結(jié)果一致。八宿縣居群和楠木林縣居群之間的遺傳分化指數(shù)最大（Fst=0.084），基因流最低（Nm=0.919），說明兩個(gè)居群之間遺傳多樣性較低，大型山脈的阻隔可能為主要原因。同時(shí)，6 個(gè)居群之間的遺傳分化指數(shù)（Fst）都小于0.1（<0.15），說明整體的遺傳分化比較小。群體之間的基因流在0.900 以上，表示群體間遺傳差異較?。ū?）。

表6 蕨麻群體間的遺傳分化系數(shù)和基因流Table 6 The Fst and Nm among P. anserina populations

蕨麻6 個(gè)居群的遺傳相似度和遺傳距離顯示（表7），各居群間的遺傳相似度高，為0.9194~0.9860，遺傳距離也較近，為0.0141~0.0840。其中，碌曲縣居群和河南縣居群的遺傳距離最小，遺傳一致度最大；南木林縣居群和八宿縣居群遺傳距離最大，遺傳一致度最小。

表7 蕨麻各居群之間的遺傳相似度與遺傳距離Table 7 Genetic identity and genetic distance of six P. anserina populations

基于POPGENE 32 分析結(jié)果，在歐式聚類平均法（UPGMA）計(jì)算中得出，當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.98 時(shí)，6 個(gè)居群分為4 組（圖1），南木林縣（NMX）、祁連縣（QLX）以及八宿縣（BSX）各自單獨(dú)聚類為一組，碌曲縣（LQX）、河南縣（HNX）和若爾蓋縣（REG）聚為一組（Cluster 2），各群體間距離依次增大，親緣關(guān)系也逐漸變遠(yuǎn)。其中，Cluster 2 包括兩個(gè)亞組，Cluster 2A 包括2 個(gè)群體，為碌曲縣（LQX）和河南縣（HNX），Cluster 2B 包括1 個(gè)群體，為若爾蓋縣（REG）。

利用GenAIEx 6.5 對(duì)6 個(gè)蕨麻群體的210 個(gè)樣本進(jìn)行主成分分析（圖2），結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致，碌曲縣、河南縣以及若爾蓋縣按照居群聚為一簇，這與其地理位置有關(guān)，中間沒有橫亙山脈，為其進(jìn)行基因交流提供了便利；而遺傳多樣性較高的居群，如祁連縣、南木林縣和八宿縣，由于居群內(nèi)個(gè)體遺傳背景差異較大，聚類較分散，均單獨(dú)聚為一類。

圖2 210 個(gè)蕨麻個(gè)體的主成分分析Fig. 2 PCoA analysis of 210 individuals in P. anserina populations

南木林縣、祁連縣以及八宿縣分布較為分散，其間的大型山脈阻隔是主要原因。其中，南木林縣和八宿縣的個(gè)體最為分散，沒有規(guī)律性，這可能與地理距離有關(guān)。

2.3 遺傳采樣策略

依據(jù)20 對(duì)引物對(duì)每個(gè)地區(qū)蕨麻樣品的擴(kuò)增點(diǎn)位，構(gòu)建（0，1）的數(shù)列矩陣，利用NYSYS 2.1 對(duì)蕨麻6 個(gè)居群進(jìn)行分析，對(duì)每個(gè)居群內(nèi)的蕨麻樣品進(jìn)行UPGMA 聚類，并對(duì)各居群遺傳距離矩陣和地理距離矩陣進(jìn)行相關(guān)性計(jì)算（Mantel 檢驗(yàn)）。

根據(jù)碌曲縣蕨麻樣品UPGMA 聚類（圖3）可知，該地區(qū)蕨麻個(gè)體間遺傳距離較近，遺傳距離最大為0.58。根據(jù)聚類分析及采樣點(diǎn)分布（圖3 和圖4），該地區(qū)蕨麻個(gè)體間遺傳距離隨地理距離的增大呈逐步增加的態(tài)勢(shì)，且大概30 號(hào)以前的樣品間遺傳距離較近，而30 號(hào)以后的樣品與30 號(hào)以前的樣品間遺傳距離逐步增大。以30 號(hào)樣品為分界線，分別為5 km 以內(nèi)的個(gè)體與5 km 以上的個(gè)體，表明在一定范圍內(nèi)為同一克隆的可能性更大。遺傳距離和地理距離相關(guān)性顯示（圖4），R2=0.0086，P=0.13>0.05，兩者之間沒有顯著的聯(lián)系。表示聚類并不完全按照地理距離進(jìn)行，蕨麻個(gè)體與地理距離相關(guān)性較差，這與采樣個(gè)體分布于盤山地區(qū)，沒有較強(qiáng)的地理隔離有關(guān)。

圖3 甘肅省碌曲縣蕨麻樣品UPGMA 聚類分析Fig.3 The UPGMA cluster analysis of P. anserina samples in Luqu County， Gansu Province

圖4 甘肅省碌曲縣蕨麻遺傳距離與地理距離相關(guān)性分析及采樣路線Fig. 4 Sample path and mantle test of relationship between genetic distance and geographic distance of P. anserina in Luqu County， Gansu Province

根據(jù)若爾蓋縣（REG）蕨麻樣品UPGMA 聚類（圖5）得出，群體內(nèi)遺傳距離較近，遺傳距離最大為0.60。根據(jù)聚類分析及采樣點(diǎn)分布（圖5 和圖6）得出，該地區(qū)蕨麻個(gè)體采樣點(diǎn)均分布于較為平坦的山丘地區(qū)，遺傳距離和地理距離相關(guān)性顯示（圖6），R2=0.0248，P=0.06>0.05，兩者之間沒有顯著的聯(lián)系，表明該地區(qū)的蕨麻個(gè)體間遺傳距離與地理距離相關(guān)性較差，且蕨麻個(gè)體間遺傳距離較為復(fù)雜。該居群的平均雜合度（H）、香農(nóng)指數(shù)（I）高達(dá)0.2407 和0.3709（表4），表示其遺傳多樣性較高，這與該地區(qū)地勢(shì)較為平坦，且多為草原地帶，蕨麻個(gè)體間無明顯的地理隔離，導(dǎo)致基因交流較頻繁有關(guān)。

圖5 四川省若爾蓋縣蕨麻樣品UPGMA 聚類分析Fig.5 The UPGMA cluster analysis of P. anserina samples in Ruoergai County， Sichuan Province

圖6 四川省若爾蓋縣蕨麻遺傳距離與地理距離相關(guān)性分析及采樣路線Fig. 6 Sample path and mantle test of relationship between genetic distance and geographic distance of P. anserina in Ruoergai County， Sichuan Province

根據(jù)河南縣蕨麻樣品UPGMA 聚類（圖7）可知，該地區(qū)蕨麻遺傳距離較近，遺傳距離最大為0.59。根據(jù)聚類分析及采樣點(diǎn)分布（圖7 和圖8），在遺傳距離為0.76 處，以30 號(hào)蕨麻樣品為分界線，蕨麻樣品被聚為兩類，分別為5 km 以內(nèi)的蕨麻個(gè)體與5 km 以上的蕨麻個(gè)體。遺傳距離和地理距離相關(guān)性顯示（圖8），R2趨近于0，P=0.45>0.05，兩者之間沒有顯著的聯(lián)系，這與該地區(qū)蕨麻采樣點(diǎn)分布于較平坦的地區(qū)，沿直線排布有關(guān)，無明顯地理隔離導(dǎo)致蕨麻個(gè)體間基因交流較多。

圖7 青海省河南縣蕨麻樣品UPGMA 聚類分析Fig.7 The UPGMA cluster analysis of P. anserina samples in Henan County， Qinghai Province

圖8 青海省河南縣蕨麻遺傳距離與地理距離相關(guān)性分析及采樣路線Fig. 8 Sample path and mantle test of relationship between genetic distance and geographic distance of P. anserina in Henan County， Qinghai Province

根據(jù)祁連縣蕨麻樣品UPGMA 聚類（圖9）可知，該地區(qū)蕨麻遺傳距離較近，遺傳距離最大為0.54。根據(jù)聚類分析及采樣點(diǎn)分布（圖9 和圖10）可知，1~29 號(hào)樣品被明顯聚為一類，這些樣品的采樣點(diǎn)均為5 km 以內(nèi)，30~36號(hào)樣品被聚為一類，這些樣品采樣點(diǎn)距離均為5 km 以上。遺傳距離和地理距離相關(guān)性顯示（圖10），R2=0.1982，P=0.01<0.05，兩者之間有顯著的聯(lián)系，表明該地區(qū)蕨麻個(gè)體樣品間遺傳距離也隨著地理距離的增加而增大。該地區(qū)蕨麻采樣點(diǎn)分布較均勻，并按照一定的直線排布，蕨麻個(gè)體間遺傳距離與地理距離相關(guān)性較好。

圖9 青海省祁連縣蕨麻樣品UPGMA 聚類分析Fig.9 The UPGMA cluster analysis of P. anserina samples in Qilian County， Qinghai Province

圖10 青海省祁連縣蕨麻遺傳距離與地理距離相關(guān)性分析及采樣路線Fig. 10 Sample path and mantle test of relationship between genetic distance and geographic distance of P. anserina in Qilian County， Qinghai Province

根據(jù)八宿縣蕨麻樣品UPGMA 聚類（圖11），蕨麻遺傳距離較近，遺傳距離最大為0.63。由聚類分析及采樣點(diǎn)分布（圖11 和圖12）可知，該地區(qū)蕨麻個(gè)體采樣點(diǎn)均分布于山谷中間，且地勢(shì)較復(fù)雜。遺傳距離和地理距離相關(guān)性顯示（圖12），R2=0.0118，P=0.16>0.05，兩者之間沒有顯著聯(lián)系。蕨麻個(gè)體間遺傳距離與地理距離相關(guān)性較差。由于西藏八宿縣位于橫斷山脈，地理情況較為復(fù)雜，且該地區(qū)為冰川期野生植物的避難所，遺傳多樣性較豐富，基因交流較為頻繁，但該地區(qū)部分蕨麻個(gè)體采樣點(diǎn)分布不是按照直線排布，所以出現(xiàn)蕨麻個(gè)體間遺傳距離與地理距離無明顯相關(guān)的現(xiàn)象。

圖12 西藏自治區(qū)八宿縣蕨麻遺傳距離與地理距離相關(guān)性分析及采樣路線Fig. 12 Sample path and mantle test of relationship between genetic distance and geographic distance of P. anserina in Baxoi County， Tibet Autonomous Region

根據(jù)南木林縣蕨麻樣品UPGMA 聚類（圖13）可以得出，該地區(qū)蕨麻遺傳距離較近，遺傳距離最大為0.54。根據(jù)聚類分析及采樣點(diǎn)分布（圖13 和圖14）可知，該地區(qū)蕨麻個(gè)體間遺傳距離隨地理距離的增加而增大，具有一定的相關(guān)性。蕨麻個(gè)體間遺傳距離均較近，5 km 以上的蕨麻個(gè)體與5 km 以內(nèi)的蕨麻個(gè)體遺傳距離較近，并沒有明顯的距離劃分。遺傳距離和地理距離相關(guān)性（圖14）顯示，R2=0.0204，P=0.13>0.05，兩者之間沒有顯著聯(lián)系。蕨麻個(gè)體間遺傳距離與地理距離相關(guān)性較差。這與該地區(qū)呈兩邊為高山，中間為狹長的河谷地區(qū)，蕨麻個(gè)體間基因交流并無明顯的阻隔有關(guān)。

圖13 西藏自治區(qū)南木林縣蕨麻樣品UPGMA 聚類分析Fig.13 The UPGMA cluster analysis of P. anserina samples in Nanmulin County， Tibet Autonomous Region

圖14 西藏自治區(qū)南木林縣蕨麻遺傳距離與地理距離相關(guān)性分析及采樣路線Fig. 14 Sample path and mantle test of relationship between genetic distance and geographic distance of P. anserina in Nanmulin County， Tibet Autonomous Region

3 討論

3.1 遺傳多樣性分析

本試驗(yàn)使用20 對(duì)SSR 引物對(duì)蕨麻6 個(gè)居群210 個(gè)樣本進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，共擴(kuò)增出93 個(gè)多態(tài)性片段，平均PIC值為0.6145，根據(jù)Botstein 等[31］的劃分標(biāo)準(zhǔn)，20 對(duì)引物平均表現(xiàn)出高多態(tài)性，表明這些位點(diǎn)可用于蕨麻種質(zhì)的遺傳多樣性分析。

多態(tài)位點(diǎn)百分率（percentage of polymorphic bands，PPB）在一定程度上可以反映物種的遺傳多樣性[33］，兩者一般呈正相關(guān)，PPB 越大說明物種對(duì)環(huán)境適應(yīng)得越好，容易擴(kuò)展其分布范圍和開拓新的環(huán)境，遺傳多樣性也越豐富。本研究中各居群的PPB 均在80%以上，最高達(dá)91.40%（碌曲縣），說明蕨麻的遺傳多樣性豐富。蕨麻具有較高的遺傳多樣性，同時(shí)也具有中等水平的遺傳變異。一般認(rèn)為，克隆植物遺傳多樣性都比較低[34］，但在蕨麻中顯示出了不同的結(jié)果。越來越多的研究表明克隆植物的種群也可以保持很高的遺傳多樣性，兼性有性生殖可以有效補(bǔ)償遺傳變異的損失，在種群內(nèi)提高遺傳變異，以此來消減種群間的遺傳變異；或者通過基因突變來提高遺傳變異，如三葉 草（Trifolium）、蒲公英（Taraxacum mongolicum）等[35］。劉春 香等[36］對(duì) 匍匐莖克 隆植物蛇 莓（Duchesnea indica）的研究發(fā)現(xiàn)，33 個(gè)野生蛇莓種群也具有很高的遺傳多樣性，遺傳距離與地理距離不存在顯著相關(guān)關(guān)系（r=0.052，P=0.150），這與蛇莓的無性繁殖以及對(duì)環(huán)境壓力的選擇有關(guān)。蕨麻遺傳多樣性高的原因可能為蕨麻是兼性克隆植物，種群內(nèi)可以通過風(fēng)媒、蟲媒在長距離范圍內(nèi)進(jìn)行花粉傳播，從而增加居群內(nèi)的基因交流；蕨麻在高寒地區(qū)生長，周邊環(huán)境一般為山脈，阻礙了花粉和種子的傳播，且克隆生長受到限制，從而將居群之間分隔開來，形成生境隔離，各居群為適應(yīng)不同環(huán)境而形成不同的進(jìn)化；同時(shí)，采樣時(shí)各居群的地理環(huán)境不同，由于山脈、河流隔斷，大多數(shù)樣本不是直線距離采集，最終形成蕨麻的高遺傳多樣性。

蕨麻遺傳變異主要來源于居群內(nèi)（居群變異方差和占比分別為12.745 和84%），居群間變異較低（居群變異方差和占比分別為2.477 和16%），這與杜夏瑾等[37］的研究結(jié)論一致。金燕等[38］認(rèn)為，一個(gè)物種的分布區(qū)域大小可以直接影響其遺傳多樣性的高低，兩者成正比，分布區(qū)域廣的物種會(huì)由于寬闊的生境之間的差異而進(jìn)化，從而提高遺傳變異。蕨麻本身為克隆植物，單個(gè)居群占地面積也較廣，在一個(gè)區(qū)域內(nèi)，覆蓋率可達(dá)100%，在自然生長的居群中，充分發(fā)揮繁殖優(yōu)勢(shì)，分布范圍廣，但由于是在高寒地區(qū)，生境差異大，為適應(yīng)環(huán)境而變異，這也是自然選擇的結(jié)果。青藏高原山脈平均海拔4000~6000 m，距離地面高度平均為1000~1500 m（唐古拉山脈高6800 m，距離地面高度1800 m，昆侖山脈高5500~6000 m，距離地面高度1200~1700 m，祁連山脈高5800 m，距離地面1000~2000 m），各地區(qū)環(huán)境、氣候差異大。本研究發(fā)現(xiàn)，各居群間、居群內(nèi)均有大小不同的山脈作為阻斷，且采樣時(shí)由于地勢(shì)的不一致，所采集的樣品并不能按照直線進(jìn)行采集，從而使得群體的遺傳多樣性較高，居群內(nèi)遺傳背景變大。

采樣區(qū)域內(nèi)從南到北分布的大型山脈有喜馬拉雅山脈、橫斷山脈、昆侖山脈和祁連山脈，唐古拉山脈和巴顏喀拉山脈為小型山脈。南木林縣居群與其他5 個(gè)居群遺傳距離最遠(yuǎn)，該居群位于拉薩以西，周邊環(huán)繞著橫斷山脈、唐古拉山脈、巴顏喀拉山脈等數(shù)條大型山脈，山脈阻隔最顯著，地理距離最遠(yuǎn)，遺傳距離也最遠(yuǎn)；八宿縣位于昌都以南，周邊環(huán)繞橫斷山脈，使得該區(qū)蕨麻與其他地區(qū)具有天然的生殖隔離屏障，地形最為復(fù)雜，遺傳多樣性豐富，該區(qū)和其他地區(qū)地理隔離也很明顯；祁連縣與上述兩個(gè)地區(qū)地理距離較遠(yuǎn)，且中間橫亙昆侖山脈和祁連山脈，遺傳距離較遠(yuǎn)，但由于其采樣時(shí)分布較均勻，按照直線進(jìn)行采樣，其遺傳多樣性較為豐富，遺傳距離和地理距離呈顯著相關(guān)；若爾蓋縣位于昆侖山脈和橫斷山脈之間，山脈阻隔，遺傳距離和地理距離具有一定相關(guān)性；碌曲縣居群和河南縣居群位于昆侖山脈和祁連山脈中間，沒有山脈阻隔，遺傳距離最近，遺傳一致度最高（遺傳相似系數(shù)=0.986，遺傳距離=0.0141），且聚類為一簇。

3.2 遺傳采樣策略

克隆植物的遺傳距離對(duì)植物種質(zhì)資源收集具有很重要的作用，沈曉婷[33］對(duì)克隆植物毛竹（Phyllostachys edulis）的研究發(fā)現(xiàn)，毛竹的單個(gè)克隆最大延伸距離可達(dá)1448 m，這為毛竹的資源整合提供了一定的理論基礎(chǔ)。蕨麻是典型的克隆植物，在野外長年的生長增大了繁殖面積，一定程度上也影響著遺傳距離的大小。6 個(gè)蕨麻居群不同距離分布的個(gè)體聚類結(jié)果表明，每個(gè)地區(qū)1~30 號(hào)樣品間地理距離較短，均在5 km 以內(nèi)，31~36 號(hào)樣品間，地理距離較遠(yuǎn)，均在5 km 以上。其中，祁連縣居群蕨麻個(gè)體間遺傳距離與地理距離相關(guān)性最好，可以明顯看出，同一地區(qū)蕨麻居群內(nèi)，蕨麻個(gè)體間遺傳距離隨地理距離的增加，呈增大的態(tài)勢(shì)，其中1~30 號(hào)樣品的遺傳距離較近，31~35 號(hào)樣品間遺傳距離較遠(yuǎn)，根據(jù)地理距離分布，可劃分為5 km 以內(nèi)的樣品個(gè)體和5 km 以上的樣品個(gè)體。其他地區(qū)遺傳距離與地理距離的相關(guān)性雖然不是很大，但根據(jù)居群聚類分析可以得出，5 km 是一個(gè)分界點(diǎn)，即5 km 可以作為一個(gè)克隆的延長距離。

由于在實(shí)際采樣過程中，地理情況和采樣點(diǎn)的分布情況均較為復(fù)雜。祁連縣的蕨麻個(gè)體間遺傳距離與地理距離表現(xiàn)出較好的線性關(guān)系（R2=0.1983，P=0.01<0.05），其遺傳距離和地理距離呈正相關(guān)，且遺傳多樣性最高（H=0.2797，I=0.4287）。而其他居群蕨麻個(gè)體間遺傳距離并不是按照地理距離線性排布，造成該情況的發(fā)生可能有以下幾點(diǎn)原因：首先，不能排除蕨麻生長過程中出現(xiàn)種子傳播的可能性；其次，蕨麻是無性繁殖為主，有性繁殖為輔，這會(huì)導(dǎo)致野生蕨麻具有基因交流的過程；最后，蕨麻采樣過程中，同一居群內(nèi)雖然有地理海拔差距，但并沒有大型的山脈等明顯的地理隔離，使居群內(nèi)部沒有產(chǎn)生生殖隔離，所以同一地區(qū)的蕨麻遺傳距離較近，從而降低了與地理距離的相關(guān)性。

根據(jù)居群聚類結(jié)果可知，蕨麻聚類一般以地理距離和地理阻隔結(jié)合進(jìn)行聚類，碌曲縣和河南縣兩個(gè)居群地理位置近，聚為一支（遺傳距離=0.0141，遺傳相似系數(shù)=0.986），可能是因?yàn)樵摰貏?shì)較為平坦，利于蟲媒、風(fēng)媒的傳播，增加兩個(gè)居群之間的基因流[39］，從而使得兩個(gè)居群之間變異少，聚為一支。碌曲縣與若爾蓋縣地理位置也近，但由于有大巴山脈（海拔為2000~2500 m）作為阻隔，阻礙了有性繁育花粉的傳播，減少了基因流，使得其沒有聚在一起（遺傳距離=0.0256，遺傳相似系數(shù)=0.9747）。南木林縣、祁連縣、八宿縣3 個(gè)居群之間的聚類也較遠(yuǎn)，其間不僅地理距離遠(yuǎn)，更有大型山脈作為阻隔，阻斷了居群之間的交流。由此可看出，居群可以以大型山脈進(jìn)行區(qū)分。

4 結(jié)論

結(jié)合采樣點(diǎn)地理分布、遺傳多樣性和聚類分析可知：1）當(dāng)采樣地勢(shì)較為平坦時(shí)，可以有效增加居群間的基因交流，在采樣時(shí)，需要增大居群之間的距離以避免采集為同一親本。碌曲縣和河南縣兩個(gè)地區(qū)的直線距離為100 km，兩個(gè)居群遺傳距離相似度最高，因此在沒有大型山脈隔離的情況下，蕨麻有性繁殖即花粉傳播距離可能達(dá)到100 km，花粉在兩地之間進(jìn)行長距離傳播，促使居群之間基因交流，從而使得兩地的遺傳關(guān)系近，該距離可以作為在沒有大型山脈隔離條件下，蕨麻居群間采樣的最小距離；2）當(dāng)有山脈作為采樣隔斷時(shí)，居群之間的地理距離即使比較近，但由于山脈的阻斷，居群之間的基因流降低，生境的隔離也成為居群之間變異較大的重要原因，因此，山脈隔斷可以有效避免采集樣本來自同一居群，居群間采樣應(yīng)該以翻越青藏高原大型山脈后采集樣品為宜；3）根據(jù)居群內(nèi)聚類分析可以得出，多個(gè)居群中均顯示，30 號(hào)樣品之前大多聚在一起，地理距離在5 km 之內(nèi)，而在5 km之外的樣品則單獨(dú)聚在一起，說明在一定范圍內(nèi)（5 km 左右）的分株都來源于同一親本。因此采樣時(shí)，一個(gè)居群內(nèi)個(gè)體間的距離至少達(dá)到5 km 。

根據(jù)研究結(jié)果，對(duì)6 個(gè)野生蕨麻居群，提出針對(duì)性保護(hù)建議：除了主要采取就地保護(hù)策略保障其原始居群的遺傳多樣性外，還可以適當(dāng)對(duì)不同地區(qū)蕨麻種質(zhì)資源進(jìn)行遷地保護(hù)，維持其基因流的穩(wěn)定性。蕨麻在西部地區(qū)生長好，且在海拔1700 m 以上地區(qū)塊根才膨大，西部地區(qū)大部分位于我國第一階梯，海拔較高，最合適蕨麻生長，且蕨麻繁殖擴(kuò)增的模式也能為西部地區(qū)貧瘠土地的修復(fù)帶來良好的生態(tài)效益。同時(shí)，蕨麻在農(nóng)牧民日常生活中既可以作為食品食用，也可以作為商品進(jìn)行售賣以增加收入，因此在西部地區(qū)，蕨麻在秋季時(shí)會(huì)受到大面積的采挖，采挖過后的蕨麻來年生長勢(shì)急劇下降，從而影響其生態(tài)修復(fù)能力。因此，提出以下建議，比如青海省內(nèi)蕨麻居群遺傳多樣性高的祁連縣居群、甘肅省的碌曲縣居群以及西藏自治區(qū)的八宿縣居群，可以將蕨麻現(xiàn)有居群建立自然保護(hù)區(qū)，適當(dāng)開展遷地保護(hù)，規(guī)劃采挖區(qū)域，以減少過度采挖對(duì)蕨麻多樣性和生態(tài)的破壞。遺傳多樣性較低的居群，比如河南縣居群、若爾蓋居群，可以對(duì)其進(jìn)行種質(zhì)篩選，培育出純品種，將其作為一個(gè)品種來進(jìn)行研究，發(fā)掘其藥用、食用以及生態(tài)價(jià)值。同時(shí)，研究中也發(fā)現(xiàn)同個(gè)省份內(nèi)不同居群之間遺傳多樣性有差異，本試驗(yàn)在同一省份內(nèi)采樣居群數(shù)量較少，只能部分概括同一區(qū)域內(nèi)的遺傳多樣性結(jié)果，在后續(xù)研究中，可以對(duì)某一區(qū)域通過不同種群野生資源進(jìn)行遺傳資源研究，通過分子生物學(xué)方法探究其遺傳多樣性，探討其不同海拔下不同自然居群的遺傳多樣性，從不同生境下居群的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子變異分析，再確定其保護(hù)策略。